銅綠麗金龜線粒體全基因組及其系統(tǒng)發(fā)育分析

曲春娟 朱悅，2 江晨 曲明靜 王向譽 李曉

（1. 山東省花生研究所，青島 266100；2. 塔里木大學農(nóng)學院，阿拉爾 843300；3. 山東省蠶業(yè)研究所，煙臺 264000）

銅綠麗金龜Anomala corpulenta隸屬于鞘翅目Coleoptera 多食亞目Polyphaga 金龜總科Scarabaeoidea金龜科Scarabaeidae 麗金龜亞科Rutelinae，在我國及日本、朝鮮、東南亞等國廣泛分布，其幼蟲危害玉米、花生、大豆、小麥等多種作物根系或莢果，造成直接或間接經(jīng)濟損失，成蟲經(jīng)常聚集暴食葉片，危害榆樹、楊樹、葡萄等多種林果木［1-2］，對其全面深入的研究對農(nóng)林生產(chǎn)具有重要意義。

麗金龜亞科昆蟲全世界已知有235 屬4 200 余種，其中有許多種類是重要的農(nóng)林害蟲［3］。目前麗金龜亞科的系統(tǒng)發(fā)育研究主要是納入在金龜總科和金龜科的研究中，針對麗金龜?shù)难芯縿t相對缺乏。而且尚有諸多問題需要解決，比如麗金龜亞科的單系性有待明確、麗金龜外部形態(tài)趨同現(xiàn)象普遍導致的近緣種區(qū)分困難等［4］。隨著分子生物學和測序技術的發(fā)展，基因序列被廣泛應用到昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育學研究中。相比傳統(tǒng)形態(tài)學手段，基因序列在解決趨同進化問題方面更有優(yōu)勢。尤其是線粒體基因因其母系遺傳、進化速率快等特點，在這一領域被廣泛應用［5-6］。對于金龜總科的分子系統(tǒng)學研究，過去主要借助于線粒體單基因、單個核基因或者少數(shù)2-3 個基因的聯(lián)合，例如cox1、cox2、16S rRNA、12S rRNA、cytb、nad1等線粒體基因都是經(jīng)常用于進化分析的分子靶標［7］。然而單個基因不僅所包含的進化信息較少，難以完全解析物種間的系統(tǒng)發(fā)育關系，在選擇壓力和進化速率方面也存在差異，容易導致“長枝吸引”等問題，而完整的線粒體基因組能夠克服上述弊端，成為研究后生動物進化歷史和親緣關系更加強有力的工具［8-9］。以前傳統(tǒng)的線粒體基因組測序主要依賴于通用引物和長片段PCR擴增，效率低下，費事費力；尤其是控制區(qū)高AT含量、連續(xù)重復堿基較多的特點，導致Sanger 測序獲取全長序列比較困難。隨著高通量測序技術的發(fā)展，該策略被逐步應用到線粒體基因組測序中來，成為獲取線粒體基因組序列的更有力手段［10］。

目前已完成線粒體全基因組測序的麗金龜只有日本弧麗金龜Popillia japonica［11］、棉花弧麗金龜Popillia mutans［12］和墨綠彩麗金龜Mimela splendens（MZ064554）。此外還有非全長序列JX412777（Popilliasp.）和JX412788（Adoretussp.）。其中僅弧麗金龜屬Popillia兩個種的線粒體基因組是基于高通量測序組裝獲得。而異麗金龜屬Anomala的線粒體基因組卻未見報道。該屬是麗金龜亞科中種類豐富度最高的屬，已記錄的超過1 000 種［4］。其中的代表性物種之一——銅綠麗金龜是我國華北農(nóng)田三大優(yōu)勢金龜甲之一［13-14］，受到昆蟲學家及植保工作者密切關注。針對其開展線粒體全基因組的研究，不僅可以豐富金龜科尤其是麗金龜亞科昆蟲的線粒體基因組信息，而且能夠為銅綠麗金龜?shù)姆肿酉到y(tǒng)學、群體遺傳學及分子生態(tài)學研究提供重要的基礎信息。

本研究利用高通量測序技術Illumina 平臺對銅綠麗金龜進行線粒體基因組測序，完成組裝和注釋后，對其線粒體基因組的結(jié)構(gòu)和基因排列、堿基組成、密碼子使用情況，以及轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）的結(jié)構(gòu)等進行預測分析，結(jié)合已發(fā)表的金龜科線粒體基因組序列對金龜科各亞科、屬和種之間的系統(tǒng)發(fā)育關系進行探討，旨在為麗金龜?shù)南到y(tǒng)發(fā)育研究和線粒體基因組學研究提供方法參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試銅綠麗金龜成蟲于2020年7月采自山東省花生研究所萊西望城試驗基地，將活體試蟲放入無水乙醇中于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。選擇試蟲胸部和足的肌肉組織提取基因組總DNA，所用提取方法為改進的CTAB 法，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸分析儀NanoDrop 2000 分別測定提取DNA 的質(zhì)量和濃度。

1.2 方法

1.2.1 Illumina HiSeq 高通量測序 DNA 樣品送至武漢百奧維凡生物科技有限公司構(gòu)建350 bp 的小片段測序文庫和進行高通量測序?；谶吅铣蛇厹y序（Sequencing By Synthesis, SBS）技術和Illumina HiSeq X 測序平臺對所構(gòu)建的測序文庫進行雙端150 bp 測序，利用NGS QC Toolkit 2.3.3［15］將原始測序數(shù)據(jù)進行過濾，去除adapter 序列、低質(zhì)量末端、含N>10%的reads 以及長度小于25 bp 的短片段后，得到11.29 Gb 的clean reads。

1.2.2 序列拼裝、注釋及特征分析 利用SPAdes v3.11.1（http://cab.spbu.ru/software/spades/）［16］拼 接軟件對clean reads 進行拼接，構(gòu)建contigs。使用SSPACE 軟件［17］對contigs 進行擴展延伸，獲得最終的完整線粒體基因組序列。利用MITOS 在線服務器（http://mitos.Bioinf.uni-leipzig.de）［18］對線粒體基因組序列進行功能注釋。并進一步通過與已知金龜科物種的線粒體基因進行同源比對注釋結(jié)果進行核對驗證。利用tRNAscan-SE 軟件（http:∥lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）［19］對tRNA 基因進行查找及二級結(jié)構(gòu)的預測。利用Mega 11［20］分別計算銅綠麗金龜線粒體基因組中各編碼基因的堿基組成、密碼子使用頻率、AT-skew 和GC-skew。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 為研究銅綠麗金龜在金龜科的系統(tǒng)發(fā)育地位，利用線粒體基因組的13 個蛋白質(zhì)編碼基因（protein-coding genes，PCGs）的核苷酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。選取已報道的19 種金龜科昆蟲的線粒體基因組作為參考序列，以牙甲科昆蟲Sphaeridium bipustulatum為外群，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和貝葉斯法（Bayesian，BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Clustal X 2.0［21］對核苷酸序列進行多重比對后，使用Gblocks v0.91b［22］過濾比對結(jié)果，然后采用SequenceMatrix v1.7［23］對每個基因的比對結(jié)果進行串聯(lián)連接?；赟MS 軟件［24］和ModelFinder［25］對建樹數(shù)據(jù)集評估得到的最適替代模型為GTR+I+G。以PhyML3.0 在線分析軟件［26］進行1 000 次bootstrap 運算，構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹。利用MrBayes 3 軟件［27］計算200 000 代，每運算100 代取樣保存，舍棄25%的老化樣本，構(gòu)建BI 系統(tǒng)發(fā)育樹。最后使用FigTree v.1.4.3（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree）對系統(tǒng)發(fā)育樹進行繪制。

2 結(jié)果

2.1 銅綠麗金龜mtDNA基因組結(jié)構(gòu)組成和分布特征

銅綠麗金龜線粒體基因組全長16 673 bp（GenBank 登錄號：OL449520），呈現(xiàn)典型雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括13 個PCGs、2 個rRNA、22 個tRNA 共37 個基因以及1 074 bp 的AT 富集區(qū)，與后生動物線粒體基因組的經(jīng)典基因組成一致。昆蟲線粒體基因組的多數(shù)基因在同一條鏈上編碼，該鏈稱為J 鏈（majority strand）；其余少數(shù)基因在另一條鏈上編碼，該鏈稱為N 鏈（minority strand）。對銅綠麗金龜線粒體而言，23 個基因位于J 鏈上，包括9 個PCGs（nad3、cox3、atp6、atp8、cox2、cox1、nad2、cytb和nad6）和14 個tRNA 基因；14 個基因位于N鏈，包括4 個PCGs（nad5、nad4、nad4l和nad1）、8 個tRNA 基因和2 個rRNA 基因（圖1）。與其他昆蟲線粒體一樣，銅綠麗金龜線粒體基因組也存在基因重疊和間隔現(xiàn)象，表現(xiàn)為30 處長度1-41 bp 的堿基重疊現(xiàn)象和5 處長度1-15 bp 的堿基間隔現(xiàn)象（表1）?；蚺挪寂c已報道的其他麗金龜：墨綠彩麗金龜、日本弧麗金龜和棉花弧麗金龜一致，與果蠅代表的祖先模式也一致。

表1 銅綠麗金龜線粒體基因位置與起始終止密碼子Table 1 Locations and start/stop codons of mitochondrial genes in A. corpulenta

圖1 銅綠麗金龜線粒體基因組結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Mitochondrial genome structure of A. corpulenta

2.2 線粒體基因組堿基組成

總的來看，銅綠麗金龜線粒體基因組中A+T 含量占比75.87%，G+C 含量占比24.13%，表現(xiàn)出明顯的AT 偏向性。其中PCGs、tRNA 基因和rRNA 基因的A+T 含量分別為74.87%、76.54%和75.79%。全基因組的AT-skew 為正值（0.027），GC-skew 為負值（-0.237），表明整個基因組更偏好于使用A 堿基和C 堿基。整個線粒體基因組不同位置對堿基偏好性具有一定差異。22 個tRNA 基因和2 個rRNA 的AT-skew 均為正值，表明其偏好A 堿基；13 個PCGs和2 個rRNA 的AT-skew 均為負值，表明其偏好T堿基；從不同的單基因來看，除atp8外其余12 個PCGs 的AT-skew 外均為負值，J 鏈上的9 個PCGs的GC-skew 均為負值，N 鏈上的4 個PCGs 和rRNA基因的GC-skew 均為正值，與大多數(shù)昆蟲的線粒體基因組AT/GC 偏斜一致（表2）。

表2 銅綠麗金龜線粒體基因組堿基組成Table 2 Base composition in the mitochondrial genome of A. corpulenta

2.3 線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因及密碼子使用情況

銅綠麗金龜線粒體基因組含有13 個PCGs，序列全長11 212 bp（占比67.25%），除去終止密碼子（37 bp）共編碼3 725 個氨基酸殘基。使用最頻繁的密碼子為UUU（Phe）、UUA（Leu）、AUU（Ile）和UAU（Tyr），而CGC（Arg）、CGG（Arg）、CCG（Pro）和GCG（Ala）使用相對較少（表3），由此也反映了核苷酸組成的AT 偏好性。

表3 銅綠麗金龜線粒體基因組相對同義密碼子使用頻率（RSCU）Table 3 Relative synonymous codon usage（RSCU）in the mitochondrial genome of A. corpulenta

所有PCGs中nad5最長（1 717 bp），atp8最短（157 bp）。除nad4l以TTG 為起始密碼子外，其余PCGs都以ATN 作為起始密碼子，其中nad2、cox3、nad4和cytb以ATG 為起始密碼子，atp6和nad1以ATA為起始密碼子，cox1、atp8和nad5以ATT 為起始密碼子，cox2、nad3和nad6以ATC 為起始密碼子。cox3和nad4以不完整的TA 為終止密碼子，缺失的核苷酸由轉(zhuǎn)錄后3 苷端多聚腺苷酸化補齊［28］，其余PCGs 均以TAA 或TAG 為終止密碼子，與昆蟲線粒體基因組普遍使用的終止密碼子一致。

2.4 線粒體基因組tRNA和rRNA

銅綠麗金龜?shù)?2 個tRNA 基因長度范圍為63 bp（tRNACys）到72 bp（tRNALys），總長度為1 450 bp。預測的二級結(jié)構(gòu)如圖2 所示，除tRNASer（AGN）缺失DHU 臂外，其余tRNA 序列都可以折疊成典型的三葉草式二級結(jié)構(gòu)。此外，tRNASer和tRNALeu以雙拷貝形式存在，其余tRNA 基因均僅顯示單拷貝。銅綠麗金龜?shù)膬蓚€rRNA 基因均在N 鏈上，16S rRNA位 于tRNALeu（CUN）和tRNAVal之 間，長 度1 350 bp；12S rRNA在tRNAVal和控制區(qū)之間，長度800 bp。

圖2 銅綠麗金龜線粒體基因組tRNA 二級結(jié)構(gòu)Fig. 2 Putative secondary structures of tRNAs in the mitochondrial genome of A. corpulenta

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

以 牙 甲 科（Sphaeridiinae） 中 的Sphaeridium bipustulatum為外群，使用已報道的麗金龜亞科（Rutelinae）、金龜亞科（Scarabaeinae）、花金龜亞科（Cetoniinae）、鰓金龜亞科（Melolonthinae）、犀金龜亞科（Dynastinae）、蜉金龜亞科（Aphodiinae）共19 種金龜科昆蟲及本研究測得的銅綠麗金龜線粒體基因組的13 個PCGs 的核苷酸序列，構(gòu)建金龜科昆蟲的ML 和BI 系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示兩種建樹方法得到的拓撲結(jié)構(gòu)完全一致，金龜亞科和蜉金龜亞科聚為1 個分支，麗金龜、花金龜、犀金龜和鰓金龜亞科聚為1 個分支，置信值均為100%。除鰓金龜亞科外，各亞科均聚為一支且置信值較高。但與傳統(tǒng)分類不同，鰓金龜亞科的5 個種并未聚為一個支系。各亞科之間的系統(tǒng)發(fā)生關系為（蜉金龜亞科+金龜亞科）+（鰓金龜亞科（花金龜亞科（犀金龜亞科+麗金龜亞科）））（圖3）。

圖3 基于線粒體蛋白質(zhì)編碼基因核苷酸序列構(gòu)建的銅綠麗金龜與其他金龜科昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹（最大似然法和貝葉斯法）Fig. 3 Phylogenetic tree of A. corpulenta and other insects species of Scarabaeidae based on the mitochondrial protein-coding gene sequences（maximum likelihood and Bayesian）

銅綠麗金龜聚在麗金龜亞科分支系，與墨綠彩麗金龜組成姐妹關系，且置信值均為100%。利用Kimura-2-Parameter 參數(shù)模型計算麗金龜亞科5 個種之間的遺傳距離，結(jié)果所反映的親緣關系與系統(tǒng)發(fā)育樹一致：銅綠麗金龜與墨綠彩麗金龜?shù)倪z傳距離為0.007 9，而與棉花弧麗金龜和日本弧麗金龜?shù)倪z傳距離分別為0.172 7 和0.177 4，與喙麗金龜屬Adoretussp.的遺傳距離則為0.209 9（表4）。

3 討論

線粒體基因組具有母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡單、進化速率快的特點，作為分子標記有其獨特優(yōu)勢，目前被廣泛應用到遺傳學、系統(tǒng)發(fā)育學、生物地理學以及物種診斷學等研究領域［5-6］。隨著測序技術的進步，越來越多的昆蟲線粒體基因組完成測序［5］。這些昆蟲線粒體基因組與其他后生動物線粒體一樣，呈現(xiàn)共同特點：為共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA 分子，長度為14-20 kb，通常含有37 個基因，包括13 個PCGs、22 個tRNA 基因、2 個核糖體RNA（ribosomal RNA，sRNA）基因及一個或數(shù)個AT 富集區(qū)［29-30］。

本研究首次測定和分析了銅綠麗金龜?shù)耐暾€粒體基因組，豐富了金龜科的線粒體基因組信息，尤其是為研究異麗金龜Anomala屬在麗亞科中的系統(tǒng)發(fā)育位置提供了數(shù)據(jù)基礎。銅綠麗金龜線粒體基因組全長16 673 bp，與NCBI 已公布的其他3 種麗金龜（墨綠彩麗金龜、日本弧麗金龜和棉花弧麗金龜）的線粒體基因組大小近似（15 148-16 541 bp）［11-12］。包含37 個線粒體基因，排布方式與上述3 種麗金龜完全一致，而且與果蠅Drosophila yakuba也一致［31］。D. yakuba線粒體的基因排布方式代表了昆蟲線粒體基因排布的祖先模式［31］，說明銅綠麗金龜線粒體未發(fā)生基因重排現(xiàn)象。

在昆蟲綱中，線粒體基因組的蛋白質(zhì)編碼基因已被廣泛證實可以有效解決不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育問題［5］。本研究以線粒體基因組的13 個蛋白質(zhì)編碼基因作為分子靶標，探索了金龜科6 個亞科（麗金龜亞科、金龜亞科、花金龜亞科、鰓金龜亞科、犀金龜亞科、蜉金龜亞科）的分類學關系［3］。在已公布線粒體基因組序列的幾種麗金龜物種中，日本弧麗金龜、棉花弧麗金龜和墨綠彩麗金龜具有完整的線粒體基因組序列。Adoretussp.（JX412788）的線粒體基因組雖然是部分序列，但包含了完整的13 個PCGs 序列信息，因此也被納入到建樹數(shù)據(jù)集。但Phylloperthasp.（KX087335）和Popilliasp.（JX412777）的線粒體基因組由于缺失部分PCGs的數(shù)據(jù)，未被采用。

Table 4 Pairwise genetic distances of mitochondrial protein-coding gene sequences between A. corpulenta and other phytophagous species of Scarabaeidae based on Kimura-2-Parameters

已知的金龜科昆蟲全世界超過30 000 種，按照食性分為糞食性和植食性兩大類［32-33］。其中糞食類包括金龜亞科和蜉金龜亞科，植食類包括犀金龜、花金龜、麗金龜和鰓金龜。本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也清晰得顯示了金龜科是由這兩個主要群體構(gòu)成的。植食性金龜子各亞科之間的系統(tǒng)發(fā)生關系為鰓金龜亞科+（花金龜亞科+（犀金龜亞科+麗金龜亞科）），與Ayivi 等［33］和Song 等［12］基于線粒體基因組ML 樹和BI 樹的分析結(jié)果一致。麗金龜亞科和犀金龜亞科互為姐妹群，也與目前多數(shù)學者基于形態(tài)學和分子證據(jù)得出的主流觀點一致［4］。此外，麗金龜、犀金龜、花金龜和金龜亞科的單系性均得到很高的支持，說明系統(tǒng)發(fā)育關系可信度較高。同時我們發(fā)現(xiàn)鰓金龜亞科并非單系群，這與之前報道一致［12,33-35］。

在屬級階元關系上，系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果顯示麗金龜亞科一支中，異麗金龜屬Anomala與彩麗金龜屬Mimela的親緣關系更近，弧麗金龜屬Popillia次之，而喙麗金龜屬Adoretus較遠，且在該分支上兩種分析方法的置信值均為100%。遺傳距離分析的結(jié)果同樣證明了上述關系，支持了Bouchard 等［3］關于麗金龜亞科的分類系統(tǒng)。但齒爪鰓金龜屬Holotrichia兩個種（暗黑鰓金龜H. parallela和大黑鰓金龜H.oblita）并沒有聚到一起，還需要進一步研究。

本研究對銅綠麗金龜線粒體基因組全序列的測定，豐富了金龜科線粒體基因組的序列信息以及結(jié)構(gòu)和組成信息，為后續(xù)麗金龜科系統(tǒng)發(fā)育關系研究奠定基礎，同時也為銅綠麗金龜?shù)娜后w遺傳學和分子生態(tài)學研究提供了基礎信息。

4 結(jié)論

獲得了銅綠麗金龜線粒體全基因組，其基因的排布方式與墨綠彩麗金龜、日本弧麗金龜和棉花弧麗金龜相同，且與祖先模式一致，系統(tǒng)發(fā)育分析支持麗金龜亞科的單系性，異麗金龜屬Anomala與彩麗金龜屬Mimela的親緣關系較其與弧麗金龜Popillia和喙麗金龜屬Adoretus更近。