萼脊蘭SjHMGR基因克隆及表達分析

蔣素華 梁芳 牛蘇燕 張燕 馬杰 袁秀云 崔波

摘? 要：為探究蘭科植物的花香基因，拓展蘭科植物在花香分子育種方面思路。以萼脊蘭花瓣為實驗材料，按照NCBI上登錄的蘭科植物的HMGR基因序列設(shè)計引物，采用RT-PCR和RACE技術(shù)成功克隆萼脊蘭3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（SjHMGR）。采用生物信息學方法，利用內(nèi)參基因EF1a，對SjHMGR基因的時空表達特性進行分析研究。結(jié)果顯示，獲得的SjHMGR基因全長為1892 bp，開放閱讀框為1689 bp，編碼367個氨基酸，登錄號為MK448292;SjHMGR有3個HMG-COA特殊位點，且屬于HMG-COA超基因家族;SjHMGR編碼的蛋白為親水性蛋白;亞細胞定位于線粒體;蛋白質(zhì)2級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，SjHMGR蛋白具有α-螺旋、延伸鏈和不規(guī)則折疊。SjHMGR編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SjHMGR在中間代謝起到非常重要的角色;同源性分析與系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，萼脊蘭SjHMGR蛋白與蘭科的進化距離最近，在同1個分支上。qRT-PCR結(jié)果顯示，SjHMGR基因在根和葉中的表達量很低，在萼片和花瓣中的表達較高，具有時空特異性。

關(guān)鍵詞：萼脊蘭;SjHMGR基因;克隆;表達分析

中圖分類號：S682.31? ? ? 文獻標識碼：A

Cloning and Bioinformatics Analysis of SjHMGR Gene in Sedirea

Japonica

JIANG Suhua， LIANG Fang， Niu Suyan， ZHANG Yan， MA jie， YUAN Xiuyun， CUI Bo*

Institute of Bioengineering， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou， Henan 450044， China

Abstract： In order to explore the floral fragrance genes and develop ideas for molecular breeding of floral fragrance of orchid plants， the petals of Sedirea japonica were used as the experimental materials， and primers were designed according to the HMGR gene sequence of orchid plants registered in NCBI. The 3-hydroxy-3-methyl-glutaric coenzyme A reductase gene （SjHMGR） was cloned successfully by RT-PCR and RACE. The bioinformatics of SjHMGR gene was analyzed. The spatiotemporal expression characteristics of SjHMGR gene were analyzed using the internal reference gene EF1a. The results showed that the length of SjHMGR gene was 1892 bp， the open reading frame was 1689 bp， encoding 367 amino acids， and the login number was MK448292. SjHMGR had three special loci of HMG-COA and belonged to the HMG-COA supergene family. The SjHMGR was a hydrophilic protein in mitochondria. Alpha helix elongated chain and irregular folding were found in the secondary structure. Functional prediction of SjHMGR-encoded proteins revealed that SjHMGR played an important role in intermediate metabolism. Homology analysis and phylogenetic tree analysis showed that the homology of SjHMGR protein was the closest to the evolution of Orchidaceae and on the same branch. The results of qRT-PCR showed that the expression of SjHMGR gene in roots and leaves were very low， and that in sepals and petals was high， which had spatial and temporal specificity.

Keywords： Sedirea japonica; SjHMGR; clone; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.014

萼脊蘭（Sedirea Japonica）是蘭科萼脊蘭屬植物，花朵小，花的顏色優(yōu)雅素凈，有香氣，開花時間4—6月，易栽培且抗性較強[1-2]。萼脊蘭由于其特殊的生長環(huán)境及香氣迷人，成為現(xiàn)在人們追捧的對象，具有巨大的市場空間。蘭科是最大的單子葉植物科之一，有25 000多種，蘭花的香味更是人們喜歡的一大特點。張瑩等[3-4]分析了文心蘭的香氣成分;李崇暉等[5]對4種石斛原生種鮮花的香氣組成成分進行了分析;丁靈等[6]測定了7種秋石斛鮮花香氣中的揮發(fā)性成分;呂素華等[7]分析了11個鐵皮石斛雜交家系鮮花的揮發(fā)性物質(zhì);Hsiao等[8]研究了蝴蝶蘭單萜類生物合成途徑;Huang等[9]研究了蕙蘭香氣物質(zhì)MeJA的釋放規(guī)律。以上研究認為，萜烯類、酯類、醇類和醛類對石斛的花香起著重要作用。從美洲熱帶、非洲熱帶、澳大利亞熱帶和歐洲部分地區(qū)的蘭科花卉中發(fā)現(xiàn)了許多揮發(fā)性成分。但人們對蘭花花香的生物合成途徑還不是很了解。對于控制單子葉植物（蘭花）氣味產(chǎn)生的酶和基因知之甚少，且如果沒有基因組學，理解其中的分子機制可能是無法克服的問題。有文獻記載，已有1700多種揮發(fā)性物質(zhì)從90多種植物中鑒別，主要是萜類、苯丙類化合物、脂肪酸或者氨基酸衍生物[10]。

植物的氣味因揮發(fā)性化合物的數(shù)量、特性和相對量的不同而不同，花香也是在植物與昆蟲、植物與植物、植物與非生物脅迫的相互作用中一個關(guān)鍵的因素，并且在傳粉、果實生長發(fā)育和植物防御方面起到一個關(guān)鍵的作用[11]。在植物花香有關(guān)的酶基因研究進展下面，Dudareva等[11]從仙女扇（Clarkia breweri）中克隆出編碼（S）-芳樟酶醇合成酶基因的全長cDNA，之后花香物質(zhì)等形成的相關(guān)基因如PAAS、BSMT、BEBT、SAMT、BEAT和IEMT等相繼被克隆出來。植物花香物質(zhì)的合成與萜類化合物代謝有關(guān)，根據(jù)萜類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中的異戊二烯數(shù)目可把萜類物質(zhì)分為不同種類[11]?？茖W家們不斷探索發(fā)現(xiàn)了植物萜類化合物的合成主要是由甲醛戊酸途徑（MVP）和脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP）途徑共同合成[12]。在這2個途徑中，最主要的中間產(chǎn)物異戊二烯焦磷酸（IPP）、單萜、倍半萜、二萜、三萜等均是由它產(chǎn)生的化合物[13]。甲醛戊酸（MVA）途徑中的限速酶是還原酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR），這個限速酶可催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A （HMG-CoA）生成甲羥戊酸[14]。關(guān)于HMGR在多種植物中均有深入研究，如從馬鈴薯[15、橡膠草[16]、刺五加[17]、甜瓜[18]、藿山石斛[19]等多種植物中的HMGR被克隆出來。在蹄葉橐吳萜類化合物-紫苑酮的研究中發(fā)現(xiàn)，將N端缺少的HMGR基因在薰衣草中通過轉(zhuǎn)基因過表達，其促進薰衣草精油和植物甾醇的產(chǎn)生[20]。將長春花的HMGR基因轉(zhuǎn)到青蒿中，可使青蒿中青蒿素的含量變多，在煙草中過表達陽春砂的HMGR基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萜類、植醇及甾醇的表達量都明顯增多[21]。大量研究證明，甲醛戊酸途徑的一個關(guān)鍵調(diào)控點是HMGR，但目前關(guān)于HMGR在萼脊蘭花香中的作用研究較少，所以本研究從SjHMGR的全長cDNA開始，并對其進行生物信息學分析和時空表達分析，研究該基因在萼脊蘭花香物質(zhì)合成中的關(guān)鍵作用，為后續(xù)萼脊蘭SjHMGR基因的功能驗證和蘭花新品種培育打下良好的基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實驗材料來源于鄭州師范學院的蘭花工程技術(shù)研究中心。盛花期取萼脊蘭花瓣進行基因片段克隆，并取其苗期根和葉，花蕾期根、葉和花蕾，盛花期的根、葉、花葶、萼片、花瓣、合蕊柱，每個樣品3個生物學重復(fù)，液氮速凍，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

E.coli DH5α感受態(tài)細胞、rTaq DNA聚合酶、T4-DNA連接酶、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RACE擴增試劑盒、質(zhì)粒小提和實時熒光定量表達分析試劑盒等均購自TaKaRa公司。引物的合成和基因測序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

1.2? 方法

RNA的提?。翰捎枚嗵嵌喾又参锟俁NA提取試劑盒對萼脊蘭花瓣進行RNA的提取。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，采用微量紫外可見分光光度計測定RNA的OD260/280及濃度。

HMGR基因保守片段的克?。阂蕴崛〉妮嗉固m花瓣總RNA為模板，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。根據(jù)XP_020579399（蝴蝶蘭）、AGT78194 （霍山石斛）、XP_020705018（鐵皮石斛）物種的HMGR基因保守區(qū)，綜合利用DNA AN 6.0和Primer 5.0生物軟件設(shè)計1對簡并引物，擴增SjHMGR保守片段。最后將擴增出來的基因片段進行電泳檢測和菌液測序。

SjHMGR全長基因克隆及ORF驗證：以萼脊蘭的花瓣cDNA 為PCR擴增模板，利用RACE技術(shù)分別擴增SjHMGR的5端和3端序列，將擴增產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，電泳檢測及菌液測序。將測序正確的HGMR基因保守片段、5端和3端序列利用DNAMAN軟件拼接得到HGMR基因序列全長，根據(jù)獲得的全長序列，設(shè)計1對引物 HMGR-F2和 HMGR-R2，進行ORF擴增，用于HGMR基因全長序列驗證（引物見表1）。

1.3? 生物信息學分析

開放閱讀框的預(yù)測采用ORFfinder;基因相似性分析采NCBI上的BLAST;氨基酸序列比對分析采DNAMAN;蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析采用ProtParam;蛋白質(zhì)親疏水性采用ProtScale程序分析;亞細胞定位分析采用用TargetP軟件和PSO RTⅡ;SjHMGR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和功能分析預(yù)測采用ProtFun。蛋白質(zhì)2級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用ExPASy網(wǎng)站上的GOR;蛋白質(zhì)3級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SWISS- MODEL進行分析預(yù)測。

1.4? SjHMGR基因的時空表達分析

根據(jù)SjHMGR基因全長序列設(shè)計特異性較強的qRT-PCR引物，參照SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ使用說明，利用qRT-PCR的方法檢測SjHMGR基因在萼脊蘭不同發(fā)育階段及不同器官的表達量。EF1a作為內(nèi)參基因，計算該基因的相對表達量。目的基因SjHMGR和內(nèi)參基因EF1a的退火溫度均為58 ℃，每個樣品3個生物學重復(fù)，蒸餾水做為陰性對照，反應(yīng)體系共為20 L，反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共41個循環(huán)，PCR結(jié)果按照相對表達量Rel. Exp=2ΔΔCT計算，式中ΔCT=CT （HMGR）?CT （EF1a RNA），ΔΔ CT=（各植物組織ΔCT）?（萼片ΔCT） [20-21]。qRT-PCR引物及參數(shù)見表2。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 萼脊蘭總RNA的提取

由圖1可知提取的花瓣總RNA具有完整的28 S、18 S和5 S條帶，說明提取的總RNA完整性好，很少降解。OD260/280的值為1.99，濃度為98.7 ng/μL。

2.2? SjHMGR基因克隆和蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

以花瓣總cDNA為模板，對保守區(qū)片段進行PCR擴增，得到1個1358 bp基因片段（圖2A），利用RACE擴增技術(shù)，根據(jù)設(shè)計的3′端和5′端特異性引物，擴增出5′端（圖2B）和3′端（圖2C）的目的片段。DNAMAN軟件進行序列拼接得該基因的全長為1892 bp，ORFfinder分析發(fā)現(xiàn)，該基因序列共有7個ORF，最長的ORF為1689 bp，包含115 bp的5′-UTR、88 bp的3′-UTR。利用全長基因序列設(shè)計的引物擴增出ORF片段1716 bp，陽性質(zhì)粒命名為pGEM-HMGR，說明全長Sj HMGR基因序列拼接正確。理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，SjHMGR蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為60.06 kDa，等電點為7.43;氨基酸結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，SjHMGR有3個HMG-COA特殊位點，且屬于HMG-COA超基因家族。

2.3? SjHMGR蛋白質(zhì)的親疏水性分析

蛋白質(zhì)的親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，SjHMGR蛋白質(zhì)序列具有較強的疏水性，其中第88位的親水性最強（2.767），第552位的疏水性最強（2.567），整體來看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，并且多于疏水性的氨基酸。因此，整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性，可認為該酶是親水性蛋白。

2.4? SjHMGR編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測與分析

分析預(yù)測SjHMGR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能及功能分類發(fā)現(xiàn)，可能有意義的功能主要有作為細胞被膜、脂肪酸代謝、翻譯功能、中間代謝、合成輔酶因子等，其幾率分別是11.180、5.831、4.361、4.224、4.143。這表明SjHMGR在中間代謝中起到了一個很重要的角色，在脂肪酸代謝、翻譯過程中起到較為重要的作用，在輔酶因子的生物合成中也起到了關(guān)鍵性作用。

2.5? SjHMGR編碼蛋白質(zhì)的2級、3級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)2級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果表明，α-螺旋所占比率為27.05%，延伸鏈所占比率為24.02%，不規(guī)則折疊所占比率為48.93%（圖3）。以1dq9.1.C為模板進行蛋白3級結(jié)構(gòu)建模，該蛋白質(zhì)以X-RAY 2.80 ?的方法產(chǎn)生，覆蓋率為74%，模板與SjHMGR蛋白一致性為57.31%（圖4）。

2.6? 氨基酸序列同源性分析

通過BlastP對HGMR蛋白進行序列同源比對分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白在氨基酸水平上與蘭科植物的HG MR蛋白具高度同源性，其中與蝴蝶蘭（XP_020 57 9399）蛋白的同源性最高（96%），與霍山石斛（AG T78194）的蛋白同源性為87%，與鼓槌石斛（AHI 88624）的蛋白同源性為87%（圖5）。進一步利用MEGA 6.0軟件，采用相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，

根據(jù)氨基酸序列進行親緣關(guān)系分析結(jié)果顯示，萼脊蘭SjHMGR蛋白與蝴蝶蘭（P. Sequestris XP_020 579399）、與霍山石斛（D. huoshanense AGT 78 1 9 4）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum AHI88624）、鐵皮石斛（D. officinale XP 020705018）的HMGR蛋白處于同1個分支上，其中與蝴蝶蘭的親緣關(guān)系最近（圖6）。

2.7? 萼脊蘭SjHMGR基因的時空表達分析

實時熒光定量PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGR基因的表達具有時空特異性。在萼脊蘭的營養(yǎng)器官中，葉片、根中SjHMGR基因表達量很低，幾乎為

零（圖7）;在花蕾期，花蕾中表達量也接近與零;盛花期，SjHMGR基因的表達具有明顯組織特異性，花葶和合蕊柱中幾乎不表達，萼片、花瓣中表達量較高，萼片的表達量高于花瓣的表達量，花葶和合蕊柱中的表達幾乎為零（圖8）。總之，SjHMGR

基因主要在萼片中表達，花瓣中的表達量低于萼片的表達量，同時也說明SjHMGR基因在盛花期才表達，處于苗期和花蕾期的SjHMGR基因是幾乎不表達的。

3? 結(jié)論

萼脊蘭屬于蘭科中較適宜觀賞的一種附生蘭，因其花具有濃郁花香，深受人們喜愛。與氣味相關(guān)的萜類合成基因GPPS、DXR、DXS、TPS研究較多，而3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）作為萜類成分甲羥戊酸（MVA）合成途徑上第1個重要限速酶，對植物萜類活性成分生物合成過程起著至關(guān)重要的作用，所以研究HMGR基因的功能與生理學特性具有深遠的意義[22]。大量研究表明：倍半萜類物質(zhì)的合成與HMGR活性呈正相關(guān)，提高植物體內(nèi)HMGR基因的表達水平可顯著提高倍半萜類物質(zhì)的含量[23]。研究發(fā)現(xiàn)，倍半萜類化合物生物的合成主要通過甲羥戊酸（MVA）途徑，HMGR是MVA合成途徑中的關(guān)鍵基因，對甲羥戊酸代謝“碳流”的調(diào)控起到重要的作用，如果改變HMGR活性可會有效調(diào)控萜類化合物的含量[24]。

試驗成功克隆萼脊蘭SjHMGR基因，全長1892 bp，開放閱讀框1689 bp，編碼367個氨基酸，分子質(zhì)量為60.06 kDa，等電點為7.43;SjHMGR編碼的蛋白為親水性蛋白;SjHMGR有3個HMG-COA特殊位點，且屬于HMG-COA超基因家族;蛋白質(zhì)2級結(jié)構(gòu)分析α-螺旋占27.05%，延伸鏈占25.02%，不規(guī)則折疊占48.93%。

已有研究表明，SjHMGR 基因在不同植物組織的表達模式表現(xiàn)出較大的差異性，在人參的花中表達量最高，莖中的表達量最低[24];在露水草的根和葉中的表達豐富[25]。萼脊蘭SjHMGR基因的表達研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)器官根和葉中的表達量很低，生殖器官萼片和花瓣的表達量較高，花蕾和花葶中沒有表達，結(jié)果顯示SjHMGR基因只有在盛花期才有表達，花蕾期的表達幾乎為零，與丁靈等[6]研究的蝴蝶石斛蘭‘日出2號主要發(fā)香部位是萼片，合蕊柱基本不發(fā)香的研究結(jié)果一致，但研究中也指出不同品種的石斛蘭花朵花瓣基本均是主要發(fā)香部位，說明不同品種蘭花的發(fā)香部位不一樣。為進一步研究萼脊蘭的發(fā)香部位提供了新的思路。本研究結(jié)果還顯示，SjHMGR在中間代謝中起到了一個很重要的角色，在脂肪酸代謝、翻譯過程中起到較為重要作用，在輔酶因子的生物合成中也起到了關(guān)鍵作用，相信該研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)均為萼脊蘭SjHMGR基因的功能驗證和新品種的培育打下良好的基礎(chǔ)。

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