間作木薯對橡膠樹根際土壤真菌群落結構的影響

劉子凡 劉培培 閆文靜 馬小偉

摘? 要：研究間作木薯對橡膠樹根際土壤真菌群落多樣性變化規(guī)律，為判斷膠園間作木薯的可行性提供理論支撐。以橡膠與木薯間作為處理，橡膠單作為對照，采用傳統(tǒng)方法和高通量測序技術分析橡膠樹根際土壤理化性狀及真菌群落結構。結果表明：（1）間作模式下橡膠樹根際土壤的堿解氮、速效磷、速效鉀、有機質含量和真菌Shannon指數(shù)顯著降低，真菌Simpson指數(shù)顯著提高，pH和Chao1指數(shù)雖有降低，但差異未達到顯著水平;（2）門分類水平上，2個處理的橡膠樹根際土壤真菌群落結構組成相近，共有的3大優(yōu)勢菌門均為Ascomycota、Zygomycota和Basidiomycota。間作木薯降低了橡膠樹根際土壤中Zygomycota和Basidiomycota的相對豐度，但提高了Ascomycota相對豐度，達到91.54%;（3）屬分類水平上，2個處理中相對豐度比例前10的優(yōu)勢菌屬占所有檢測出菌屬的61.30%～65.59%，間作木薯提高了橡膠根際土壤中Phyllosticta、Gibberella和Lecythophora的相對豐度;（4）土壤堿解N、速效P和速效K含量對橡膠樹根際土壤中真菌群落α-多樣性產(chǎn)生影響，土壤真菌多樣性變化與土壤有機質含量有關。因此，間作木薯增加了植物對土壤礦質營養(yǎng)元素的吸收，導致橡膠樹根際土壤肥力下降，進一步降低了橡膠樹根際土壤真菌的群落多樣性，同時增加了病原真菌的豐度。

關鍵詞：橡膠木薯間作;高通量測序;根際土壤;真菌群落結構

中圖分類號：S794.1; S154.3? ? ? 文獻標識碼：A

Effects of Rubber-cassava Intercropping on Soil Fungal Community Structure in Rhizosphere of Rubber Trees

LIU Zifan， LIU Peipei， YAN Wenjing， MA Xiaowei

College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： To explore the effect of rubber-cassava intercropping on the soil fungal community structure in the rhizosphere of rubber trees， the soil physiochemical properties， fungal community structure in the rhizosphere of rubber trees were analyzed by traditional and high-throughput sequencing techniques. Compared to rubber monoculture， the contents of soil alkalide N， available P， available K， organic matter and Shannon index of fungal diversity in the rhizosphere of rubber trees of rubber-cassava intercropping were significantly decreased， but the Simpson index was significantly increased. In addition， there were no significant differences for soil pH and chao1 index. Ascomycota， Zygomycota and Basidiomycota were the three dominant fungi at phylum level for both intercropping and monoculture treatments， but compared to monoculture， the relative abundance of Zygomycota and Basidiomycota were decreased， and Ascomycota was increased to 91.54% in intercropping treatment. At the genus level， the top 10 fungal genera accounted for 61.30%65.59% of the total genera. The relative abundance of Phyllosticta， Gibberella and Lecythophora were higher in the intercropping treatment. The α-diversity of fungi was not only interfered by the content of soil alkalide nitrogen， available phosphorus and potassium， but was also affected by the content of soil organic matter. It indicated that rubber-cassava intercropping significantly decreased soil nutrients content and fungal diversity in the rhizosphere of rubber trees. Meanwhile， the relative abundance of soil pathogenic fungi in the rhizosphere was also enriched by intercropping treatment.

Keywords： rubber tree intercropping with cassava; high-throughput sequencing; rhizosphere soil; fungal community structure

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.026

橡膠林是我國種植面積最大的熱帶經(jīng)濟林，是熱區(qū)農(nóng)林經(jīng)濟的重要來源[1]。林下經(jīng)濟是一種投入小、見效快的人工生態(tài)經(jīng)濟復合系統(tǒng)[2]。由于木薯耐瘠薄，可在荒山荒坡種植等，因此，于幼齡膠園間作木薯模式受到了膠農(nóng)的關注和重視[3-4]。但有學者認為，幼齡膠園間作木薯會引起膠園地力減退[5]、橡膠棒孢落葉病和白根病等真菌病害的互相傳染[6-7]，嚴重影響著這一模式的推廣與應用。土壤微生物在控制植物養(yǎng)分利用率和土壤質量方面起著重要作用[8]。土壤微生物的種類、數(shù)量和活性可以全面、真實地反映土壤的營養(yǎng)狀態(tài)[9]，土壤微生物多樣性與植物的健康緊密相關[10]。

目前，前人僅從木薯化感物質對橡膠樹棒孢落葉病和白根病病菌影響的角度闡述了膠園間作木薯合理與否[11-12]。土壤根際屬于特殊的生態(tài)系統(tǒng)，是有益及有害微生物與宿主植物發(fā)生復雜相互作用的微小生態(tài)系統(tǒng)[13]。土壤真菌是土壤微生物的主要成員，植物病害中，大部分病害是由真菌侵染引起[14]，因而土壤真菌的群落結構可作為土壤生態(tài)狀況的生物指標。鑒于此，本研究以間作木薯1年的膠園為研究對象，采用傳統(tǒng)方法和高通量測序技術，分析橡膠樹根際土壤理化性狀及真菌群落結構，探究橡膠與木薯間作模式下，橡膠樹根際土壤真菌群落結構的變化規(guī)律，為判斷膠園間作木薯的可行性提供一定的理論支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

木薯品種為‘華南8號，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所提供;橡膠品種為‘熱研7-33-97，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所提供。

1.2? 方法

1.2.1? 土壤樣品采集? 土壤樣品采集地點位于海南省文昌市邁號鎮(zhèn)鳳池村橡膠林地（北緯19.56°，東經(jīng)110.76°）。該林地為平地，四周生境一致，土壤類型為紅壤，試驗前對樣地多點采樣，測定土壤理化性質，控制其變異系數(shù)在10%以內。林地土壤基本理化性質：pH 4.8、有機質6.88 g/kg、堿解氮58.82 mg/kg、速效磷29.78 mg/kg、速效鉀64.30 mg/kg。橡膠樹定植時間為2016年3月，種植規(guī)格為4.6 m×5.0 m，采用一行橡膠樹4行木薯的間作模式，木薯株行距為0.8 m×0.7 m，未施任何肥料。

2017年2月26日收獲木薯，2月28日采集土樣。具體方法為：排除邊行橡膠樹，于每種種植模式中隨機選取面積為23 m×25 m的3個樣方，從每個樣方中隨機選取橡膠樹3株，完整挖出橡膠植株，輕抖后刮取根表土作根際土，同一樣方內的土樣混合均勻作為1個混合樣，樣品采集后低溫運輸至實驗室。將采集的土壤過1 mm篩，混勻后分成2份裝入自封袋中，1份用于土壤微生物的測定，另1份經(jīng)室內通風處風干，用于土壤基本理化性質指標的測定。

1.2.2? 土壤基本理化性質的測定? 土壤基本理化性質的測定，參照鮑士旦[15]方法。pH采用電位法;有機質含量采用重鉻酸鉀外加熱法;堿解氮含量采用堿解擴散法;速效磷含量采用鉬銻抗比色法;速效鉀含量采用火焰光度計法。

1.2.3? 土壤微生物基因組DNA提取和宏基因組測序? 土壤總DNA提?。喊凑誐oBio土壤提取試劑盒（MoBio Power Soil extraction kit，Carl sbad，CA，USA）操作說明書提取土壤樣品總DNA，20 ℃保存?zhèn)溆谩U增方法參考Agrios[14]。18S rDNA（NS1- FUNG）區(qū)擴增引物：NS1（5CCTA CACG A CGCT C TTCCGATCTN3）、Fung（5GACTG GA G T T C CT T G GCACCCGAGAATTCCA3）。PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程股份有限公司完成Miseq測序。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

土壤微生物Alpha多樣性指標包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，各指數(shù)的計算方法參考史芳芳等[13]。數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件，統(tǒng)計分析采用SAS 9.4軟件。

2? 結果與分析

2.1? 間作木薯對橡膠樹根際土壤理化性質的影響

從表1可知，間作木薯膠園中橡膠樹根際土壤與單作膠園中橡膠樹根際土壤相比，堿解氮、速效鉀、速效磷和有機質含量顯著降低，而pH雖有下降，但兩者之間未達到顯著差異。

2.2? 根際土壤真菌群落多樣性分析

2.2.1? 測序質量? 間作和單作模式下橡膠樹根際土壤真菌群落多樣性的測序質量見表2。從表2

可知，間作和單作模式下橡膠樹根際土壤的原始序列分別為91 027和83 779條;去除低質量序列、Barcode序列和引物序列后，得到的有效序列數(shù)無明顯差異，分別為87 609和73 883條有效序列;經(jīng)過RDP數(shù)據(jù)庫的注釋及OTU分析后，分別獲得1010和1132個真菌OTU，且差異未達到顯著水平。2個處理的土壤測序文庫覆蓋率無明顯差異，且均大于0.99，說明測序結果很合理，更深的測序幾乎不會產(chǎn)生更多的OTU，土壤的測序文庫已達到飽和。

2.2.2? 根際土壤真菌α-多樣性指數(shù)分析? 生物種群豐富和多樣性指數(shù)高是生態(tài)環(huán)境健康穩(wěn)定的重要表現(xiàn)[16]。α-多樣性指數(shù)包括群落分布豐度指數(shù)Chao1指數(shù)和群落分布多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)[13]，Chao1指數(shù)越大，表明群落豐富度越大;Shannon指數(shù)值越大，表示該樣品中的物種越豐富，說明群落多樣性越高;Simpson指數(shù)值越大，說明生物群落內不同種類生物數(shù)量分布越不均勻，優(yōu)勢生物的生態(tài)功能越突出[17]。橡膠樹根際土壤真菌Alpha多樣性指數(shù)差異見表3。

表3表明，與單作模式下橡膠樹根際土壤相比，間作模式真菌Simpson指數(shù)增加了13.35%，真菌Shannon指數(shù)降低73.39%，兩者均達到顯著水平（P<0.05）;雖真菌Chao1指數(shù)降低12.94%，但兩者未達到顯著差異。以上結果說明，間作木薯可在一定程度上降低橡膠樹根際土壤真菌群落豐富度與多樣性，即間作木薯后，橡膠樹根際土壤的真菌物種數(shù)下降，群落多樣性水平降低。

2.2.3? 根際土壤真菌在門分類水平上的分布差異? 2種種植模式膠園中橡膠樹根際土壤真菌群落組成在門分類水平上的差異見圖1。由圖1可知，2種模式下橡膠樹根際土壤真菌群落結構組成相近。優(yōu)勢真菌門主要為Ascomycota、Basidio m y c ota、Zygomycota、Chytri diomycota、Glomer o m y cota、Blastocladiomycota和Neocallima stigo my cota，還有一部分是目前還未知的真菌。但各真菌類群所占比例相差較大，Ascomycota、Ba si di omycota、Zygomycota三者的相對豐度間作模式下橡膠樹根際土壤達96.83%，單作模式下橡膠樹根際土壤達84.22%;其中間作模式下橡膠樹根際土壤Ascomycota相對豐度為91.54%，大于單作模式下的66.55%，但單作模式下橡膠樹根際土壤Basidiomycota相對豐度為11.20%，遠大于間作模式下的4.29%，Zygomycota相對豐度為5.59%，大于間作模式下的0.73%。

2.2.4? 根際土壤真菌在屬分類水平上的分布差異

2種模式下橡膠樹根際土壤真菌優(yōu)勢物種在屬分類水平上的相對豐度如圖2所示。2種模式下橡膠樹根際土壤真菌群落結構組成相近，10個優(yōu)勢真菌菌屬分別為Phyllosticta、Gibberella、Asper gi llus、Lecythophora、Microascus、Ochroconis、Penic illium、Chamaeota、Trichoderma和Pithoascus，占根際土壤真菌OTU總數(shù)的61.30%～65.59%。但主要優(yōu)勢屬所占比例相差較大，其中間作木薯模式下橡膠樹根際土壤Phyllosticta相對豐度為41.74%，大于單作模式下的18.06%，Gibberella相對豐度為15.84%，大于單作模式下的8.45%;Aspergillus相對豐度為0.40%，小于單作模式下的8.59%;Lecythophora相對豐度為6.18%，大于單作模式下的3.87%。

2.3? 根際土壤真菌群落結構與根際土壤理化性質的相關性

2.3.1? 土壤真菌α-多樣性指數(shù)與土壤理化性質的相關性? 真菌的生長受土壤環(huán)境因子的影響[18]。根際土壤真菌群落多樣性與根際土壤理化性質間的相關性見表4。OTU、Chao1指數(shù)和Shan non 指數(shù)與土壤堿解N和速效磷含量呈極顯著的負相關;OTU和Chao1指數(shù)與土壤速效K含量分別呈顯著與極顯著的負相關。以上結果說明，橡膠樹根際土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量是影響根際土壤真菌群落多樣性的主要土壤肥力因子。

2.3.2? 土壤優(yōu)勢真菌門水平占比與土壤理化性質的相關性? 土壤微生物的群落組成和結構特征主要受土壤理化因子的影響[19]。從表5可知，Ascomycota僅與土壤有機質含量呈顯著負相關，與土壤pH、堿解氮、速效磷和速效鉀含量無顯著相關;Basidiomycota、Zygomycota和Chytridio my cota與土壤pH、堿解氮、速效磷、速效鉀和有機質含量均無顯著相關;Glomeromycota與土壤堿解氮和速效磷含量呈顯著的負相關，與土壤pH、速效鉀和有機質含量無顯著相關。

3? 討論

3.1? 間作木薯對橡膠樹根際土壤真菌α-多樣性的影響

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和最具影響力的組分之一[20]。本研究中，與單作模式下橡膠樹根際土壤相比，間作模式真菌Shannon指數(shù)顯著降低，真菌Simpson指數(shù)顯著增加，說明間作木薯可使橡膠樹根際土壤真菌物種下降?；形镔|可直接或間接影響土壤微生物的菌落結構、數(shù)量、組成和微生物多樣性[21]。根際是土壤中受根系分泌物影響的狹窄地帶[22]。間作木薯后橡膠樹根際土壤真菌物種下降的原因可能與間作后，土壤中增加了木薯根系分泌物，或改變了橡膠樹根系分泌物的種類和數(shù)量有關。

3.2? 間作木薯對橡膠樹根際土壤真菌群落組成的影響

大量研究表明，植物土傳病害的病原菌多為真菌[23]，真菌相對數(shù)量的降低對減輕橡膠病害起到一定的積極作用[24]。但真菌種類不同，在土壤中發(fā)揮的作用也不同[25]，據(jù)營養(yǎng)方式的不同可將真菌分為腐生營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型和病原型[18]。所以，不能簡單地以真菌數(shù)量的降低或增加來判斷對植物病害的影響。

Ascomycota大多為腐生營養(yǎng)型真菌[26]，是土壤中動植物殘體的主要分解者，在養(yǎng)分循環(huán)方面起著重要作用[27]。本研究表明，間作木薯后，橡膠樹根際土壤的Ascomycota相對豐度增加，達到91.54%。雖然Ascomycota能促進養(yǎng)分循環(huán)，但由于橡膠樹根際土壤真菌結構已變得相對單一，這一點從土壤真菌α-多樣性數(shù)據(jù)同樣可知，進而極大可能地影響著橡膠樹病害的發(fā)生及其生長發(fā)育。Yelle等[26]研究表明，Basidiomycota能很好地降解木質纖維素，與植物形成菌根，促進根系對水分和礦質元素的吸收，改善土壤的物理性質，同時分泌抗菌物質抑制土壤病原菌的生長，保護宿主植物免受病原菌侵襲[27];Zygomycota能促進根系對營養(yǎng)元素的吸收和有機物質分解，提高土壤中有機質和養(yǎng)分含量，有利于根系生長[25];所以，間作木薯后橡膠樹根際土壤Basidiomycota和Zygomycota相對豐度的下降，在一定程度上也影響著橡膠樹的生長發(fā)育。

Phyllosticta可寄生于高等植物上引起植物的葉枯、莖枯、根腐、花腐和果腐等，是農(nóng)作物和其他經(jīng)濟作物的重要病原菌[28];Gibberella是鐮刀菌的有性階段，可引起具有破懷性的植物病害[29];而Aspergillus微生物的代謝產(chǎn)物能有效抑制27種農(nóng)作物病原菌的生長，相關曲霉可以改善土壤[30]。本研究結果表明，間作模式下橡膠樹根際土壤的Phyllosticta和Gibberella相對豐度增加，Aspergillus相對豐度減小，說明間作木薯后橡膠樹根際土壤的致病真菌相對豐度增加。

3.3? 根際土壤理化因子與根際土壤真菌結構相關性的分析

不同的種植模式可以通過對土壤的理化性質、微生物的環(huán)境條件和作物間化感作用來改變土壤微生物的群落結構和功能[31]。Güsewell等[32]研究表明，在低N、P豐富環(huán)境中，細菌活性明顯高于真菌，而在高N、P匱乏環(huán)境中，真菌活性則顯著高于細菌。本研究的根際土壤堿解N含量大于150 mg/kg，速效P含量大于20 mg/kg，含量均豐富，其環(huán)境更利于細菌的生長，從而導致真菌α-多樣性降低。

參考文獻

鄭定華， 袁淑娜， 陳俊明， 等. 橡膠林下間作廣金錢草的產(chǎn)量及藥材質量研究[J]. 中藥材， 2017， 40（12）： 2765-2771.

劉? 敏， 張廣宇， 張永北， 等.竹蓀間作對橡膠園土壤微生物區(qū)系與群落功能多樣性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2018， 46（13）： 295-298.

黃? 潔， 周建國， 林世欣， 等. 對膠園間作木薯的思考及展望[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報， 2014， 26（1）： 64-68， 71.

林位夫， 曾憲海， 謝貴水， 等. 關于橡膠園間作的思考與實踐[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)， 2011（4）： 11-15.

Larsonde R A. Introduction to floriculture[M]. New York： Academic Press， 1980.

蔡吉苗， 陳? 瑤， 潘羨心， 等. 海南橡膠樹棒孢霉落葉病病情調查與病原鑒定[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學， 2008， 28（5）： 1-7， 10.

楊國峰. 加蓬的膠糧間作系統(tǒng)[J]. 世界熱帶農(nóng)業(yè)信息， 2000（6）： 1-2.

方? 敏， 徐小蓉， 唐? 明， 等. 馬纓杜鵑根系微生物群落結構及其變化[J]. 微生物學報， 2019， 59（8）： 1522-1534.

孫啟武， 毛? 琪. 淺析微生物對土壤肥力的貢獻[J]. 農(nóng)技服務， 2015， 32（9）： 96.

Yang H W， Li J， Xiao Y H， et al. An integrated insight into the relationship between soil microbial community and tobacco bacterial wilt disease[J]. Frontiers in Microbiology， 2017， 8： 2179.

劉培培， 劉子凡， 劉喬穎， 等. 木薯器官及其混合物水浸提液對橡膠樹棒孢霉落葉病病菌的化感作用[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（2）： 338-342.

閆文靜， 劉子凡， 張婷婷， 等. 木薯器官及其腐解物水浸液對橡膠樹白根病病菌的化感作用[J]. 熱帶作物學報， 2019， 40（1）： 123-129.

史芳芳， 李向泉. 葡萄根際土壤真菌群落多樣性分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報， 2019， 21（7）： 47-58.

Agrios G N. Plant Pathology[M]. 5th ed. US： Academic Press， 2005.

鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 3版. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2008.

高? 東， 何霞紅. 生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性研究進展[J]. 生態(tài)學雜志， 2010， 29（12）： 2507-2513.

扈進冬， 吳遠征， 魏艷麗， 等. 木霉拌種劑對小麥根際土壤真菌群落多樣性的影響[J]. 山東科學， 2019， 32（1）： 46-51.

Deacon J. Introduction： the fungi and fungal activities[M]//Deacon J. Fungal Biology. Malden， MA： Blackwell Publishing Ltd， 2013： 1-15.

李? 橋. 基于高通量測序技術下土壤微生物群落結構的研究[D]. 濟南： 山東師范大學， 2014.

李旭銳， 張? 燕， 張? 杰， 等. 蘋果園不同間作模式對土壤理化性質及微生物群落的PLFA分析[J]. 北京農(nóng)學院學報， 2019， 34（3）： 30-36.

Concha Meyer A， Eifert J D， Williams R C， et al. Shelf life determination of fresh blueberries （Vaccinium corymbosum） stored under controlled atmosphere and ozone[J]. International Journal of Food Science， 2015， 2015： 164143.

Berendsen R L， Pieterse C， Bakker P. The rhizosphere microbiome and plant health[J]. Trends in Plant Science， 2012， 17（8）： 478-486.

Ahonsi M O， Agindotan B O， Gray M E， et al. First report of basal stem rot and foliar blight caused by Pythium sylvaticum on Miscanthus sinensis in Illinois[J]. Plant Disease， 2011， 95（5）： 616.

徐江兵， 林先貴， 王一明， 等. 施用茶樹菇栽培廢料對青菜土壤中微生物學特征的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報， 2012， 31（1）： 131-136.

秦立金， 于田田， 王佳明， 等. 黃瓜與西芹間作對黃瓜土壤真菌 ITS 多樣性分析[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報（中英文）， 2019， 27（4）： 529-536.

Yelle D J， Ralph J， Lu F C， et al. Evidence for cleavage of lignin by a brown rot basidiomycete[J]. Environmental Microbiology， 2008， 10（7）： 1844-1849.

張? 敏， 周? 鵬， 季永華. 苦楝一小麥農(nóng)林復合生態(tài)系統(tǒng)土壤真菌群落結構分析[J]. 林業(yè)科學， 2015， 51（10）： 26-34.

于 莉， 鮑文杰， 張? 英， 等. Phoma和Phyllosticta兩屬分類的研究進展[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報， 1995， 17（4）： 102-107.

崔云鳳， 黃? 云， 蔣伶活. 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上幾種重要的赤霉屬真菌研究進展[J]. 中國農(nóng)學通報， 2007， 23（7）： 441-446.

周小露， 宋麗莎， 王利榮， 等. 黔南州茶園土壤中優(yōu)勢菌株煙曲霉的分離·純化及鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2018， 46（22）： 115-118.

Vargas G S， Meriles J， Conforto C， et al. Response of soil microbial communities to different management practices in surface soils of a soybean agroecosystem in Argentina[J]. European Journal of Soil Biology， 2011， 47（1）： 55-60.

Güsewell S， Gessner M O. N∶P ratios influence litter decomposition and colonization by fungi and bacteria in microcosms[J]. Functional Ecology， 2009， 23（1）： 211-219.