中藥指紋圖譜質(zhì)控方法研究進(jìn)展

趙娟 謝世靜 趙興華 郭明 曹長紅 陳俊榮

摘要：中藥的現(xiàn)代化、國際化是中藥發(fā)展的艱巨任務(wù)和必然趨勢。與現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合的中藥指紋圖譜，用能體現(xiàn)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的化學(xué)物質(zhì)群來綜合評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，符合中醫(yī)藥理論，是國內(nèi)外認(rèn)可的中藥質(zhì)量控制的有效手段。通過詳細(xì)查閱國內(nèi)外學(xué)者在中藥指紋圖譜方面的研究工作，依據(jù)分析技術(shù)和研究內(nèi)容的不同，筆者對(duì)研究頻率較高的中藥化學(xué)和生物指紋圖譜質(zhì)控方法的概念、特點(diǎn)、研究進(jìn)展及其數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行了概述，以期為中藥指紋圖譜質(zhì)控方法的進(jìn)一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué)指紋圖譜;中藥生物指紋圖譜;質(zhì)量控制;數(shù)據(jù)分析

中圖分類號(hào)：R927.1 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ??文章編號(hào)：1007-2349（2020）01-0082-05

1 中藥指紋圖譜質(zhì)控方法的提出

中藥大多源于自然界的生物有機(jī)體，傳統(tǒng)中藥外觀性狀鑒別法具有較大的主觀性，而中藥內(nèi)在化學(xué)組成才是決定其質(zhì)量與藥效的根本。鑒于中藥組成的多樣性和辨證施治的治療方案，檢測任何一種活性成分均不能代表其整體藥效，中藥指紋圖譜能全面、定量地反映中藥所包含的化學(xué)信息，是中藥質(zhì)量控制的有效手段。2000年國家藥監(jiān)局選擇研究難度相對(duì)較低的中藥注射劑試推中藥指紋圖譜質(zhì)控方法，將中藥指紋圖譜定義為：中藥材經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥材特性的共有峰的圖譜[1]。并在樣品制備、測定方法、及指紋圖譜技術(shù)參數(shù)等方面提出了建立指紋圖譜的一些基本原則，規(guī)范了中藥指紋圖譜的研究，開啟了中藥指紋圖譜質(zhì)量控制的新時(shí)代。

目前，中藥指紋圖譜已成為國內(nèi)外公認(rèn)的中藥質(zhì)量控制的重要方法，并被2010年版和2015年版中國藥典一部收錄。本研究通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，對(duì)研究工作較集中的中藥化學(xué)和生物指紋圖譜質(zhì)控方法的概念、特點(diǎn)、研究進(jìn)展及其數(shù)據(jù)處理進(jìn)行總結(jié)。

2 中藥化學(xué)指紋圖譜質(zhì)控方法研究進(jìn)展

中藥化學(xué)指紋圖譜主要研究中藥及其成方制劑化學(xué)成分的種類與數(shù)量，依據(jù)常用分析手段的不同可分為光譜指紋圖譜法和色譜指紋圖譜法。

2.1 光譜指紋圖譜法

2.1.1 紫外光譜指紋圖譜 紫外光譜反映的是含有不飽和鍵的分子吸收紫外光，價(jià)電子從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)所產(chǎn)生的吸收光譜，主要反映分子中不飽和基團(tuán)的性質(zhì)。中藥的藥效成分多含有不飽和基團(tuán)，具有良好的紫外吸收。當(dāng)中藥含有相同成分時(shí)，其紫外光譜指紋圖譜也應(yīng)相似，可用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。李和光[2]建立了寒熱屬性確定的51味中藥的紫外光譜指紋圖譜，歸納出判別寒熱屬性中藥紫外光譜吸收峰的規(guī)律，采用多元統(tǒng)計(jì)法建立寒性、熱性中藥判別模型，探索了能代表中藥寒熱藥性物質(zhì)基礎(chǔ)的紫外光譜指紋圖譜數(shù)字化表征體系，為寒性、熱性中藥的下一步研究提供參考。

2.1.2 （近）紅外光譜指紋圖譜 （近）紅外光譜是分子選擇性吸收某些波長的紅外線，引起分子振、轉(zhuǎn)能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。（近）紅外光譜可提供物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)特征方面的豐富信息，尤其適用于有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)分析。紅外光譜尤其是近紅外光譜具有無損、快速、在線、全面的分析優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。孫國祥等[3]在全面總結(jié)現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，建立了中藥-紅外光譜指紋圖譜-專家系統(tǒng)網(wǎng)格的知識(shí)庫系統(tǒng)、試驗(yàn)方法推薦系統(tǒng)、試驗(yàn)方法優(yōu)化系統(tǒng)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)，并成功應(yīng)用于10個(gè)產(chǎn)地中藥材射干的判別分析。

2.1.3 熒光光譜指紋圖譜 基態(tài)分子吸收能量后躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷的方式將其能量釋放返回基態(tài)時(shí)產(chǎn)生熒光，熒光光譜同樣能反映中藥分子中不飽和基團(tuán)的性質(zhì)。熒光光譜法具有檢測限低、專屬性好、簡單快速等優(yōu)點(diǎn)。不同中藥因所含熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或含量的差異，其熒光光譜具有指紋特征，可用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。史訓(xùn)立[4]掃描了200多種常見標(biāo)準(zhǔn)藥材的三維熒光光譜指紋圖譜，構(gòu)建了中藥三維熒光指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，成功應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2.2 色譜指紋圖譜法

2.2.1 薄層色譜指紋圖譜法 薄層色譜系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層，利用各組分對(duì)同一吸附劑吸附能力不同，通過連續(xù)的吸附、解吸附過程達(dá)到分離目的，以比移值為分析指標(biāo)。薄層色譜具有成本低，對(duì)樣品預(yù)處理要求低、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，非常適合藥物的基層日常分析與現(xiàn)場檢驗(yàn)。1990年版中國藥典引入了對(duì)照藥材的薄層色譜鑒別，獲得的薄層圖譜增加了測定結(jié)果分析的客觀性，具有早期的指紋圖譜鑒別意味。謝培山課題組完成了三種人參類藥材[5]、黃連[6]、高良姜[7]中黃酮類成分，柴胡屬藥材皂苷類成分[8]的薄層色譜指紋圖譜研究，可很好地控制中藥材的質(zhì)量。目前，薄層色譜技術(shù)仍是中國藥典里中藥材鑒別的有力工具，并應(yīng)用于輔助建立多種中藥及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[9]。

2.2.2 氣相色譜指紋圖譜法 氣相色譜是采用氣體作為流動(dòng)相的色譜法。利用待分離組分在氣相和固定相間的分配差異達(dá)到分離目的，以保留時(shí)間為定性指標(biāo)，峰高或峰面積為定量指標(biāo)。氣相色譜法主要適用于含揮發(fā)性成分較多且對(duì)熱穩(wěn)定的中藥和其成方制劑的質(zhì)控研究。戴靜波等[10]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分別建立了10批荊芥油的指紋圖譜，采用聚類分析法進(jìn)行相似度比較，結(jié)果表明氣相色譜指紋圖譜特征明顯，方法準(zhǔn)確可靠，可用于中藥質(zhì)量控制。

2.2.3 高效液相色譜指紋圖譜法 高效液相色譜是20世紀(jì)六十年代后期借鑒氣相色譜理論，在經(jīng)典液相色譜法的構(gòu)造中引入高壓輸液系統(tǒng)，采用小顆粒填充材料發(fā)展起來的，同樣以保留時(shí)間和峰高/峰面積作為定性和定量依據(jù)。高效液相色譜可與多種檢測器聯(lián)用，例如紫外檢測器、熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、二極管陣列檢測器等，分析范圍廣，適用于中藥復(fù)雜組分的分析。此外，由于高效液相色譜檢測器保留了被分離物質(zhì)的完整性，可作為前期分離、提純的手段，進(jìn)一步與質(zhì)譜儀串聯(lián)，為中藥質(zhì)量分析提供更加準(zhǔn)確、可靠的信息。分離效能高、分析范圍廣、分析儀器自動(dòng)化、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，使高效液相色譜成為構(gòu)建中藥指紋圖譜的首選方法。孫露露等[11]建立了12批泰山蟲草藥材高效液相色譜指紋圖譜，并比較不同批次抗腫瘤生理活性差異，發(fā)現(xiàn)了各共有指紋峰與藥效的關(guān)聯(lián)度，并確定核苷類成分是泰山蟲草發(fā)揮抗腫瘤活性的主要成分，可用于泰山蟲草品質(zhì)的綜合研究。

2.2.4 超高效液相色譜指紋圖譜 超高效液相色譜是借助于高效液相色譜的理論及原理，進(jìn)一步縮小了固定相填料粒度且提高了輸液壓力，是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，具有高分析通量、高靈敏度、高自動(dòng)化等特點(diǎn)，尤其適合于中藥復(fù)雜組分的研究。2010年版中國藥典已經(jīng)收載了復(fù)方丹參滴丸超高效液相色譜指紋圖譜鑒別法。范旭航等[12]構(gòu)建了快速分析牡丹皮藥材的超高效液相色譜特征指紋圖譜共有模式，15批次藥材的指紋譜圖重合度較好，表明批次間牡丹皮藥材質(zhì)量較為穩(wěn)定，可用于快速評(píng)價(jià)牡丹皮藥材質(zhì)量。

2.2.5 毛細(xì)管電泳指紋圖譜法 毛細(xì)管電泳法是在高壓直流電場驅(qū)動(dòng)下，根據(jù)待分離組分淌度和分配行為上的差異，在毛細(xì)管分離通道上實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離技術(shù)。具有分析速度快、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，適用于中藥中無機(jī)離子到帶電生物大分子的分析研究。許麗瑩等[13]應(yīng)用區(qū)帶毛細(xì)管電泳法建立了冠心寧注射液對(duì)照指紋圖譜，在最佳電泳條件下，應(yīng)用毛細(xì)管電泳一測多評(píng)技術(shù)在35min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了8批冠心寧注射液中7種主要有效成分的含量測定，此方法可用于全面評(píng)價(jià)冠心寧注射液的質(zhì)量，可為其他中藥注射劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

3 中藥生物指紋圖譜質(zhì)控方法研究進(jìn)展

中藥化學(xué)指紋圖譜能提供中藥化學(xué)組成方面的豐富信息，但存在指紋圖譜與藥效信息脫節(jié)問題，中藥生物指紋圖譜有望解決這一難題。中藥生物指紋圖譜致力于中藥生物遺傳特性和藥理學(xué)研究，旨在闡明中藥的藥效作用機(jī)制及毒理作用機(jī)制，主要包括中藥基因組學(xué)、中藥蛋白質(zhì)組學(xué)和中藥代謝組學(xué)。

3.1 中藥基因組學(xué) 陳士林研究員提出的“本草基因組學(xué)”是中藥基因組學(xué)的前沿研究，它從基因組水平探索中藥和其藥理作用，采用組學(xué)技術(shù)研究中藥基原物種的遺傳信息及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尋找中藥防治人類疾病的分子機(jī)制。陳士林課題組首創(chuàng)基于ITS2的中草藥DNA條形碼鑒定技術(shù)：在全部正品藥材樣品中尋找相同的一段DNA片段進(jìn)行測序，建立該藥材的對(duì)照品數(shù)據(jù)庫，可用于未知樣品或摻雜品的鑒別，具有基因指紋圖譜鑒別意義[14]。該DNA條形碼鑒定技術(shù)已被2010年版和2015年版中國藥典DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則收錄，并編寫專著《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》，力求從基因水平上破解中草藥品種真?zhèn)舞b別的難題[14～15]。

3.2 中藥蛋白質(zhì)組學(xué) 中藥蛋白質(zhì)組學(xué)是在分子水平上研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用的相關(guān)性，可用于中藥質(zhì)量控制及中藥新藥研究。主要包括兩個(gè)方面的研究：一是通過中藥干預(yù)前后蛋白質(zhì)表達(dá)差異譜的研究，尋找中藥的可能靶點(diǎn)相關(guān)蛋白質(zhì)，另一方面是通過不同中草藥及其不同組分蛋白質(zhì)表達(dá)差異的研究，尋找中藥藥用功能的機(jī)制。曹彬[16]構(gòu)建了慢性心力衰竭的大鼠模型，造模成功后隨機(jī)分成4組給予不同治療，研究不同治療方案下各組織的病理改變，利用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選藥物干預(yù)前后慢性心衰大鼠肝臟組織的表達(dá)差異蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明四君子湯能明顯延緩不良條件下肝臟組織的病理變化，提高肝臟線粒體相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，驗(yàn)證并深化了中醫(yī)理論，為進(jìn)一步研究提供了方向。

3.3 中藥代謝組學(xué) 代謝組學(xué)研究的是生物體系受到內(nèi)在和/或外在因素刺激后引發(fā)的內(nèi)源性代謝物質(zhì)改變的學(xué)科，是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的系統(tǒng)生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域。中藥代謝組學(xué)指紋圖譜研究不僅可以反映中藥材化學(xué)組成方面的差異，更重要的是可以通過對(duì)內(nèi)源性代謝物的分析，客觀反映藥效學(xué)或生物效應(yīng)的差異。秦雪梅課題組在中藥的代謝組學(xué)技術(shù)質(zhì)量評(píng)價(jià)方面進(jìn)行了很多前瞻性的研究[17]：分析基原對(duì)柴胡、黃芪藥材質(zhì)量的影響，不同產(chǎn)地、采收期款冬花藥材質(zhì)量的差異比較，遠(yuǎn)志藥材良種定向選育，炮制手段對(duì)柴胡、白芍、醋細(xì)辛質(zhì)量的影響，研究結(jié)果證實(shí)代謝組學(xué)技術(shù)可作為現(xiàn)有藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)手段的有力補(bǔ)充。

4 中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)分析方法研究進(jìn)展

中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)量大，人工辨別耗時(shí)且不客觀。為實(shí)現(xiàn)復(fù)雜指紋圖譜數(shù)據(jù)的科學(xué)解析，專家們提出了多種中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)處理方法。

4.1 化學(xué)模式識(shí)別 化學(xué)計(jì)量學(xué)借助多學(xué)科的理論和方法優(yōu)化化學(xué)量測過程，通過分析實(shí)驗(yàn)獲得的包含大量信息的數(shù)據(jù)，最大限度的提取有效化學(xué)信息[18]。化學(xué)模式識(shí)別是化學(xué)計(jì)量學(xué)的重要組成部分，在中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)分析中應(yīng)用較多的化學(xué)模式識(shí)別方法包括聚類分析法、主成分分析法和偏最小二乘法。

4.1.1 聚類分析法 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法根據(jù)未知樣本的變量特征，以相似度進(jìn)行歸類，主要的聚類指標(biāo)是相關(guān)系數(shù)和距離[18]。由于中藥本身所具有的規(guī)范性較差的特點(diǎn)，其質(zhì)量易受道地性、季節(jié)氣候、采收期、加工方式等多種因素的影響，聚類分析法較早應(yīng)用于中醫(yī)藥研究。冀艷花等[19]建立了15批次白鮮皮藥材的高效液相色譜指紋圖譜，采用聚類分析法可將指紋圖譜分為3類，明確了不同種類間差異較大的化學(xué)成分，可用于白鮮皮藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)。

4.1.2 主成分分析法 利用方差最大原則和降維的思想，將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)互不相關(guān)的綜合變量，即主成分，每個(gè)主成分都能夠反映原始變量的大部分信息，且所含信息互不重疊[18]。主成分分析法將復(fù)雜因素歸結(jié)為幾個(gè)主成分，可以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)降維，簡化問題，在中醫(yī)藥研究中廣泛應(yīng)用。靳怡然等[20]建立了不同產(chǎn)地18批冬凌草藥材的高效液相色譜指紋圖譜，采用主成分分析法和相似度分析法進(jìn)行指紋圖譜數(shù)據(jù)分析，兩種分析方法結(jié)果準(zhǔn)確一致，可用于冬凌草藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)。

4.1.3 偏最小二乘法 以中藥指紋圖譜檢測為例，偏最小二乘法分解數(shù)據(jù)時(shí)不僅考慮中藥提取物含量矩陣和響應(yīng)矩陣，而且在分解含量矩陣的同時(shí)考慮響應(yīng)矩陣以及在分解響應(yīng)矩陣的同時(shí)考慮含量矩陣，從而克服了非線性因素的影響，尤其適用于小樣本多變量的中藥指紋圖數(shù)據(jù)分析。偏最小二乘法被稱為第二代回歸方法，與傳統(tǒng)相似度計(jì)算方法相比，偏最小二乘法得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確，計(jì)算速度更快。張昱[21]通過實(shí)驗(yàn)條件和方法學(xué)優(yōu)化，建立了牛黃上清片高效液相色譜圖譜，結(jié)合偏最小二乘法判別分析和相似度評(píng)價(jià)，實(shí)現(xiàn)了不同廠家、不同批號(hào)牛黃上清片樣品的質(zhì)量研究。同時(shí)利用正交偏最小二乘法研究牛黃上清片指紋圖譜歸一化峰面積與其相對(duì)體外抗內(nèi)毒素活性的譜效關(guān)系，確定了可能的抗內(nèi)毒素活性物質(zhì)。

4.2 中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件 色譜技術(shù)是目前建立中藥指紋圖譜的首選方法，為實(shí)現(xiàn)對(duì)獲得中藥色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)的快速匹配和識(shí)別，專家們分別開發(fā)了多種相似度評(píng)價(jià)軟件[22]。為統(tǒng)一中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)指標(biāo)，2004年3月由國家藥典委員會(huì)牽頭，聯(lián)合指紋圖譜主要科研單位組成開發(fā)小組，綜合各版本軟件優(yōu)勢，開發(fā)了《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》研究版（2004A）和檢驗(yàn)版（2004B）。其中，2004A版本具有生成對(duì)照譜圖的功能多應(yīng)用于科學(xué)研究，2004B版本沒有生成對(duì)照譜圖的功能多應(yīng)用于檢驗(yàn)工作。此相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的推廣促進(jìn)了指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)化研究的進(jìn)程。

4.3 中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫 中藥指紋圖譜的研究工作需要長期大量資料和經(jīng)驗(yàn)的積累，為更好的實(shí)現(xiàn)對(duì)已有研究資料的存儲(chǔ)和共享，專家們采用多種分析技術(shù)對(duì)中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了研究。何淑華等[23]構(gòu)建了由150余幅對(duì)照中藥材紅外光譜圖組成的紅外光譜數(shù)據(jù)庫，可用于中藥材真?zhèn)蔚目焖勹b別。黃新宇[24]使用計(jì)算機(jī)算法研發(fā)了紫外光譜數(shù)據(jù)庫-UVDB2，利用常見化合物的真實(shí)紫外吸收數(shù)據(jù)構(gòu)建了紫外光譜數(shù)據(jù)庫-UV1，實(shí)現(xiàn)了在UVDB2中尋找計(jì)算光譜，在UV1中匹配、預(yù)測化合物不飽和結(jié)構(gòu)信息等功能。劉訓(xùn)紅等[25]歸納整理了已發(fā)表藥學(xué)期刊或相關(guān)專著中3000余幅多種研究方法獲得的中藥指紋圖譜，建立了數(shù)據(jù)廣泛、檢索方便、維護(hù)與更新簡單的中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，更利于數(shù)據(jù)資源共享和日常中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。孫國祥等[26]采用多種開發(fā)環(huán)境和工具，構(gòu)建了中藥指紋圖譜在線專家系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫，涵蓋了中藥材及其制劑常見分析技術(shù)指紋圖譜及其他與中藥藥效、實(shí)驗(yàn)條件、管理等等相關(guān)的大量信息，具有強(qiáng)大的查詢功能，是目前比較先進(jìn)的國內(nèi)中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。

5 展望

中藥質(zhì)量的安全、穩(wěn)定、可控是中藥可持續(xù)發(fā)展和國際化的關(guān)鍵。經(jīng)過廣大學(xué)者近20年的研究，中藥指紋圖譜質(zhì)控方法從研究思路、分析技術(shù)、數(shù)據(jù)處理等方面都取得了非常大的進(jìn)展。以后的研究中，應(yīng)更加注重中藥指紋圖譜化學(xué)信息與生物活性的結(jié)合，加強(qiáng)中藥實(shí)際藥效成分指紋圖譜的生物等效性研究，以便更好地控制中藥質(zhì)量，闡明中藥藥理機(jī)制。

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（收稿日期：2019-10-28）