丹艾痛經(jīng)貼的提取工藝研究

宋軍帥， 張文峰，甘興華，王 欣，魏永利，李克明

（1.乳山市人民醫(yī)院，山東 乳山 264500；2.鄆城縣中醫(yī)醫(yī)院，山東 鄆城 274700；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；4.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014）

痛經(jīng)是年輕女性中最常見的婦科疾病，是指行經(jīng)前或行經(jīng)期出現(xiàn)下腹墜、脹痛、伴有腰酸或其他不適，重癥者伴有四肢發(fā)冷、寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、暈厥等癥狀。

西醫(yī)認(rèn)為痛經(jīng)的主要影響因素為：機(jī)械因素、免疫因素、遺傳因素等[1-2]；中醫(yī)則將痛經(jīng)歸屬于“經(jīng)行腹痛”的范疇。對(duì)于痛經(jīng)的辨證分型，中醫(yī)學(xué)者依據(jù)虛、實(shí)、寒、熱與血?dú)忾g相互交錯(cuò)的聯(lián)系將痛經(jīng)分為氣滯血疲、寒濕凝滯、濕熱疲阻、氣血虛弱、肝腎虛損[3]。

西醫(yī)在治療上通常采用非甾體抗炎藥（NSAID）、避孕藥等緩解癥狀，不良反應(yīng)多。中藥治療痛經(jīng)則有獨(dú)到之處，但是傳統(tǒng)的湯劑往往攜帶、服用不便，影響了療效發(fā)揮。通過劑型改革，研制出多種療效可靠、服用方便、利于攜帶的貼劑、沖劑、膠囊等新劑型。貼劑具有使用方便、起效迅速、作用集中、持久且副作用小等特點(diǎn)，成為近年臨床治療痛經(jīng)的新趨勢[4]。

丹艾痛經(jīng)貼主要由肉桂、香附、丹參、艾葉、牡丹葉、延胡索、烏藥等7味中藥組成，處方中肉桂、香附、艾葉均含有揮發(fā)油，為活性成分之一。傳統(tǒng)的揮發(fā)油提取通常采用水蒸氣蒸餾或有機(jī)溶劑提取，這些方法提取的揮發(fā)油有出油率低、對(duì)熱不穩(wěn)定組分易分解，及有機(jī)溶劑殘留等缺點(diǎn)，而CO2超臨界提取則克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)。因其提取溫度低，可顯著提高熱不穩(wěn)定性揮發(fā)油得率；根據(jù)以往提取揮發(fā)油經(jīng)驗(yàn)，傳統(tǒng)揮發(fā)油提取時(shí)間至少約10 h，且部分藥材提取并不完全，提取周期過長，超臨界CO2提取約3 h基本提取完全，極大地提高了提取效率。本實(shí)驗(yàn)對(duì)處方中的中藥進(jìn)行提取優(yōu)化，再以聚丙烯酸鈉為骨架材料，加入其他基質(zhì)制成貼劑，可隨時(shí)貼敷和停用，起效迅速且副作用小。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；Ultimate 3000紫外檢測器（美國Thermo公司）；Chromeleon7工作站；色譜柱：Lichrospher C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠）；BP211Dsartorius電子天平，F(xiàn)A2004B型電子天平（上海安亭電子儀器廠）。

1.2 試藥

丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)110766-201721，供含量測定用）；丹酚酸B對(duì)照品（111562-201716，供含量測定用）以上對(duì)照品均購于中國食品藥品檢定研究院。蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；試劑：甲醇、乙醇、甲酸、乙腈為分析純其余均為色譜純。

2 超臨界CO2提取揮發(fā)油[5-8]

以提取溫度、壓力、CO2流量為變量，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。通過以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，考察各因素對(duì)提取效果的影響。以肉桂揮發(fā)油提取為例，結(jié)果見表1。

表1 因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合分析肉桂正交試驗(yàn)結(jié)果，得最佳提取工藝為：提取溫度40 ℃、提取壓力35 MPa、CO2流量30 kg/h。按此最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)后的肉桂油平均得率為6.05 %。同時(shí)比較使用傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法提取肉桂揮發(fā)油6 h，揮發(fā)油得率為1.33 %?？梢姵R界CO2提取肉桂得油率約是水蒸氣蒸餾法的5倍。且超臨界CO2提取法所獲得的肉桂揮發(fā)油較常規(guī)水蒸氣蒸餾法所得香味濃郁、顏色較深。

參照上述肉桂揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)香附L9(34)正交試驗(yàn)表[9]，得香附最佳工藝條件為溫度45 ℃、提取壓力30 MPa、CO2流量5.5 kg/h。以該提取條件進(jìn)行驗(yàn)證后平均得率3.19 %。

參照上述肉桂揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)艾葉L9(34)正交試驗(yàn)表[10]得，艾葉最佳提取工藝條件為提取壓力為20 MPa，提取溫度為30 ℃，CO2流量24 kg/h，平行進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揮發(fā)油平均得率為1.52 %。

3 丹參、牡丹葉等4味中藥的提取方式考察

以丹參中丹參酮ⅡA與丹酚酸B為指標(biāo)成分進(jìn)行高效液相色譜法測定，確定最佳提取工藝。

3.1 單因素考察

3.1.1 提取方法[11-12]

3.1.1.1 水提取法 按處方比例稱取提取揮發(fā)油后的肉桂、香附、艾葉與烏藥、丹參、延胡索、牡丹葉合并加8倍量水加熱回流2次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，濃縮至浸膏狀，70 ℃烘干。

3.1.1.2 乙醇提取法 按處方比例稱取提取揮發(fā)油后的肉桂、香附、艾葉與醇提藥材烏藥、丹參、延胡索、牡丹葉合并加8倍量75 %乙醇加熱回流3次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，回收乙醇，濃縮至浸膏狀，70 ℃烘干。

3.1.2 色譜條件 丹參酮ⅡA：柱溫30℃，流速1 ml/min，流動(dòng)相為甲醇-水（75:25），檢測波長：270 nm。進(jìn)樣量5 μl。

丹酚酸B：柱溫30 ℃，流速1 ml/min，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-甲酸-水（10:30:1:59）溶液，檢測波長286 nm，進(jìn)樣量5 μl。

3.1.3 對(duì)照品溶液制備 丹參酮ⅡA：精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品0.59 mg于10 ml量瓶，取2 ml加甲醇稀釋至5 ml量瓶，制成濃度為23.6 μg/ml丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液。

丹酚酸B：精密稱取丹酚酸B對(duì)照品1.58 mg于25 ml量瓶，加甲醇制成濃度為63.2 μg/ml丹酚酸B對(duì)照品溶液。

3.1.4 供試品溶液制備 丹參酮ⅡA：分別稱取水提浸膏和醇提浸膏各約1 g，精密稱定，分別置于100 ml量瓶，加入甲醇定容至100 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（頻率40 kHz，功率300 W）30 min，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得，平行3份。

丹酚酸B：分別稱取水提浸膏和醇提浸膏各約1 g，精密稱定，分別置于100 ml量瓶，加入80 %甲醇定容至100 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（頻率40 kHz，功率300 W）30 min，放冷，用80 %甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得，平行3份。

同上述供試品制備方法分別制備缺丹參空白溶液。

3.1.5 結(jié)果 丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量比較見表3。由表3可見，醇提法丹參酮ⅡA及丹酚酸B含量均高于水提法。故本實(shí)驗(yàn)采用乙醇提取。

表3 丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量比較

3.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選乙醇提取工藝

3.2.1 因素與水平 以加醇量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，每種因素取3個(gè)水平，選用L9(34) 正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排，因素水平設(shè)置見表4。

表4 因素水平

3.2.2 實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果 按處方比例稱取提取揮發(fā)油后的肉桂、香附、艾葉與醇提藥材烏藥、丹參、延胡索、牡丹葉合并按供試品溶液的制備方法及正交試驗(yàn)安排表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行含量測定，以綜合評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以丹參酮ⅡA和丹酚酸B的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)按分別為0.5來計(jì)算綜合評(píng)分。綜合評(píng)分Y=X1/X1max×0.5×100+X2/X2max×0.5×100，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 方差結(jié)果分析

由分析可見，各因素影響程度依次為C＞A＞B，即提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞加醇量；以丹參酮ⅡA得率、丹酚酸B得率為指標(biāo)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，因素B歸為誤差項(xiàng)，C有顯著影響。結(jié)合直觀分析，A因素選取A2；B因素選取B3；C因素選取C3。確定最佳提取工藝為 A2B3C3。即用10倍量75 %乙醇，回流提取3次，每次1.5 h。

3.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn) 按上述優(yōu)化條件，平行操作3份驗(yàn)證，結(jié)果3次測定綜合評(píng)分分別為：98.56，99.75，100.2，RSD為0.8515 %，表明優(yōu)選醇提工藝穩(wěn)定可行。

4 結(jié)果與討論

處方中肉桂、香附、艾葉提取揮發(fā)油。提取揮發(fā)油后的藥渣應(yīng)加乙醇提取。由于揮發(fā)油不易分離，故采用超臨界CO2法對(duì)其進(jìn)行提取。影響超臨界提取的主要因素有提取壓力、提取溫度、CO2流量等。通過L9(34)正交試驗(yàn)，以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，考察各因素對(duì)提取效果的影響。通過綜合分析肉桂正交試驗(yàn)結(jié)果可得最佳工藝條件。按最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)后的肉桂油平均得率為6.05 %，香附最佳工藝驗(yàn)證后平均得率為3.19 %，艾葉最佳工藝驗(yàn)證后平均得率為1.52 %。經(jīng)超臨界CO2法提取的肉桂、香附、艾葉藥渣中仍然含有有效物質(zhì)，應(yīng)進(jìn)一步提取，采用乙醇提取。影響醇提效果的因素主要為醇濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間，以丹參酮ⅡA、丹酚酸B為指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳醇提條件為10倍量75 %乙醇，回流提取3次，每次1.5 h。

在超臨界CO2提取時(shí)，根據(jù)以往預(yù)實(shí)驗(yàn)所知，超臨界CO2提取約3 h基本可以提取完全，故本研究中，將提取時(shí)間定為3 h，不再進(jìn)行考察。