利用CRISPR/Cas9 技術(shù)靶向編輯青花菜BoZDS

黃文莉 李香香 周炆婷羅莎姚維嘉馬杰，2 張芬 沈鈺森顧宏輝王建升孫勃

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，畢節(jié) 551700；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，杭州 310021）

青花菜（Brassica oleraceavar.italica），又名西蘭花、綠菜花等，原產(chǎn)于意大利，屬十字花科蕓薹屬甘藍種變種，為一二年生蔬菜作物，主要食用部位為球狀的花蕾和脆嫩的花莖。青花菜富含類胡蘿卜素、維生素及芥子油苷［1-2］，具有較高的營養(yǎng)價值和保健作用，深受消費者喜愛［3］。

ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ζ-carotene desaturase, ZDS）是類胡蘿卜素合成的限速酶，其催化ζ-胡蘿卜素生成番茄紅素［4］。兩分子牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP），經(jīng)過八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase, PSY）、八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturases, PDS）、ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶（15-cis-ζ-carotene isomerase, ZISO）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ζ-carotene desaturase, ZDS）的催化作用形成順式番茄紅素，順式番茄紅素在類胡蘿卜素異構(gòu)酶（ZISO、carotenoid isomerase, CRTISO）的催化下形成紅色的反式番茄紅素［5］。ZDS基因的功能在園藝作物中已有很多研究，西瓜果肉中ZDS基因的表達量與番茄紅素含量呈正相關(guān)［6］，在桃果肉中，ZDS基因正向調(diào)控類胡蘿卜素生物合成及果皮呈色［7］，在番茄中，當ZDS受到抑制，成熟果實的特征性紅色類胡蘿卜素的積累在整個成熟過程中受到抑制［8］。ZDS基因在擬南芥和芹菜中的過量表達可以導(dǎo)致葉黃素和β-胡蘿卜素的積累增加，并上調(diào)類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因的表達水平［9］，當芥藍BoaZDS在產(chǎn)生β-胡蘿卜素的大腸桿菌中表達時，可增加大腸桿菌中β-胡蘿卜素的積累［10］。當ZDS基因功能缺失，突變體會出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。在擬南芥中，ZDS突變體由于葉綠素和類胡蘿卜素的嚴重缺乏而呈現(xiàn)白化幼苗表型［11］，在同為蕓薹屬蔬菜的芥藍中，ZDS突變體表現(xiàn)出明顯的白化表型［12］。因此，本試驗選擇ZDS基因作為目標基因?qū)η嗷ú诉M行基因編輯，突變體的表型可作為基因編輯成功與否的依據(jù)。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是一種RNA 引導(dǎo)的DNA 內(nèi)切酶系統(tǒng)，由Cas9 核酸酶和可定制的單導(dǎo)向RNA（sgRNA）組成。sgRNA 將Cas9 核酸內(nèi)切酶導(dǎo)向互補的靶DNA［13］。該系統(tǒng)大大簡化了基因編輯過程，拓寬了目標位點的選擇范圍。目前，作為改善植物性狀和基因功能研究的有力工具，CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在擬南芥［14-15］、水稻［16］、煙草［17］、馬鈴薯［18］等多種植物中已有廣泛地研究，在番茄［19-20］和黃瓜［21-22］等蔬菜作物中也有較多報道。近幾年，甘藍［23］、結(jié)球甘藍［24］、芥藍［12］等蕓薹屬蔬菜已陸續(xù)建立CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)，而在青花菜中僅有原生質(zhì)體瞬時體系的報道［25］。由于青花菜的再生體系轉(zhuǎn)化效率和基因編輯載體效率較低，較難實現(xiàn)CRISPR/Cas9 基因編輯［26］。為了加快青花菜基因功能研究和靶向材料創(chuàng)制，建立青花菜高效的CRISPR/Cas9 基因編輯體系顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021年8月至2022年5月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝綜合實驗室進行，供試材料為青花菜多代自交系‘ZN09’，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所花菜課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA 的 設(shè) 計 與CRISPR/Cas9 載 體 的 構(gòu)建 利用CRISPR-P 在線軟件（http://crispr.hzau.edu.cn）在青花菜BoZDS基因序列中尋找目標靶位點，通過軟件評分和blast 搜索確定靶位點。將退火后的靶位點引物與AtU6-26-sgRNA-SK 質(zhì)粒連接，得到sgRNA cassette 質(zhì)粒，然后將酶切后pCAMBIA1300-pYAO : Cas9 質(zhì)粒與sgRNA cassette 進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取鑒定正確的單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，相關(guān)引物序列見表1。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青花菜遺傳轉(zhuǎn)化 青花菜遺傳轉(zhuǎn)化方法參照課題組已有的方法［12］，消毒后的種子在1/2MS 播種培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2 d，然后光下培養(yǎng)3-4 d，切取子葉預(yù)培養(yǎng)2 d 后，于農(nóng)桿菌（GV3101）菌液浸染1-2 min，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中生長2-3 d，然后轉(zhuǎn)入延遲篩選培養(yǎng)基，7 d 后再轉(zhuǎn)入抗性篩選培養(yǎng)基。每15 d 繼代1 次，培養(yǎng)基同抗性篩選培養(yǎng)基。對不定芽進行拍照取樣與分析鑒定。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測與表型鑒定 采用CTAB 法提取抗性植株的基因組DNA，以其為模板，根據(jù)載體中所含潮霉素和Cas9 蛋白序列分別設(shè)計特異性引物Hyg-F/R 和Cas9-F/R（表1）進行PCR 擴增，電泳檢測CRISPR/Cas9 載體是否成功轉(zhuǎn)入青花菜植株中，計算轉(zhuǎn)化效率。在靶位點前后設(shè)計特異性引物，以每個抗性植株的基因組DNA 為模板，使用引物BoZDS-CRISPR test-F/R（表1）進行PCR 擴增，切膠回收擴增片段，進行連接轉(zhuǎn)化，挑單克隆進行菌液PCR 鑒定及測序，再使用SnapGene 和DNAMAN軟件進行序列比對分析，根據(jù)突變情況計算突變率。對每個突變體的表型進行觀察和拍照，統(tǒng)計白化株的數(shù)量，測定色差值。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 sgRNA設(shè)計和CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

根據(jù)軟件分析結(jié)果，在BoZDS基因的第1 個外顯子上選取了兩個靶位點，靶位點序列分別為CCAGCTACTGCGTTCCTCTCCTC 和CCTCGGAGGTTTCATGTTAGGTC（表2），根據(jù)靶位點位置順序分別命名為1 號和2 號靶位點，下劃線為前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列（圖1），之后經(jīng)過引物退火、酶切和T4 酶連接成功構(gòu)建了1 號和2 號靶位點的重組載體。

表2 靶位點GC 含量和得分情況Table 2 GC content and scores of target sites

圖1 靶位點選擇（A）與載體構(gòu)建（B）Fig. 1 Selection of target sites（A）and construction of vectors（B）

2.2 青花菜穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化效率統(tǒng)計

開展青花菜穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化（圖2），每個靶位點接種轉(zhuǎn)化無菌苗的外植體約2 500 個，1 號靶位點獲得20 株抗性芽，轉(zhuǎn)化效率為0.80%，2 號靶位點獲得21 株抗性芽，轉(zhuǎn)化效率為0.84%。潮霉素和Cas9檢測結(jié)果表明，除1 號靶位點株系8，2 號靶位點株系25 和34 外，其余抗性株檢測結(jié)果均呈陽性，即1 號靶位點轉(zhuǎn)基因陽性率為95%，2 號靶位點轉(zhuǎn)基因陽性率為90.48%（圖3）。

圖2 青花菜穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化的過程Fig. 2 Process of stable genetic transformation of broccoli

圖3 潮霉素抗性基因和Cas9 基因檢測Fig. 3 Detection of the hygromycin-resistant gene and Cas9 gene

2.3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的BoZDS基因突變情況分析

測序結(jié)果表明，1 號靶位點共有3 個轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生突變，其中株系1-1 和1-19 突變情況相同，均在靶位點前啟動子區(qū)域出現(xiàn)了67 bp 的大片段缺失，其他區(qū)域有2 個單堿基的替換，突變克隆均占測定克隆數(shù)的1/5，而株系1-5 在靶位點前發(fā)生了7個堿基的缺失。2 號靶位點共有7 個轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生突變，其中株系2-1、2-2、2-19、2-23 在靶位點前啟動子區(qū)域發(fā)生了67 bp 的大片段缺失，與1 號靶位點株系1-1 和1-19 的缺失位置相同，在其他位置上發(fā)生了3 個單堿基的替換；株系2-12 發(fā)生了1個或2 個單堿基的替換；株系2-16 在靶位點前2 個堿基處發(fā)生了單堿基的替換；株系2-7 有兩種突變情況，其中一個在靶位點上發(fā)生了1 個堿基的插入，另一個在靶位點上有1 個堿基的插入和8 個堿基的缺失以及靶位點前7 個堿基的缺失（圖4）。

2.4 不同靶位點的突變體數(shù)和突變率分析

兩個靶位點的突變情況分析表明，1 號靶位點19 株陽性株中有3 株發(fā)生突變，突變率為15.79%；2 號靶位點19 株陽性株中有7 株發(fā)生突變，突變率為36.84%（圖5）。1 號靶位點的3 株突變體均為雜合突變類型，2 號靶位點的突變體有純合（2-19、2-23）、雜合（2-2、2-16）和嵌合（2-1、2-7、2-13）三種突變類型（圖4，圖5）。

圖4 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的青花菜BoZDS 基因突變類型Fig. 4 Type of CRISPR/Cas9 system-mediated BoZDS mutation in broccoli

圖5 不同靶位點的突變體數(shù)和突變率Fig. 5 Mutant number and mutation rate of different targets

2.5 BoZDS突變體表型分析

如圖6 所示，與野生型和空載植株相比，2 個靶位點的突變體均發(fā)生了不同程度的白化或斑駁，其中株系1-1、1-19、2-1、2-12、2-16、2-19、2-23呈現(xiàn)完全白化的表型，株系1-5、2-2、2-7 呈現(xiàn)斑駁表型，表明突變體中BoZDS基因功能受到不同程度的影響。

圖6 BoZDS 突變體及野生型（WT）和空載植株（EV）的表型Fig. 6 Phenotypes of BoZDS mutants, wild-type（WT）,and transgenic plant with empty vector（EV）

2.6 BoZDS突變體和野生型植株的顏色參數(shù)分析

WT 和突變體的CILAB 顏色參數(shù)測定結(jié)果如表3 所示，突變體的亮度值L*顯著高于野生型植株，約WT 的1.5-1.7 倍，紅綠值a*也顯著高于WT 植株，黃藍值b*均有所下降。

表3 BoZDS 突變體及野生型（WT）和空載植株（EV）的顏色參數(shù)Table 3 Color parameters of BoZDS mutants, wild-type（WT）, and transgenic plant with empty vector（EV）

3 討論

建立有效的再生體系是將基因轉(zhuǎn)入植物的先決條件，在甘藍中，再生和轉(zhuǎn)化效率嚴重依賴基因型，同一物種中，外植體的選擇也尤為重要［27］。本試驗成功建立了青花菜穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，但轉(zhuǎn)化效率較低，未來可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基激素配比或者改變外植體種類來嘗試提高轉(zhuǎn)化效率。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在不同物種中的編輯效率存在差異，在水稻中基因編輯的突變率為21.1%-66.7%［28］；在 煙 草 中NtPDS和NtPDR6的突變率分別為81.8%和87.5%［17］；小麥中基因編 輯 的 突 變 率 為12.7% 和10.8%［29］；在 芥 藍 中BoaCRTISO和BoaZDS的突變率分別為81.25%和68.42%［12,30］。本試驗青花菜ZDS基因1 號靶位點的突變率為15.79%，2 號靶位點的突變率為36.84%，編輯效率處于正常范圍內(nèi)，但仍有提高空間。

本試驗中，2 號靶位點的軟件預(yù)測得分明顯高于1 號靶位點，突變結(jié)果表明，2 號靶位點的編輯效率是1 號靶位點的兩倍多，且2 號靶位點株系2-7和2-16 在靶位點上發(fā)生突變，而1 號靶位點突變體均未在靶位點上發(fā)生突變，說明2 號靶位點的編輯效率明顯高于1 號靶位點，與軟件預(yù)測結(jié)果一致，表明選擇靶位點時可將得分作為選擇依據(jù)之一。進一步發(fā)現(xiàn)，1 號靶位點突變體均為雜合突變類型，2號靶位點株系2-19 和2-23 為純合突變類型，這與前人報道的突變效率高的靶位點更容易發(fā)生純合突變的結(jié)論一致［31］。本試驗中，1 號和2 號靶位點的突變情況類似，可能是由于兩個靶位點在位置上較近，僅相隔19 bp。先前的研究表明，sgRNA 的GC 含量可能會影響其與其靶位點的結(jié)合，并最終影響編輯效果，高GC 含量有利于增加編輯效率［32-33］。然而，本試驗中1 號靶位點的GC 含量高于2 號靶位點，但編輯效率卻明顯低于2 號靶位點，表明靶位點的GC 含量并非是決定靶位點編輯效率的唯一因素。

研究表明，基因組非編碼區(qū)的突變可以影響基因調(diào)控和表型［34］，本試驗中發(fā)現(xiàn)部分突變體在靶位點上游的啟動子區(qū)域發(fā)生了大片段缺失或堿基替換，結(jié)合突變體明顯的白化或斑駁表型說明啟動子區(qū)域發(fā)生突變能夠?qū)蚬δ茉斐蓪嵸|(zhì)性影響。未來，我們可以通過軟件預(yù)測［33］并結(jié)合原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化篩選編輯效果好的靶位點來進行穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，從而提高青花菜的基因編輯效率。

4 結(jié)論

通過CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯體系，成功編輯了青花菜BoZDS基因，使其基因功能受到影響，產(chǎn)生明顯的白化或斑駁表型，并比較了兩個靶位點的差異。綜上，本試驗成功建立了青花菜基因編輯體系，為之后開展青花菜基因功能研究和材料創(chuàng)制提供了技術(shù)支撐。