NLRP3炎性小體表達下調(diào)對卒中后抑郁大鼠的作用

劉 柳 蔣 超 李芳芳

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052

卒中后抑郁(post stroke depression，PSD)是腦卒中患者最常見的一種精神障礙，約1/3的腦卒中患者遺留有卒中后抑郁，特別是在卒中后早期[1-2]，其累計發(fā)病率為55%[3]。研究表明，卒中后約85%的患者會在卒中后5 a內(nèi)出現(xiàn)至少5次抑郁狀態(tài)[4]。而且PSD與患者較差的神經(jīng)功能康復(fù)、認(rèn)知恢復(fù)和生活質(zhì)量相關(guān)[5-8]，并對患者接受康復(fù)治療起到負面影響作用，為家庭及社會帶來沉重的負擔(dān)。雖然卒中增加了PSD的患病風(fēng)險，但PSD也反過來影響卒中后的康復(fù)鍛煉及功能康復(fù)，由此形成惡性循環(huán)。因此，積極研究PSD的發(fā)病機制、尋找有效的治療靶點，從而指導(dǎo)臨床治療，提高患者生活質(zhì)量尤為重要。

近年來，已有越來越多的學(xué)者關(guān)注并研究PSD的病理發(fā)展過程。目前認(rèn)為神經(jīng)生物學(xué)因素(如卒中涉及的腦區(qū)[9]、卒中發(fā)生的原因[10])是影響PSD的主要因素，而不是患者殘疾后的心理反應(yīng)。PSD與基因具有相關(guān)性，如5-羥色胺轉(zhuǎn)運體、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和5-HT2A受體的基因多態(tài)性[11-13]。由小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活、促炎因子(如IL-1、IL-6、IL-18、TNF-)表達上調(diào)引起的神經(jīng)炎癥在急性缺血性腦卒中和抑郁癥[14]的病理過程中均有重要作用，而IL-18可能參與了卒中后抑郁的病理發(fā)展過程[15-16]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3炎性小體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family，pyrin domain-containing protein 3，NLRP3)是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，在動脈粥樣硬化、阿爾茨海默癥、腦出血等疾病中均有重要作用，MA等[17]研究表明，腦出血后線粒體通過其膜通透性轉(zhuǎn)運孔調(diào)節(jié)線粒體活性氧的產(chǎn)生，啟動NLRP3的活化，促進半胱氨酸天門冬氨酸酶-1的活化和IL-1成熟，進而增強炎癥反應(yīng)，且ATP-P2x7R-NLRP3信號通路參與了應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁癥發(fā)病過程[18]，但NLRP3能否影響PSD的病理過程仍然不明。因此，本研究探討NLRP3在PSD大鼠中的作用，以期為臨床PSD預(yù)防及治療提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1．1 主要試劑和材料 0.24～0.28 mm的MCAO線栓(北京西濃科技有限公司)，特異性NLRP3 siRNA序列為5'-CCAGGAGAGAACUUCUU-AUTT-3'，對照組siRNA序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，均購自上海吉瑪生物有限公司。大鼠IL-1ELISA試劑盒(聯(lián)科生物)，大鼠IL-18 ELISA試劑盒(聯(lián)科生物)。

1．2 實驗動物及分組 144只清潔級雄性SD大鼠(260～280 g)均購自河南省實驗動物中心，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院中心實驗室清潔級動物房，給予充足的水和飼料，控制室內(nèi)溫度為(25±1)℃，晝夜比例為12∶12。按照隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組(sham組，n=36)、卒中后抑郁+溶劑對照組(PSD+vehicle組，n=36)、卒中后抑郁+對照siRNA組(PSD+control siRNA，n=36)和卒中后抑郁+NLRP3 siRNA治療組(PSD+NLRP3 siRNA，n=36)。每組分為4個時間點，每個時間點n=12/組。本實驗經(jīng)過鄭州大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1．3 NLRP3 siRNA的應(yīng)用 CUMS第21天向大鼠左側(cè)腦室注射NLRP3 siRNA或等體積對照片段、無菌生理鹽水。具體方法如下：將30 μL無菌雙蒸水加入含2 OD干擾片段的Ep管中混勻備用。10%水合氯醛以250 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，牽拉后肢無反應(yīng)后，將大鼠固定于腦立體定位儀上，于頭部正中剃毛備皮、消毒，用無菌手術(shù)刀沿矢狀位做一長約1.5 cm切口，充分暴露顱骨。以前囟為原點，定位前囟后0.9 mm，向左旁開1.9 mm并標(biāo)記，顱骨鉆垂直鉆孔。用微量進樣器吸取10 μL NLRP3 siRNA溶液(PSD+NLRP3 siRNA組)或?qū)φ誷iRNA(PSD+control siRNA組)、無菌生理鹽水(PSD+vehicle組)，調(diào)整微量進樣器針尖至顱骨孔，剛好看不到針尖時即認(rèn)為深度為0，垂直進針3.5 mm時開始注射，10 min內(nèi)勻速注射完畢后停針10 min，緩慢拔出進樣器，骨蠟封孔，縫合。

1．4 卒中后抑郁模型的制作 術(shù)前12 h禁食不禁水，用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠(250 mg/kg)，刺激大鼠后肢無反應(yīng)后，肌注8萬U青霉素預(yù)防感染。頸前區(qū)備皮、消毒，在左側(cè)頸前區(qū)做一長約2 cm縱切口，鈍性分離軟組織，游離左頸總動脈及頸內(nèi)、外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠心端。將頸內(nèi)動脈用動脈夾暫時阻斷遠心端，在頸總動脈分叉處、用眼科剪剪一小口，將直徑0.18 mm的尼龍線栓沿此口插入頸內(nèi)動脈，打開頸內(nèi)動脈的動脈夾，使線栓進入頸內(nèi)動脈約12 mm時，固定線栓。用無菌生理鹽水濕潤的無菌紗布覆蓋手術(shù)區(qū)域，60 min后將線栓緩慢拔出，結(jié)扎頸總動脈，縫合，碘伏消毒。假手術(shù)組不放置線栓，其余操作與PSD組相同。待麻醉蘇醒后，對各組大鼠進行Longa評分，1～<4分為模型成功，否則剔除實驗。MCAO成模1周后，開始對大鼠進行慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)處理聯(lián)合單籠飼養(yǎng)的單居處理，連續(xù)進行21 d，以誘導(dǎo)卒中后抑郁。CUMS為隨機接受以下處理中的一種：黑白晝夜節(jié)律顛倒；禁食或禁水20 h；鼠籠傾斜45°或使用潮濕墊料20 h；短時間高溫環(huán)境(45 ℃，5 min/次，2次)；短時間足底電擊(100 V，1 min/次，3次)；束縛應(yīng)激(將大鼠置于狹小、帶透氣孔的半密閉環(huán)境中2 h)。

1．5 行為學(xué)檢測 CUMS聯(lián)合單居處理結(jié)束后第1、7、14天對各組大鼠進行蔗糖水試驗、懸尾試驗以評價PSD情況，用Longa評分、足錯誤試驗評價神經(jīng)功能恢復(fù)情況(n=12/組)。Longa評分：0分為無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分為提尾時右前肢不能完全伸直；2分為向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分為向右側(cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識不清。

1．6 ELISA 在CUMS聯(lián)合單居處理結(jié)束后的第1、7、14天，各組大鼠進行行為學(xué)檢測后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(250 mg/kg)，斷頭、取梗死側(cè)(同側(cè))大腦半球組織，按照腦組織(mg)∶無菌PBS(μL)=1∶10的比例，將腦組織勻漿、混勻，4 ℃、3 000 r/min下離心25 min，取上清液待測。按照大鼠IL-1、IL-18試劑盒的說明書操作(n=6/組)。

2 結(jié)果

表1 各組腦組織IL-1β、IL-18在各時間點含量比較

注：1、2、3、4分別為sham組、PSD+vehicle組、PSD+control RNA組、siRNA PSD+NLRP3 siRNA組；F值、P值為在各個時間點，PSD+control RNA組與siRNA PSD+NLRP3 siRNA組比較

表2 腦組織IL-1β、IL-18在各時間點含量的重復(fù)測量方差分析

注：ν為自由度，MS為均方

2．2 抑制NLRP3可減輕PSD大鼠抑郁行為 PSD后第1、7、14天對各組大鼠進行糖水偏好試驗和懸尾試驗以評價大鼠的抑郁情況。重復(fù)測量方差分析顯示，PSD后4組大鼠間糖水偏好比例、懸尾時靜止不動時間隨時間變化趨勢差異有統(tǒng)計學(xué)意義。時間對大鼠卒中后抑郁行為有影響，且分組與時間之間有交互作(表4)。單因素方差分析和Bonferroni校正進行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，PSD后各組大鼠在第1、7、14天5 min內(nèi)靜止不動時間均延長、糖水偏好比例均降低，與PSD+control siRNA組相比，PSD+vehicle組在各時間點的靜止不動時間、糖水偏好比例與之無明顯差異，而PSD+NLRP3 siRNA組在PSD后第1、7、14天懸尾時靜止不動時間均降低、糖水偏好比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(懸尾試驗中F值分別為2.33、2.33、2.89，n=10-12/組，P<0.05；糖水偏好試驗中F值分別為0.042、0.039、0.048，P值分別為0.016、0.048、0.024，P<0.05，表3)。

2．3 抑制NLRP3可促進PSD后小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)重復(fù)測量方差分析顯示，Longa評分的Mauchly球形檢驗近似χ2=11.97，P=0.003，足錯誤次數(shù)的球形檢驗近似χ2=9.20，P=0.01，因此用Greenhouse-Geisser調(diào)整自由度，各組Longa評分在PSD后隨時間變化趨勢差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且時間對Longa評分有影響，但時間與組別間無交互作用(表6)。用Kruska-Wallis檢驗對各組間Longa評分進行兩兩比較，與PSD+control siRNA組相比，PSD+vehicle組在各時間點的Longa評分與之無明顯差異，而PSD+NLRP3 siRNA組在PSD后第1、7、14天Longa評分均較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=10-12/組，H值分別為10.769、10.769、8.571，P值分別為0.006、0.006、0.02，表5)。各組足錯誤次數(shù)在PSD后隨時間變化趨勢無顯著性差異(表6)。用多參數(shù)重復(fù)測量和Bonferroni校正對每個時間點4組間足錯誤次數(shù)進行兩兩比較，與PSD+control siRNA組相比，PSD+vehicle組在各時間點的足錯誤次數(shù)與之無明顯差異(F值分別為1.38、1.17、1.14，P值為0.774、0.61、1.0，而PSD+NLRP3 siRNA組在PSD后第1、7、14天足錯誤次數(shù)均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=10-12/組，F(xiàn)值分別為1.38、1.17、1.14，P<0.001)。

表3 各組大鼠PSD后抑郁行為檢測比較

注：1、2、3、4分別為sham組、PSD+vehicle組、PSD+control RNA組、siRNA PSD+NLRP3 siRNA組；F值、P值為在各個時間點，PSD+control RNA組與siRNA PSD+NLRP3 siRNA組比較

表4 各組大鼠PSD后第1、7、14天抑郁行為檢測的重復(fù)測量方差分析

注：ν為自由度，MS為均方

表5 各組大鼠PSD后神經(jīng)功能檢測比較

注：1、2、3、4分別為sham組、PSD+vehicle組、PSD+control RNA組、siRNA PSD+NLRP3 siRNA組；F/H值、P值為在各個時間點，PSD+control RNA組與siRNA PSD+NLRP3 siRNA組比較

表6 各組間Longa評分、足錯誤次數(shù)的重復(fù)測量方差分析

注：ν為自由度，MS為均方

3 討論

卒中后抑郁(PSD)是腦卒中后最常見的一種精神障礙，影響患者的神經(jīng)功能康復(fù)和生活質(zhì)量。卒中后5 a內(nèi)抑郁癥的累計發(fā)病率為35%～52%，并且在10 a內(nèi)任何時候的合并患病率為29%[3]，這些加劇了醫(yī)療衛(wèi)生資源的浪費，家庭、社會的負擔(dān)。PSD目前儼然已成為一種公共衛(wèi)生問題，因此，深入研究其發(fā)病機制及病理過程，積極尋找有效的治療方法及靶點，已成為大勢所趨。

PSD的發(fā)病機制比較復(fù)雜，其中一種為類似于抑郁癥的單胺能假說。研究表明，腦干向左側(cè)大腦皮質(zhì)上行的氨基化軸突的缺血性損傷使得聯(lián)系中斷，引起額葉、顳葉和基底節(jié)區(qū)邊緣系統(tǒng)的5-HT和去甲腎上腺素合成減少，而這些可能與PSD的發(fā)生有關(guān)[19-21]。研究表明，PSD的發(fā)病與5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(5-HTTLPR)、5-HT2A受體和BDNF的基因多態(tài)性相關(guān)；一項臨床研究[22]表明，有卒中前抑郁癥病史的老年卒中患者更容易接受SSIR預(yù)防性治療，但是KIM等[23]的大樣本量RCT研究并未發(fā)現(xiàn)艾司西酞普蘭與安慰劑治療效果之間的顯著性差異，因此，該假說仍需進一步研究證實。

近年研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥的病程發(fā)展過程中可能有炎癥反應(yīng)的參與。重度抑郁癥患者外周血和腦脊液中炎癥因子、趨化因子和可溶性粘附分子水平均上升，且IL-1β、IL-6、TNF能夠反映抑郁癥患者的炎癥水平[24]。經(jīng)顱磁刺激治療可通過升高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)水平或激活BDNF/ERK信號通路、促進大腦海馬區(qū)細胞分化[25-26]，提高大腦皮質(zhì)及特殊神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的葡萄糖代謝水平而改善卒中后抑郁[27-28]。炎性小體是固有免疫反應(yīng)的重要組成部分，能夠識別外來入侵的病原體并啟動免疫反應(yīng)[29-30]。炎性小體主要由T淋巴細胞、巨噬細胞和NK細胞等免疫細胞產(chǎn)生，并啟動針對病原體的免疫反應(yīng)[31-32]，其中NLRP3炎性小體是近年研究比較多的。NLRP3炎性小體是由凋亡相關(guān)微粒蛋白、NLRP3和半胱氨酸天門冬氨酸酶-1前體組成的一種蛋白復(fù)合物，是固有免疫的重要組成部分[34-35]。NLRP3炎性小體活化后，可通過NF-B、MAPK途徑活化半胱氨酸天門冬氨酸酶-1，進而切割I(lǐng)L-1β、IL-18前體，產(chǎn)生成熟的IL-1β、IL-18，促進炎癥反應(yīng)[36-38]。本研究中使用NLRP3 siRNA抑制NLRP3炎性小體表達后，大鼠腦組織中IL-1β、IL-18表達均降低，與既往研究結(jié)果一致[39]。

既往研究表明，阿爾茨海默病與激活的與硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)相關(guān)的炎性小體，及腦組織中升高的IL-1β與IL-18水平相關(guān)[40]，而抑制NLRP3炎性小體的表達，可緩解糖尿病大鼠缺血性卒中后灌注再損傷[41-42]。YANG等[43]的研究表明MicroRNA-223可通過下調(diào)NLRP3炎性小體表達而對出血性卒中產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。另有研究表明，缺血再灌注損傷后，線粒體功能障礙可引起小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元上的NLRP3炎性小體相繼被激活，促進腦損傷[44]，而抑制NLRP3炎性小體可對卒中大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[45]。ASHRAF等[46]研究表明，水飛薊素和水飛薊素納米顆?？赏ㄟ^參與神經(jīng)發(fā)生和抑制NLRP3炎癥，預(yù)防應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為。而且，抑制NLRP3炎性小體可降低半胱氨酸天門冬氨酸酶-1和IL-1β的表達，減輕腦卒中小鼠腦梗死體積和腦水腫程度[47]。MA等[17]的研究表明，NLRP3可通過促進IL-1β成熟而促進腦出血后炎癥反應(yīng)，下調(diào)NLRP3可促進腦出血小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)、降低腦水腫程度，減少中性粒細胞向血腫周圍滲透。LIANG等[48]的研究表明，P2X7R基因沉默抑制了NLRP3炎性小體的激活，抑制IL-1β/IL-18釋放，減輕了腦出血小鼠的腦水腫程度，促進神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究中抑制NLRP3炎性小體后，PSD大鼠的Longa評分降低，重復(fù)測量方差分析中各組間Longa評分隨時間的變化趨勢有顯著性差異，但時間與組別之間具有交互作用。足錯誤次數(shù)試驗中，各組間大鼠足錯誤次數(shù)隨時間的變化趨勢無顯著差異，但在相同時間點，4組間大鼠足錯誤次數(shù)間有顯著性差異，且NLRP3 siRNA處理組較對照組的足錯誤次數(shù)高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是因時間本身對大鼠神經(jīng)功能有一定的影響。但總的來說，本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果不沖突。

SU等[49]研究表明，敲除NLRP3基因可抑制CUMS誘導(dǎo)的MAPK信號通路的激活，而且基因敲除鼠并未表現(xiàn)出抑郁行為。遠志皂苷元可以通過抑制NF-B調(diào)節(jié)NLRP3信號通路，從而在輕度慢性不可預(yù)見性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁小鼠模型中發(fā)揮抗抑郁作用[50]。劉富群等[51]研究表明，銀杏酮酯可增加抑郁大鼠的糖水消耗量、強迫游泳的掙扎時間，這可能是通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-B信號通路，抑制NLRP3炎性小體活性而發(fā)揮作用。CHU等[52]研究表明，Nrf2/NLRP3通路可能參與了空氣中PM2.5引起大鼠抑郁的病理過程。這與本研究中抑制NLRP3炎性小體后，PSD大鼠糖水偏好比例增加、懸尾時靜止不動時間減少的結(jié)果一致。

PSD的發(fā)病機制非常復(fù)雜，包括免疫系統(tǒng)的激活、下丘腦-垂體-腎上腺軸的異常、線粒體氧化應(yīng)激損傷、BDNF以及基因多態(tài)性等遺傳學(xué)因素。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體在抑郁癥、缺血性腦卒中、出血性腦卒中及動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病等疾病中均有作用，但在PSD中的作用仍然研究較少，其中具體機制仍然不明確。本研究運用NLRP3 siRNA下調(diào)NLRP3表達，發(fā)現(xiàn)抑制NLRP3炎性小體可改善PSD大鼠抑郁癥狀、促進神經(jīng)功能恢復(fù)，同時降低腦組織中炎癥因子表達，但未進行腦組織組織學(xué)檢測和蛋白質(zhì)水平檢測，未進一步深入探討NLRP3炎性小體的具體作用機制，存在一定的不足，仍需進一步研究。