親環(huán)素A對冠狀病毒復(fù)制的影響及其抑制劑的抗病毒作用研究進(jìn)展

田璐，劉文軍，孫蕾

·綜 述·

親環(huán)素A對冠狀病毒復(fù)制的影響及其抑制劑的抗病毒作用研究進(jìn)展

田璐1,2，劉文軍1,2，孫蕾1,2

1 中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

親環(huán)素A (CypA) 是一種在生物界中廣泛分布，并具有高度保守性的蛋白質(zhì)，具有肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶活性，是免疫抑制藥物環(huán)孢素A (CsA) 的細(xì)胞內(nèi)受體。冠狀病毒是具有包膜的、單股正鏈RNA病毒，目前已知有7種冠狀病毒可以感染人類，其中包括致命的SARS-CoV、MERS-CoV以及新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2)。已有研究表明，CypA在SARS-CoV、CoV-229E、CoV-NL63以及FCoV等多種冠狀病毒的復(fù)制中是必不可少的，而且CypA的抑制劑CsA及其衍生物 (ALV、NIM811等) 對多種冠狀病毒具有明顯的抑制作用，暗示CypA是潛在的抗冠狀病毒藥物靶點(diǎn)，CsA這種老藥有可能是一種抗冠狀病毒的藥物。2019年底，新型冠狀病毒突然肆虐中國，嚴(yán)重威脅人民生命健康并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，文中介紹了CypA對冠狀病毒復(fù)制的影響，并闡述了其抑制劑的抗病毒作用，旨在為抗新型冠狀病毒藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)及思路。

親環(huán)素A，環(huán)孢素A，冠狀病毒，新型冠狀病毒

2019年12月初，武漢華南海鮮市場開始集中出現(xiàn)新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2) 所致肺炎 (WHO定名：COVID-19) 疫情，后來迅速蔓延至全國。截至2020年2月20日，我國確診病例已累計(jì)7萬余例，死亡2 000余人。2020年1月30日，世界衛(wèi)生組織宣布該疫情構(gòu)成國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。疫情發(fā)生后，全國多省市陸續(xù)啟動(dòng)重大突發(fā)公共衛(wèi)生事件Ⅰ級(jí)響應(yīng)，多省市大中小學(xué)幼兒園和單位延期開學(xué)、開工，旅游業(yè)暫停，部分交通設(shè)施及各類娛樂場所暫時(shí)關(guān)閉。新型冠狀病毒肺炎的暴發(fā)嚴(yán)重威脅了人民的生命健康并且為我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了重創(chuàng)。嚴(yán)峻形勢下，我們急需探究針對此病毒的新型藥物以及有效的防控措施。本文主要介紹了親環(huán)素A對冠狀病毒復(fù)制的影響及其抑制劑的抗病毒效果，旨在為抗新型冠狀病毒藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)及思路。

1 親環(huán)素A

親環(huán)素A (Cyclophilin A，CypA) 屬于Cyclophilin (Cyp) 家族成員，該家族成員具有順反異構(gòu)酶活性，在生物界中廣泛分布，并具有高度保守性。CypA最早于1984年由Handchumcher等從牛胸腺中提取出來并進(jìn)行提純[1]，并發(fā)現(xiàn)其作為胞內(nèi)蛋白對具有免疫抑制功能的環(huán)孢菌素A (Cyclosporin A，CsA) 具有極高的親和性。同年，F(xiàn)ischer等[2]發(fā)現(xiàn)了具有肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶 (PPIase) 活性的蛋白，進(jìn)一步研究表明該P(yáng)PIase活性蛋白即為CypA蛋白，隨后親環(huán)素家族的其他成員相繼被發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了16種結(jié)構(gòu)不同的Cyps家族成員 (CypA、CypB、CypC、CypD、CypE、Cyp40、CypNK等)，其中，含量最多的是CypA，其含量約占細(xì)胞質(zhì)蛋白總含量的0.1%–0.6%[3]。它們都具有由約109個(gè)氨基酸構(gòu)成的親環(huán)素樣結(jié)構(gòu)域 (Cyclophilin-like domain，CLD)[4-5]，在哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲、細(xì)菌、真菌甚至病毒中均有存在。CsA的免疫抑制作用是通過CsA、CypA和鈣調(diào)磷酸酶形成三元復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)的。CsA在進(jìn)入體內(nèi)后先與CypA結(jié)合，CsA-CypA復(fù)合物結(jié)合并抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，使其底物激活的T細(xì)胞核因子 (Nudear factor of activated T cells，NF-AT) 等不能被去磷酸化，導(dǎo)致其不能從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，從而在轉(zhuǎn)錄水平阻斷淋巴細(xì)胞活化，使T細(xì)胞活化必需的一些細(xì)胞因子表達(dá)受阻[6]。大量研究發(fā)現(xiàn)，CypA除了作為免疫抑制劑CsA的受體蛋白以外，還參與細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒復(fù)制等多種生命過程[7-9]。

CypA能夠調(diào)控多種病毒的復(fù)制。CypA可與丙肝病毒 (HCV) 的NS2蛋白[10]、NS5A蛋白[11]和NS5B蛋白產(chǎn)生相互作用，并被證明是HCV復(fù)制所必需的宿主因子[12]?，F(xiàn)有的抗HCV藥物Alisporivir即是阻礙了CypA和NS5A的結(jié)合，從而影響了HCV的復(fù)制。無免疫抑制特性的Cyps抑制劑如NIM811、Debio-025和SCY-635已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)中[13]，有望成為今后有效的治療藥物。CypA也被發(fā)現(xiàn)可與人類免疫缺陷病毒 (HIV-1)的Gag蛋白相互作用[14]，CypA-Gag相互作用對于人類細(xì)胞中HIV-1的復(fù)制至關(guān)重要，CsA通過阻止CypA-Gag相互作用抑制HIV-1感染[15]，在Gag的CypA結(jié)合區(qū)中引入突變也可減少HIV-1的感染。我們實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，CypA也可與甲型流感病毒 (IAV) 的M1蛋白相互作用，并整合到流感病毒粒子中[16]，M1蛋白在流感病毒的復(fù)制周期中起到多種功能，包括病毒的脫衣殼、轉(zhuǎn)錄、組裝和釋放[17]。CypA主要通過加速M(fèi)1蛋白的降解從而在翻譯后水平上影響流感病毒的復(fù)制[18]。同時(shí)，CypA還能夠通過靶向RIG-I和MAVS的泛素化來調(diào)控RIG-Ⅰ介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，從而影響IAV等病毒的復(fù)制[19]。此外，CypA還與多種其他病毒的復(fù)制有關(guān)。例如：CypA的穩(wěn)定性在VV感染的細(xì)胞中顯著增加，CypA會(huì)重新定位到細(xì)胞核的外周區(qū)域，與病毒產(chǎn)生共定位，然后摻入病毒顆粒中并特異性地定位于核心中[20]；CypA與VSV的核衣殼蛋白相互作用，并且與VV類似，可以摻入VSV病毒顆粒中，它可能充當(dāng)核衣殼蛋白的分子伴侶，包裹基因組RNA以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄的功能模板[21]；輪狀病毒 (RV) 感染是全世界5歲以下嬰幼兒急性脫水性腹瀉的主要原因。RV感染可引發(fā)CypA蛋白的暫時(shí)增加。在RV感染的細(xì)胞中，CypA被募集到RV的病毒體中，并且與RV結(jié)構(gòu)蛋白VP2相互作用以抑制RV感染細(xì)胞并通過其PPIase活性抑制RV復(fù)制[22]。

2 冠狀病毒簡介

值得關(guān)注的是CypA在多種冠狀病毒的復(fù)制中必不可少。冠狀病毒是一類具有包膜的單股正鏈RNA病毒，可引起多種哺乳動(dòng)物 (人類、蝙蝠、貓和小鼠等) 以及鳥類不同程度的呼吸道、胃腸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[23]。冠狀病毒主要分為4種屬：α屬、β屬、γ屬和δ屬[24]。已知可感染人類的冠狀病毒有7種，分別是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV以及SARS-CoV-2。在冠狀病毒感染過程中起作用的蛋白主要有6種，分別為核衣殼蛋白 (N)、刺突糖蛋白 (S)、小包膜糖蛋白 (E)、膜糖蛋白 (M)、多聚酶以及3CL水解酶[25]，其中S、E、M和N蛋白為冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。在冠狀病毒中，三分之二的基因組位于基因組5′區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域包含開放閱讀框1a (ORF1a) 和開放閱讀框1b (ORF1b)[26]，它們編碼RNA依賴性RNA聚合酶 (RdRp)、解旋酶和其他非結(jié)構(gòu)蛋白 (Nsp)。在基因組的其余三分之一中，結(jié)構(gòu)蛋白的基因以固定順序編碼：S-E-M-N，這些基因之間存在數(shù)量可變的ORF編碼輔助蛋白[27]。

HCoV-229E、HCoV-OC43于20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)，主要造成普通感冒，一般不會(huì)引起嚴(yán)重病癥。SARS-CoV是一種高度侵襲性的人類病原，可引起嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)窘迫綜合征，通常具有致命的后果[25]。該病毒在越過物種壁壘 (最有可能從蝙蝠到果子貍再到人類) 后，于2003年開始流行，是第一種已知的有可能導(dǎo)致人類高發(fā)病率和高死亡率的疾病發(fā)生的冠狀病毒[28]，造成8 098例感染及774例死亡[29]。由于沒有高效的治療方法，該流行病最終可以通過有效的傳統(tǒng)公共衛(wèi)生措施進(jìn)行隔離得以控制。CoV-NL63、HCoV-HKU1分別于2004年[30]和2005年[31]被發(fā)現(xiàn)，易感染兒童，可能會(huì)引起嚴(yán)重的下呼吸道感染，如支氣管炎和肺炎。2012年，中東地區(qū)出現(xiàn)了一種新的人類冠狀病毒MERS-CoV，與SARS-CoV同樣可能導(dǎo)致腎衰竭和急性肺炎，但死亡率更高，約為50%[24]。2019年12月初，武漢華南海鮮市場開始集中出現(xiàn)不明原因的肺炎疫情，該流行病的病原體被確認(rèn)為SARS-CoV-2，屬于β屬冠狀病毒，將其全基因組核苷酸序列與β屬的SARS-CoV和MERS-CoV進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)相似性分別約為70%和40%。值得注意的是，SARS-CoV-2與SARS-CoV都是主要通過S-蛋白與人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2) 互作來感染人的呼吸道上皮細(xì)胞[32]。

3 親環(huán)素A對冠狀病毒復(fù)制的影響

病毒的復(fù)制大多需要宿主因子的參與，至今已有大量文章報(bào)道CypA在多種冠狀病毒的復(fù)制中起著重要的作用。有關(guān)CypA可能參與冠狀病毒復(fù)制的提示來自于SARS-CoV相關(guān)研究。研究人員通過表面等離子體共振生物傳感技術(shù)發(fā)現(xiàn)CypA與SARS-CoV的N蛋白具有非常高的親和力[33]，并通過定點(diǎn)突變和親和力的測定確定了它們的結(jié)合位點(diǎn)，推測CypA可能作為N蛋白的分子伴侶在復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。CD147是一種Ⅰ型跨膜蛋白，已被確定為細(xì)胞外CypA的主要信號(hào)受體[34]。盡管SARS-CoV蛋白沒有直接與CD147分子結(jié)合，但是通過表面等離振子共振分析發(fā)現(xiàn)SARS-CoV的N蛋白能夠與和CD147相互作用的CypA結(jié)合，并且CD147拮抗劑對SARS-CoV具有抑制作用。這些結(jié)果表明CD147分子在促進(jìn)SARS-CoV入侵宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能性作用[35]，CsA可能會(huì)通過抑制CypA的功能進(jìn)而抑制SARS-CoV的復(fù)制[36]。另外，SARS-CoV Nsp1是一種體內(nèi)毒力因子，其作用與免疫應(yīng)答的早期階段有關(guān)，包括對干擾素信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗活性和對宿主蛋白質(zhì)合成的抑制作用[37-38]，而CypA可以與Nsp1蛋白的氨基 (N) 末端區(qū)域互相作用并可能充當(dāng)分子伴侶[39]。這些研究為探究SARS-CoV以及其他冠狀病毒感染途徑提供新的提示，并進(jìn)一步為抗SARS藥物篩選提供一種可行的方法。

研究人員構(gòu)建了分別敲低CypA和CypB的CaCo-2細(xì)胞系，通過噬斑實(shí)驗(yàn)觀察到CaCo-2CypA細(xì)胞完全不支持CoV-NL63生長，表明CoV-NL63的復(fù)制過程功能性依賴CypA，而不是CypB[40]。還有研究表明CypA在HCoV-229E的復(fù)制過程中也擔(dān)任著重要角色[29]。CypA不僅對于感染人的冠狀病毒發(fā)揮著舉足輕重的作用，它對于動(dòng)物冠狀病毒的復(fù)制也有一定作用。貓科動(dòng)物冠狀病毒 (FCoV) 的復(fù)制也需要Cyps的參與，過表達(dá)CypA與CypB能夠明顯促進(jìn)FCoV的復(fù)制及其蛋白的表達(dá)，F(xiàn)CoV在CypA和CypB敲除細(xì)胞中的病毒載量下降了超過95% (與其在野生型細(xì)胞中相比)[41]。

4 親環(huán)素A抑制劑的抗冠狀病毒作用研究

一般來說，RNA病毒基因組通常以低保真度復(fù)制并經(jīng)歷快速的進(jìn)化變異，盡管冠狀病毒編碼一個(gè)校對的核糖核酸外切酶 (Nsp14 ExoN)，有校對活動(dòng)，可增強(qiáng)其大型基因組的復(fù)制穩(wěn)定性，但該域內(nèi)的突變亦會(huì)顯著提高其突變率[42]。病毒復(fù)制依賴于多種宿主因子，這些宿主因子是潛在的抗病毒靶點(diǎn)。迄今為止，既沒有針對引起普通感冒的冠狀病毒的藥物，也沒有針對高致病性冠狀病毒的有效治療藥物?？共《舅幬锏拈_發(fā)集中在病毒蛋白酶和解旋酶抑制劑的開發(fā)上，且針對病毒靶標(biāo)的藥物通常傾向于快速地產(chǎn)生耐藥性。因此，將病毒復(fù)制所需的宿主因子作為靶點(diǎn)，可能會(huì)減少耐藥性的產(chǎn)生，尋找這些靶點(diǎn)和抑制劑是當(dāng)務(wù)之急。

4.1 CsA對冠狀病毒復(fù)制的影響

CsA是一種眾所周知的廣泛應(yīng)用于臨床的免疫抑制藥物，它與Cyps結(jié)合以抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 (鈣調(diào)鈣蛋白激活的絲氨酸/蘇氨酸特異性磷酸酶)。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的抑制作用阻止了NF-AT從胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)移到核中，從而阻止了編碼細(xì)胞因子 (如白介素2) 的基因的轉(zhuǎn)錄[43]。上文中已經(jīng)闡述了CypA在多種冠狀病毒的復(fù)制過程中擔(dān)任著舉足輕重的角色，抑制其PPIase活性不僅會(huì)阻止蛋白的正確折疊，而且還會(huì)抑制許多病毒復(fù)制過程中必不可少的病毒蛋白。目前已有大量研究表明CsA是某些人類和動(dòng)物冠狀病毒的有效抑制劑[36,39,41]，一些關(guān)于CsA抑制機(jī)理的研究表明這與Cyps參與病毒復(fù)制有關(guān)。

研究人員用CsA處理感染了SARS-CoV的 Vero-E6細(xì)胞和293/ACE2細(xì)胞 (可穩(wěn)定表達(dá)SARS-CoV的受體ACE2) 以及感染了HCoV-229E- GFP的Huh7細(xì)胞和感染了MHV-GFP的17CL1細(xì)胞，結(jié)果表明CsA可以抑制SARS-CoV、HCoV-229E和MHV的復(fù)制，其中對于HCoV-229E的抑制效果最好[36]。SARS-CoV Nsp1的過度表達(dá)或SARS-CoV感染會(huì)大大增強(qiáng)NF-AT通路的信號(hào)傳導(dǎo)，并增強(qiáng)對IL2的誘導(dǎo)，表明NF-AT信號(hào)通路對免疫細(xì)胞的活化有影響，從而解釋了嚴(yán)重SARS病例中觀察到的細(xì)胞因子失調(diào)和免疫依賴性發(fā)病機(jī)制。有研究表明，CsA與細(xì)胞內(nèi)Cyps結(jié)合并阻斷NF-AT途徑，Cyps-CsA復(fù)合物也可能會(huì)抑制病毒復(fù)制所需的Cyps的其他功能[44]。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)CsA抑制了其他CoV成員的復(fù)制。MERS-CoV感染細(xì)胞后，病毒RNA合成迅速增加，在感染后的13–24 h開始出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞病理學(xué)改變，加入CsA后，細(xì)胞病理現(xiàn)象有明顯改善[45]。CsA可以明顯地抑制HCoV-NL63的復(fù)制以及病毒蛋白的合成[40]，豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV)、禽傳染性支氣管炎病毒 (IBV) 及FCoV的復(fù)制也可被CsA明顯抑制[39,41]。

4.2 CsA衍生物對冠狀病毒復(fù)制的影響

對于具有較低致病性的病毒感染的治療，我們希望利用CsA能夠抑制PPIase活性這一特點(diǎn)，并且希望它不抑制免疫活性，所以目前已經(jīng)開發(fā)出很多滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的CsA衍生物，包括ALV[46]、NIM811、復(fù)合物3[47]等。研究人員通過用ALV、NIM811以及復(fù)合物3處理轉(zhuǎn)染了HCoV-229E-GFP的人類肝癌細(xì)胞 (利于HCoV-229E的穩(wěn)定生長)，發(fā)現(xiàn)這3種非免疫抑制性的CsA衍生物可以明顯地抑制HCoV-229E的復(fù)制。同時(shí)，ALV也可明顯地抑制HCoV-NL63的復(fù)制[40]。另外一種新型環(huán)孢霉素衍生物STG-175，不具有免疫抑制作用，在已知同類別化合物中是一個(gè)活性很高的Cyps抑制劑，也有可能是一種潛在的抗冠狀病毒藥物[48]。

5 展望

嚴(yán)峻形勢下，我們急需探究針對新型冠狀病毒的新型藥物以及有效的防控措施?；谝延醒芯拷Y(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)CypA與冠狀病毒等多種病毒的關(guān)鍵蛋白互相作用，并且參與了多種病毒的復(fù)制過程。盡管尚不能確定CsA等CypA抑制劑抗冠狀病毒的確切機(jī)制，但該類藥物可能通過干擾病毒蛋白與多個(gè)蛋白家族的一個(gè)或多個(gè)成員之間的功能相互作用從而抑制冠狀病毒的復(fù)制。而且，CsA是一種廣泛應(yīng)用于臨床的老藥，安全、有效、質(zhì)量可控，如果能用于治療冠狀病毒引起的疾病，將大大縮短其進(jìn)入臨床的時(shí)間?？傊?，CypA在多種冠狀病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，其抑制劑將是一類非常有潛力的廣譜抗冠狀病毒的候選藥物。CypA及其抑制劑在新型冠狀病毒復(fù)制過程中的作用還有待進(jìn)一步研究。

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Role of cyclophilin A during coronavirus replication and the antiviral activities of its inhibitors

Lu Tian1,2, Wenjun Liu1,2, and Lei Sun1,2

1,,,100101,2,100049,

Cyclophilin A (CypA) is a widely distributed and highly conserved protein in organisms. It has peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity and is a receptor for cyclosporin A (CsA). Coronaviruses are enveloped, single-stranded, positive-sense RNA viruses. Seven types of coronaviruses are currently known to infect humans, among which SARS-CoV, MERS-CoV, and SARS-CoV-2 are fatal for humans. It is well established that CypA is essential for the replication of various coronaviruses such as SARS-CoV, CoV-229E, CoV-NL63, and FCoV. Additionally, CsA and its derivatives (ALV, NIM811, etc.) have obvious inhibitory effects on a variety of coronaviruses. These results suggest that CypA is a potential antiviral target and the existing drug CsA might be used as an anti-coronavirus drug. At the end of 2019, SARS-CoV-2 raged in China, which seriously theatern human health and causes huge economic lases. In view of this, we describe the effects of CypA on the replication of coronaviruses and the antiviral activities of its inhibitors, which will provide the scientific basis and ideas for the development of antiviral drugs for SARS-CoV-2.

cyclophilin A, cyclosporin A, coronaviruses, SARS-CoV-2

February 1, 2020;

February 20, 2020

Supported by:NationalNatural Science Foundation of China (Nos. 31672531, 31972657).

Lei Sun. Tel: 86-10-64807503; E-mail: sunlei362@im.ac.cn

國家自然科學(xué)基金(Nos. 31672531, 31972657) 資助。

10.13345/j.cjb.200049

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(本文責(zé)編 陳宏宇)