褪黑素調(diào)控呼吸代謝及抗氧化活性延緩采后青花菜衰老

朱玲玲，胡花麗，羅淑芬，吳朝霞，李鵬霞※,3,4

0 引 言

青花菜（Brassica oleracea L.var. Italica Planch.）屬于十字花科蕓苔屬甘藍(lán)種，富含多種營養(yǎng)成分，能增強肝臟的解毒能力，提高機體的免疫力，并具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等多種藥理活性[1]。采后青花菜在常溫下放置2～3 d花蕾便因失水及葉綠素降解而萎蔫、變黃、生霉等，營養(yǎng)成分也迅速被降解，嚴(yán)重影響其商品價值[2]。因此，研究青花菜貯藏保鮮技術(shù)具有現(xiàn)實意義。

褪黑素（melatonin，MT），化學(xué)名N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是所有植物都具有的一種內(nèi)源吲哚胺。在植物根、莖、葉、花、果實等不同器官中，已經(jīng)確認(rèn)了褪黑素的存在[3-4]?，F(xiàn)有研究表明，褪黑素參與了植物的多種發(fā)育過程，包括發(fā)芽[5]，幼苗生長[6]和衰老[7]等。褪黑素除了作為黑暗信號和植物生長調(diào)節(jié)劑外，另一個顯著的作用是與保護植物免受內(nèi)部和環(huán)境氧化脅迫有關(guān)的抗氧化活性[8]。在葉片組織上的研究表明，MT處理降低了大麥葉葉綠素的降解，延遲了黑暗誘導(dǎo)的衰老現(xiàn)象[9]；Wang[10]和 Shi[11]等亦報道，褪黑素通過調(diào)控湖北海棠和蓮座葉片葉綠素的降解而延緩其衰老。有研究顯示，100μmol/L MT處理可維持草莓果實中較高的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphateadenosine，ADP）含量以及較高的能荷水平[12]；Gao[13]等采用100 μmol/L MT處理桃果實，發(fā)現(xiàn)MT處理降低了桃果實的呼吸速率，并顯著提高了桃果實的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）及過氧化物酶（peroxidase，POD）活性；另外，在木薯上的研究也證明了 MT處理通過提高SOD、CAT活性，降低H2O2積累，從而延遲木薯根采后生理變質(zhì)[14]。然而，褪黑素處理對采后青花菜貯藏過程中呼吸代謝作用尚未見報道。因此，本研究采用褪黑素處理鮮切青花菜，首先對青花菜黃化指數(shù)、色差及組織內(nèi)源褪黑素含量進(jìn)行分析，進(jìn)而分析了褪黑素對青花菜總?cè)~綠素含量、呼吸代謝、能量水平、抗氧化物酶及其同工酶活性的影響，旨在闡明褪黑素調(diào)控采后青花菜衰老的可能機制，進(jìn)而為其實際應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青花菜購買于南京眾彩批發(fā)市場（由基地訂購，并于采摘當(dāng)日運至批發(fā)中心），采用泡沫箱+隔紙+碎冰的方式運回實驗室。參考劉紅艷[15]的方法，選取大小均一，成熟度一致，無病蟲害、機械損傷，花球緊密的青花菜作為試驗材料，然后分切成小青花菜頭。

色譜級的褪黑素、甲醇、ATP（adenosine triphosphate）、ADP（adenosine diphosphateadenosine）和 AMP（denosine monophosphate）購自美國Sigma-Aldrich；分析純的氟化鈉，丙二酸，磷酸三鈉，疊氮鈉和聯(lián)苯胺購自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；分析純的水楊羥肟酸，丙烯酰胺（Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（N,N′-Methylenebis acrylamide）購自上海阿拉丁化學(xué)工業(yè)有限公司；分析純的鹽酸羥胺，對氨基苯磺酸，α-萘胺，甲硫氨酸，氮藍(lán)四唑和核黃素購自上海瑞永生物科技有限公司；分析純的四甲基乙二胺購自成都市科龍化工試劑廠；分析純的過硫酸銨購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CR-400型色差儀（精度0.07以內(nèi)），柯尼卡美能達(dá)有限公司；UV-1102型紫外可見分光光度計（±0.002），天美科學(xué)儀器（上海）有限公司；A11 Basic型液氮研磨器（出樣粒度：1～100 μm），艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；Seven multi pH計（±0.001），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Oxygraph氧電極自動測定體系（最小分辨率：10 × 10–6μmol），英國 Hansatech 公司；KY-Ⅱ型水浴式氮吹儀（控溫精度：±1℃），安簡（北京）科技有限公司；Aglient 1260 型高效液相色譜儀（1 × 10–8μg最低檢測限），安捷倫科技（中國）有限公司；DYY-7C型電泳儀（最大輸出電流2 000 mA），北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選用100 μmol/L的褪黑素對青花菜進(jìn)行浸泡處理，以蒸餾水浸泡為對照（CK1），無任何處理為空白對照（CK0），浸泡5 min后，瀝干，將青花菜裝入4.5 L的帶孔保鮮盒，每處理設(shè)置3個重復(fù)。貯藏溫度為（15±1）℃、相對濕度為 85%～90%。貯藏期間每隔1 d取樣1次，用干凈的刀具切取青花菜小花蕾于液氮中速凍，并置于–20℃用于相關(guān)指標(biāo)的測定。其中，呼吸代謝各途徑的測定采用同期鮮樣進(jìn)行。

1.4 指標(biāo)測定方法

1.4.1 黃化指數(shù)和色差的測定

黃化指數(shù)的測定參照 Olarte等[16]的顏色評價標(biāo)準(zhǔn)和Pen等[17]的褐變指數(shù)計算。貯藏期間，每1 d測定1次。

黃化指數(shù)＝∑（黃化級別 × 黃化樣品數(shù)目百分比） （1）

當(dāng)青花菜黃化指數(shù)大于 2時認(rèn)為黃化程度嚴(yán)重，樣品已不具有商品價值。青花菜的黃化級別按表1判定。

表1 青花菜黃化等級評價Table 1 Evaluation of yellowing level in broccoli

色差的測定參考紀(jì)淑娟等[18]的方法，利用色差計測定花球的色度，在L*、a*、b*模式下，每處理每1 d平行測定20次，取其平均值。

1.4.2 褪黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

參考Sun[19]的方法，略有修改。稱取1 g青花菜樣品，加入10 mL甲醇，靜置1 h，超聲15 min隨后在4 ℃10 000 g下離心15 min，收集上清液并用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾，置于新試管中，用氮吹儀吹干。將吹干后的物質(zhì)用1 mL 80%（v/v）甲醇水溶液重新溶解，震蕩混勻，通過0.22 μm濾膜過濾后等待上樣。

檢測條件：A相（甲醇），B相（50 mmol/L Na2HPO4/H3PO4緩沖液），體積比為40%：60%；采集數(shù)據(jù)時間30 min；色譜柱Xbridge C18反相柱（250 mm ×4.6 mm × 5 μm）；柱溫 30℃；流速：1 mL/min；檢測器：激發(fā)光波長267 nm，發(fā)射光波長348 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.3 總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

參考劉紅艷等[15]的方法。

1.4.4 呼吸速率的測定

采用專一性呼吸抑制劑測量各呼吸途徑所占比例（%）。參考趙素平等[20]的方法。10 mmol/L氟化鈉為糖酵解關(guān)鍵酶烯醇化酶的抑制劑；50 mmol/L丙二酸為三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶的抑制劑；10 mmol/L磷酸三鈉為磷酸戊糖途徑中的 6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑；5 mmol/L疊氮鈉為細(xì)胞色素氧化途徑的抑制劑；10 mmol/L水楊羥肟酸為交替途徑的抑制劑。

稱取0.1 g青花菜花萼放入反應(yīng)杯，反應(yīng)溫度（25.0±0.1）℃，轉(zhuǎn)速 85 r/min；通過分別加入上述抑制劑各0.1 mL，分別測定青花菜在不同途徑的耗氧速率以及占總呼吸速率的比例。

1.4.5 三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）質(zhì)量分?jǐn)?shù)及能荷的測定

參照 Liu等[21]的方法，能荷的計算參考公式（2），試驗重復(fù)3次。

式中ATP、ADP、AMP為各物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

參考蘆航等[22]的方法。

1.4.7 過氧化氫（H2O2）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

參考Patterson等[23]的方法。

1.4.8 超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及過氧化物酶（POD）活性測定

SOD測定采用氮藍(lán)四唑光還原法[24]。CAT測定采用過氧化氫法[25]。POD測定采用愈創(chuàng)木酚法[26]。

1.4.9 SOD、CAT及POD同工酶活性測定

取1 g青花菜樣品，加入50 mmol/L 磷酸緩沖液（含1% PVP、2.55 mmol/L EDTA）10 mL，于10 000 g下離心 15 min，上清液用于同工酶測定。采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳進(jìn)行同工酶分析，按表2的凝膠配置進(jìn)行灌膠，其中，凝膠貯備液為30%（m/V）丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺（29：1），分離膠緩沖液為1.5 mol/L pH值為8.8的Tris-HCl，濃縮膠緩沖液為1.0 mol/L pH值為 6.7的 Tris-HCl。電極緩沖液為 pH值為 8.3的Tris-Glycine。點樣量為 40 μL/孔，電泳至溴酚藍(lán)標(biāo)志到達(dá)凝膠前沿為止。

表2 丙烯酰胺凝膠配置Table 2 Acrylamide gel configuration

SOD同工酶測定：分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。染色采用NBT法[27]，略作修改。膠片脫下后，于1 mg/mL NBT溶液中黑暗下浸泡20 min，蒸餾水沖洗幾次，于 36 mmol/L pH值為 7.8的磷酸鈉緩沖液（含28 mmol/L核黃素、50 μL四甲基乙二胺）中黑暗下浸泡15 min，蒸餾水沖洗幾次，于50 mmol/L pH值為7.8的磷酸鈉緩沖液（含10 mmol/L EDTA）中光照，待酶帶顯色后，漂洗，照相。

CAT同工酶測定：分離膠濃度為8%，濃縮膠濃度為5%。染色：將1%可溶性淀粉溶液于沸水浴中充分煮沸至無色透明；膠片脫下后放入可溶性淀粉溶液中 4 ℃下浸泡1 h 40 min；傾出淀粉液加入0.5% 過氧化氫溶液，室溫靜置1 min；然后用雙蒸水漂洗幾次，加入0.5% KI溶液（取0.5 g，用雙蒸水定容至100 mL，加0.5 mL冰醋酸使之酸化）；待酶帶顯色后，漂洗，照相。

POD同工酶測定：分離膠濃度為8%，濃縮膠濃度為5%。染色采用聯(lián)苯胺染色法[28]，略作修改。取0.1 g聯(lián)苯胺，加入少量無水乙醇溶解，依次加入 5 mol/L乙酸10 mL，1.55 mol/L乙酸鈉10 mL，H2O 70 mL，最后加入3～5滴H2O2。待酶帶顯色后，沖洗，拍照。

遷移率=酶帶遷移距離(cm)/溴酚藍(lán)遷移距離(cm) （3）

同工酶條帶強度以凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描的灰度值表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Origin 8.5軟件繪制圖表，所有數(shù)據(jù)為重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，顯著性采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行鄧肯氏多重差異分析（P < 0.05），同工酶酶譜采用SensiAnsys 凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素處理對采后青花菜黃化指數(shù)和色差的影響

青花菜貯藏過程中花蕾黃化是影響其品質(zhì)的重要因素之一，也是判斷其貯藏壽命的直觀因素。由圖1可知，在貯藏期間，青花菜的黃化指數(shù)不斷升高。貯藏第3 d時，CK0、CK1組青花菜開始出現(xiàn)黃化，并迅速上升。貯藏至第6 d時，CK0組青花菜的黃化指數(shù)為1.93，黃化程度嚴(yán)重，幾乎失去商品價值，同期CK1組青花菜的黃化指數(shù)為2.08，完全失去商品價值。相比之下，MT處理組青花菜在貯藏第4 d時出現(xiàn)黃化，而且與CK0、CK1組相比，其黃化指數(shù)的上升較為緩慢。例如，在貯藏第4、第5、第6 d時，MT處理組青花菜的黃化指數(shù)均顯著低于CK0、CK1組（P < 0.05）。值得注意的是，在貯藏第7 d時，MT處理組青花菜的黃化指數(shù)僅為1.71，該值仍低于2組對照在貯藏6 d時的黃化指數(shù)，表明MT組青花菜在貯藏第7 d仍具有一定的商品價值。因此，在本試驗條件下，較2組對照相比，MT可使青花菜的貯藏期限由原來的5 d延長至7 d。

圖1 采后青花菜貯藏過程中黃化指數(shù)的變化Fig.1 Change of yellowing index of postharvest broccoli during storage

表3 采后青花菜貯藏過程中色差的變化Table 3 Change of chromatism of postharvest broccoli during storage

表3所示，隨著貯藏時間的延長，各處理花球的L*、a*、b*值均呈現(xiàn)增大趨勢。L*值的增大表示花球的顏色亮度由深開始變淺，a*和 b*值的增大表明花球的顏色開始變黃。在貯藏的前3 d，不同處理青花菜的顏色之間無顯著差異；從貯藏第4 d開始，CK0和CK1組青花菜的L*和b*值均迅速上升，而MT組青花菜L*和b*值的上升相對緩慢，且在貯藏第4 d、第5 d、第6 d時均明顯低于2個對照組（P < 0.05）；從貯藏第5 d起，CK0和CK1組青花菜的a*值也迅速上升，同樣MT組青花菜的a*值上升較緩，在貯藏第 6 d時明顯低于 2個對照組（P <0.05）。另外，貯藏第7 d時，MT組青花菜的L*、a*、b*值均低于貯藏第6 d時CK0和CK1組青花菜的L*、a*、b*值，可見MT處理可有效延緩采后青花菜L*、a*、b*值的增加，這也與黃化指數(shù)的結(jié)果一致。

2.2 褪黑素處理對采后青花菜表型的影響

由圖2可以看出，貯藏0～2 d內(nèi)，CK0、CK1和MT處理組青花菜感官品質(zhì)尚無明顯差異；貯藏第4 d時，在CK0和CK1組，部分青花菜已出現(xiàn)黃化，但在同期，MT處理組青花菜仍保持良好的綠色表型；貯藏第 6 d時，CK0、CK1組青花菜已全部黃化，而在MT處理組，仍有部分花蕾保持綠色。

圖2 采后青花菜貯藏過程中表型的變化Fig.2 Change of phenotype of postharvest broccoli during storage

2.3 褪黑素處理對采后青花菜內(nèi)源褪黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

采后青花菜貯藏過程中內(nèi)源褪黑素含量的變化見圖3。在整個貯藏期間，CK0、CK1組褪黑素含量之間無明顯差異，MT處理組青花菜褪黑素含量雖明顯高于CK0、CK1組，但隨貯藏時間的延長而顯著降低（P<0.05）。

圖3 采后青花菜貯藏過程中內(nèi)源褪黑素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.3 Change of endogenous melatonin mass fraction of postharvest broccoli during storage

2.4 褪黑素處理對采后青花菜總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

花球顏色是青花菜重要的品質(zhì)指標(biāo)之一，而葉綠素含量與花球顏色關(guān)系密切。由圖 4可看出，在整個貯藏過程中，青花菜的總?cè)~綠素含量整體呈下降趨勢，但MT處理延緩了組織中葉綠素的降解，在貯藏第2、第4、第6 d，MT處理組青花菜的葉綠素含量均明顯高于CK0、CK1組（P<0.05）。第6 d時，MT組青花菜的葉綠素較CK0、CK1組分別高出18.03%、24.15%。

圖4 采后青花菜貯藏過程中總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.4 Change of total chlorophyll mass fraction of postharvest broccoli during storage

2.5 褪黑素處理對采后青花菜底物氧化水平代謝途徑的影響

呼吸作用是果蔬采后的重要生理活動之一，也是判斷不同處理對果蔬生理變化影響的重要依據(jù)。由圖5a可知，青花菜的總呼吸速率整體呈上升趨勢，而 MT處理明顯抑制了青花菜的呼吸作用，尤其在貯藏第4、第6 d，MT處理組青花菜的總呼吸速率顯著低于CK0、CK1組（P<0.05）。

圖5 采后青花菜貯藏過程中底物氧化水平代謝途徑的變化Fig.5 Changes of pathway of substrate oxidation level metabolic in postharvest broccoli during storage

如圖5b所示，在整個貯藏期間，CK0、CK1組青花菜的糖酵解（embden-meyerhof-parnas，EMP）途徑總體呈先上升后下降趨勢，貯藏第4 d達(dá)到峰值，而MT處理組青花菜的EMP途徑則呈不斷上升趨勢，貯藏第6 d達(dá)到峰值，且峰值顯著低于CK1組（P<0.05）。說明MT處理可以延緩采后青花菜EMP途徑呼吸峰的出現(xiàn)時間，抑制EMP呼吸的活性。

由圖 5c可見，CK0組青花菜的三羧酸循環(huán)（tricarboxyfic-acid-cycle，TCA）途徑呈先下降后上升再下降趨勢，貯藏第4 d達(dá)到峰值，而CK1與MT處理組青花菜的TCA途徑則呈不斷上升趨勢。MT處理組青花菜的TCA途徑在貯藏第4 d時，顯著低于CK0、CK1組（P<0.05），在貯藏第6 d時，顯著低于CK1組（P<0.05）。

由圖 5d可知，CK0、CK1組青花菜的磷酸戊糖（phosphopentose pathway，PPP）途徑呈先下降后上升趨勢，MT處理組青花菜的PPP途徑則呈不斷上升趨勢。盡管如此，在貯藏第4 d時，MT處理組青花菜的PPP途徑顯著低于2個對照組（P < 0.05），在貯藏第6 d時，顯著低于CK1組（P < 0.05）。

2.6 褪黑素對采后青花菜電子傳遞末端途徑的影響

細(xì)胞色素氧化途徑（cytochrome pathway，CP）是呼吸鏈中電子傳遞鏈的 1個主要途徑，它的表達(dá)與總呼吸強度密切相關(guān)。如圖6a所示，貯藏期間，CK0、CK1及MT處理組青花菜的 CP途徑總體皆呈先上升后下降趨勢。貯藏第4、第6 d時，MT處理組青花菜的CP耗氧速率顯著低于CK0、CK1組（P<0.05），說明褪黑素處理可抑制采后青花菜細(xì)胞色素途經(jīng)的運行。

交替氧化途徑（alternate pathway，AP）是電子傳遞鏈的另1條呼吸途徑。由圖6b可知，同CP途徑相反，在貯藏期間，CK0、CK1及MT處理組青花菜的AP耗氧速率總體呈先下降再上升趨勢。貯藏第4、第6 d時，MT處理組青花菜 AP途徑顯著高于 CK0、CK1組（P<0.05）。

圖6 采后青花菜貯藏過程中電子傳遞末端途徑的變化Fig.6 Changes of terminal pathway of electron transport in postharvest broccoli during storage

2.7 褪黑素對采后青花菜能量代謝的影響

細(xì)胞的能量供應(yīng)在果蔬采后成熟衰老中起關(guān)鍵作用，而植物組織中ATP含量則反映了細(xì)胞內(nèi)能量供給的狀態(tài)[29]。由圖 7a可看出，在貯藏期間，CK0、CK1及MT處理組青花菜的ATP含量呈先上升后下降趨勢，貯藏第4 d達(dá)到峰值。在貯藏第4、第6 d時，MT處理組青花菜的ATP含量均顯著高于CK0、CK1組（P<0.05）。

在貯藏過程中，CK0、CK1及MT處理組青花菜ADP含量的變化趨勢與ATP含量的變化趨勢相似，為先上升后下降（圖7b）。貯藏第4、第6 d時，MT處理組青花菜的ADP含量均顯著高于CK0、CK1組（P<0.05）。

圖7c顯示，CK0組青花菜的AMP含量呈不斷上升趨勢，CK1與MT處理組青花菜的AMP含量呈先下降后上升趨勢。在貯藏第4、第6 d時，MT處理組青花菜的AMP含量明顯低于 CK0、CK1組（P<0.05），說明 MT處理抑制了采后青花菜組織中AMP含量的增加。

能荷是細(xì)胞中可利用能量的一個量化指標(biāo)，表示細(xì)胞中腺苷酸系統(tǒng)的能量狀態(tài)[30]。由圖7d可知，CK0組青花菜的能荷值呈先下降后上升再下降趨勢，CK1與 MT處理組青花菜能荷值呈先上升后下降趨勢。在貯藏第2、第4 d時，MT處理組青花菜的能荷值顯著高于CK0、CK1組（P<0.05），在貯藏第6 d時，MT處理組青花菜的能荷值顯著高于CK1組（P<0.05）。

圖7 采后青花菜貯藏過程中能量代謝的變化Fig.7 Change of energy metabolism in postharvest broccoli during storage

2.8 褪黑素處理對采后青花菜超氧陰離子（）產(chǎn)生速率及過氧化氫（H2O2）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

果實衰老源于活性氧的積累，由于活性氧產(chǎn)生和清除之間的平衡被破壞，使果實衰老加劇。由圖8a可知，CK0組青花菜的產(chǎn)生速率隨著貯藏時間的延長呈不斷上升趨勢，CK1與 MT處理組青花菜的產(chǎn)生速率變化趨勢相似，為先上升后下降。在貯藏第2、第6 d時，MT處理組青花菜的產(chǎn)生速率顯著低于 CK0、CK1組（P<0.05），在貯藏第4 d時，MT處理組青花菜的產(chǎn)生速率顯著低于CK1組（P<0.05）。

采后青花菜貯藏過程中 H2O2含量的變化情況見圖8b，CK0、CK1及MT處理組青花菜的H2O2含量均不斷上升。在貯藏后期（第4、第6 d），MT處理組青花菜的H2O2含量顯著低于CK0、CK1組（P<0.05）。

圖8 采后青花菜貯藏過程中產(chǎn)生速率、H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.8 Changes of generation rate and H2O2 mass fraction of postharvest broccoli during storage

2.9 褪黑素對采后青花菜SOD、CAT及POD活性的影響

SOD是一種自由基清除劑，它可以清除細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基()，通過歧化反應(yīng)生成無毒的和毒性較低的H2O2，而H2O2再被CAT或POD進(jìn)一步催化分解為H2O和。圖9為采后青花菜貯藏過程中SOD、CAT及POD活性的變化情況?？梢钥闯觯谡麄€貯藏過程中，CK0、CK1及MT處理組青花菜的SOD、CAT及POD活性整體皆呈波動上升趨勢，在貯藏第4、第6 d時，MT處理組青花菜的SOD、CAT及POD活性均顯著高于CK0、CK1 組（P<0.05）。

2.1 0 褪黑素處理對采后青花菜SOD、CAT及POD同工酶的影響

由圖10a、10b可知，采后青花菜的SOD同工酶出現(xiàn)了 3條譜帶，標(biāo)記為SODⅠ、SODⅡ和 SODⅢ，其遷移率分別為0.25、0.41及0.55。SODⅢ條帶強度較SODⅠ、SODⅡ略高些，說明SODⅢ對SOD活性貢獻(xiàn)較大。在整個貯藏期間，CK0、CK1及MT處理組青花菜SOD同工酶條帶數(shù)量相同，且變化趨勢相一致，為先上升后下降。在貯藏第2、第4 d時，MT處理組青花菜SODⅠ、SODⅡ、SODⅢ條帶強度均明顯高于CK0、CK1組（P<0.05）。

由10c、10d可知，采后青花菜的CAT同工酶只出現(xiàn)了 1條譜帶，其遷移率為 0.16。整體變化趨勢為先上升后下降，貯藏第2、第4 d得以較好的表達(dá)。在貯藏第4 d時，MT處理組青花菜 CAT同工酶條帶強度明顯高于CK0、CK1 組（P<0.05）。

圖9 采后青花菜貯藏過程中SOD、CAT、POD活性的變化Fig.9 Changes of the activities of SOD, CAT, and POD in postharvest broccoli during storage

圖10 采后青花菜貯藏過程中SOD、CAT及POD同工酶的變化Fig.10 Changes of isoenzymes of SOD, CAT, and POD in postharvest broccoli during storage

由圖10e、10f可以看出，采后青花菜的POD同工酶出現(xiàn)了2條譜帶，標(biāo)記為PODⅠ、PODⅡ，其遷移率分別為 0.14、0.34。總體看來，PODⅡ條帶為主條帶，顏色較深，說明這種POD同工酶表達(dá)較好，對POD活性貢獻(xiàn)較大。在整個貯藏期間，CK0、CK1及MT處理組青花菜的POD同工酶數(shù)量相同，且整體變化趨勢相一致，為波動上升，與POD活性變化測定結(jié)果相一致。在貯藏第6 d時，MT處理組青花菜的PODⅠ、PODⅡ條帶強度明顯高于CK0、CK1組（P<0.05）。

3 討 論

青花菜衰老的顯著標(biāo)志為黃化，本研究通過對采后青花菜黃化指數(shù)及色差的測定發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L褪黑素（MT）處理可明顯抑制采后青花菜黃化，使其在貯藏第7 d仍具有較好的商品性質(zhì)，延長了采后青花菜的貯藏壽命。同時，MT處理可顯著延緩采后青花菜葉綠素的降解。與Arnao等[9-11]人研究結(jié)果相互印證。

呼吸強度是衡量采后果蔬呼吸代謝的一個主要指標(biāo)。呼吸速率越高，果蔬的營養(yǎng)物質(zhì)消耗越快[32]，抑制采后果蔬的呼吸活動可有效保持其品質(zhì)[33]。本試驗結(jié)果表明，褪黑素處理可降低采后青花菜的總呼吸強度，延緩青花菜黃化衰老。Gao[13]等采用100 μmol/L褪黑素處理桃果實，同樣發(fā)現(xiàn)褪黑素降低了桃果實的呼吸速率。

糖酵解（EMP）、三羧酸循環(huán)（TCA）、磷酸戊糖（PPP）途徑是底物氧化水平上的 3條呼吸途徑，它們的運行比例與總呼吸強度密切相關(guān)。本試驗表明，貯藏第 4 d時MT處理組青花菜的 EMP、TCA、PPP途徑均顯著低于CK0、CK1組；貯藏第6 d時MT處理組青花菜的TCA途徑顯著低于CK0、CK1組，PPP途徑顯著低于CK1組，說明MT處理對EMP、TCA、PPP途徑的抑制作用體現(xiàn)在貯藏后期，這與總呼吸強度的變化一致。但該研究還有待進(jìn)一步分析。

細(xì)胞色素途徑和交替途徑是電子傳遞鏈上主要的 2條呼吸途徑。本研究表明，在整個貯藏期間細(xì)胞色素氧化途徑（CP）耗氧速率總體呈先上升后下降趨勢，而交替氧化途徑（AP）耗氧速率則呈先下降再上升趨勢。通常AP途徑可作為電子傳遞鏈的一個支路，從而降低組織內(nèi)活性氧水平的積累[34]。因此，本文進(jìn)一步分析了采后青花菜組織中O2?-質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在貯藏后期MT處理組青花菜中O2?-產(chǎn)生速率低于CK0、CK1組，這可能與組織中電子傳遞鏈流向AP途徑有關(guān)。

果實貯藏期間的能量水平對細(xì)胞功能維持非常重要，能量虧缺會引發(fā)組織衰老，反之，可延緩衰老進(jìn)程[30]。Morteza[12]等發(fā)現(xiàn)MT處理可維持草莓果實中較高的能荷水平。本試驗結(jié)果中，在整個貯藏期間 MT處理組青花菜的能荷值始終高于CK0、CK1組，

在正常情況下，植物體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)能夠清除其外界環(huán)境影響和自身衰老所產(chǎn)生的自由基，是動態(tài)平衡過程[35]。在植物衰老或腐敗情況下，提高的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等抗氧化酶能夠清除活性氧代謝的產(chǎn)物，延緩果蔬采后衰老或腐敗[36]。本試驗結(jié)果顯示，MT處理可顯著提高采后青花菜組織內(nèi)SOD、CAT及POD活性，從而抑制H2O2的積累，這與Ma[14]等試驗結(jié)果一致。

SOD對環(huán)境十分敏感，其同工酶譜帶的變化在一定程度上能反映植物抗逆性強弱。CAT和POD同工酶可分解H2O2，防止膜脂過氧化，進(jìn)而保護細(xì)胞[37]。本研究中，MT處理可不同程度提高青花菜組織內(nèi)SOD、CAT及POD同工酶活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。我們也注意到，貯藏過程中，青花菜組織的SOD、CAT及POD同工酶活性與其酶活性變化趨勢未完全一致，其原因仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

1）由黃化指數(shù)和L*、a*、b*值的變化可看出，貯藏至6 d時，2個對照組樣品已失去了商品價值；相比之下，褪黑素處理青花菜在貯藏第 7 d的黃化指數(shù)與對照組貯藏5 d的結(jié)果無顯著性差異，表明褪黑素處理可使青花菜的貯藏壽命由5 d延長至7 d。

2）在底物氧化水平上，褪黑素處理顯著降低了糖酵解、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖呼吸途徑的運行比例，從而減緩了采后青花菜的總呼吸速率；在電子傳遞鏈水平上，褪黑素處理降低了細(xì)胞色素氧化途徑的運行比例，同時提高了交替氧化途徑的運行比例。

3）褪黑素處理維持了采后青花菜組織中較高的三磷酸腺苷、二磷酸腺苷含量及能荷水平，并抑制了組織中O2?-和 H2O2含量的積累，這與其維持組織較高的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶及其同工酶活性有關(guān)。

因此，100 μmol/L褪黑素可用于采后青花菜的保鮮，維持其貯藏品質(zhì)。本研究結(jié)果對于指導(dǎo)青花菜貯藏保鮮具有一定的實際意義，同時也為褪黑素處理的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論支撐。

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