正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選痛風(fēng)巴布膏劑的提取工藝

謝鑫 侯曉杰 李瑋 李慧 庹林波 楊肖衣 張建鋒

【摘?要】?目的：優(yōu)選痛風(fēng)巴布膏劑的最佳提取工藝。方法：以復(fù)方中馬錢子堿含量和出膏率為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為提取2?次，每次加水量為10?倍，每次提取時(shí)間為0.5h。結(jié)論：正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的痛風(fēng)巴布膏劑的提取工藝穩(wěn)定、可行。

【關(guān)鍵詞】?痛風(fēng)巴布膏劑;正交實(shí)驗(yàn);提取工藝;馬錢子堿

【中圖分類號】R284.2?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）23-0038-03

Rthogonal?design?is?preferred?for?extraction?process?of?Gout?babu?paste

XIE?Xin1?HOU?Xiaojie2*??LI?Wei2?Li?Hui2?TUO?Linbo2?YANG?Xiaoyi2?ZHANG?Jianfeng3*

1.Qingzhen?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，Qing?zhen?551400，?China;1.School?of?Pharmacy，Guizhou?University?of?Chinese?Medicine，Guiyang?550025，?China;2.Sinopharm?Group?Tongjitang（Guizhou）Pharmaceutical?Co.，?Ltd.?Guiyang?550009，China

Abstract：Objective?Optimize?the?best?extraction?process?of?gout?Babu?paste.?Methods?The?optimum?extraction?technology?was?optimized?by?orthogonal?experiment?based?on?the?content?of?brucine?and?the?ratio?of?extract?from?brucellia?chinensis?Results?The?best?extraction?process?is?2?extraction?times，?each?time?the?water?is?added?10?times，?each?extraction?time?is?0.5h.?Conclusion?The?extraction?technology?of?gout?Babu?paste?optimized?by?orthogonal?experiment?is?stable?and?feasible.

Keywords：Gout?Babu?Paste;Orthogonal?experiment;?Extraction?Process;?Strychnine

馬錢子為馬錢子科植物馬錢（Strychnosnux-vomica?L?.）的干燥成熟種子，馬錢子堿為其主要有效成分之一，具有鎮(zhèn)痛作用。馬錢子味苦，性溫，有大毒。具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫的功能[1]，臨床上常用馬錢子等藥物治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、肌肉疼痛等癥。其中，痛風(fēng)是一種臨床綜合征，主要是由于尿酸排泄減少或嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致尿酸升高，最典型、最常見的臨床表現(xiàn)為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、后期形成的痛風(fēng)結(jié)石。痛風(fēng)的患病率隨著人們生活水平的提高，較以往呈現(xiàn)明顯增高趨勢，40歲以上男性多發(fā)，常見第一跖趾關(guān)節(jié)，在其它較大關(guān)節(jié)也有發(fā)生，特別是是踝部與足部關(guān)節(jié)部位[2-3]?。本醫(yī)院根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)用制馬錢子、紅花、生半夏、生大黃等藥物組成的復(fù)方對痛風(fēng)癥治療，以洗劑形式進(jìn)行治療，但是洗劑給藥不便，且在一定程度上制約藥效的發(fā)揮，因此，為了改進(jìn)洗劑的弊端，使復(fù)方發(fā)揮更大的療效，本研究擬采用巴布膏劑，現(xiàn)以復(fù)方中馬錢子堿含量和出膏率為考察指標(biāo)，以提取時(shí)間、加水量、提取次數(shù)為影響因素，采用正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選痛風(fēng)巴布膏劑的最佳提取工藝，以期發(fā)揮更佳的臨床療效。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?UltiMate3000型高效液相色譜儀（賽默飛），柱溫箱，WP-UP-WF-20微量分析型超純水機(jī)（淅川沃特浦水處理設(shè)備有限公司），AUW220D型分析天平（十萬分之一），HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），600T多功能型粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司），101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯儀器有限公司），YQ-1000A型超聲波清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）。

1.2?試劑與試藥?馬錢子堿對照品（貴州迪大科技有限責(zé)任公司，批號GZDD-0543）;馬錢子（貴陽濟(jì)仁堂藥店，批號20181203）紅花（貴州同濟(jì)堂藥店，批號180801）;生半夏（貴陽濟(jì)仁堂藥店，批號20180904）;生大黃（貴陽一品藥業(yè)，批號180110）;王不留行（貴陽芝林大藥房，批號180802）;海桐皮（貴州同濟(jì)堂藥店，批號181-201）;艾葉（貴陽濟(jì)仁堂藥店，批號2018-1101）;冰片（貴州同濟(jì)堂藥店，批號180901）;痛風(fēng)巴布膏劑（清鎮(zhèn)市中醫(yī)院，批號190102、190-203、190310）;甲醇為色譜純;其它試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2?方法與結(jié)果

2.1?提取方法?根據(jù)痛風(fēng)巴布膏劑處方特點(diǎn)和臨床應(yīng)用，該經(jīng)驗(yàn)方為水煎煮后外用，臨床效果較好，為了與原方制備方法保持一致，對復(fù)方采用水煎煮提取后濃縮，即得復(fù)方濃縮液。

2.2?出膏率測定?將上述濃縮液置已干燥且恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，然后放入105℃烘箱內(nèi)干燥箱在中干燥至恒重后置干燥器中冷卻30min，即得浸膏，迅速稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率。出膏率（%）=干膏重量/原藥材重量×100%。

2.3?馬錢子堿的測定

2.3.1?色譜條件?以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8）（21：79）為流動相;檢測波長為260nm[8]?。

2.3.2?對照品溶液制備?精密稱定馬錢子堿對照品5mg，置于10mL容量瓶中，加三氯甲烷適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2mL，置同一10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含馬錢子堿0.lmg。

2.3.3?供試品溶液制備?精密稱定本品干膏0.3g，置5mL具塞容量瓶，再加入5.0mL三氯甲烷，攪拌至完全溶解，濾液過0.45μm的微孔濾膜，即得。

2.3.4?線性關(guān)系考察?按2.3.2項(xiàng)下對照品溶液制備方法制備對照品溶液，精密吸取對照品溶液1.0μL、5.0μL、9.0μL、13.0μL、15.0μL，在2.3.1項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)樣，測定馬錢子堿峰面積，以進(jìn)樣量X（ug）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y=26.566X+0.9126，r=0.9998。表明馬錢子堿在0.1～1.5μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5?精密度試驗(yàn)?精密吸取對照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)行進(jìn)樣6次，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算RSD為2.91%，表明該方法精密度良好。

2.3.6?重復(fù)性試驗(yàn)?按2.3.3項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，結(jié)果馬錢子含量的RSD為1.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7?穩(wěn)定性試驗(yàn)?精密吸取同一批號的供試品溶液20μL，依次在0、3、6、12、24h進(jìn)樣，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算RSD為2.46%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8?加樣回收率試驗(yàn)?精密稱定已知馬錢子堿含量的樣品6份，各0.15g，分別加入0.1mg/mL的馬錢子堿對照品溶液1.63mL，按2.3.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液并測定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為99.5%，RSD為1.87%，表明該方法準(zhǔn)確可行。

2.4?正交試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.4.1?因素與水平?本實(shí)驗(yàn)采用水煎煮法提取，以馬錢子堿的含量作為評價(jià)指標(biāo)，選擇L9（33）正交實(shí)驗(yàn)對提取時(shí)間（A）、加水量（B）、提取次數(shù)（C）進(jìn)行優(yōu)選，每組實(shí)驗(yàn)平行3次，共27次實(shí)驗(yàn)。見表1。

2.4.2?實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析?對9組實(shí)驗(yàn)，按2.1、2.2、2.3.1和2.3.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別測定馬錢子堿含量和干膏得率，并按照以下評分方程計(jì)算其綜合評分：綜合評分=馬錢子堿含量隸屬度×60+干膏得率隸屬度×40，（隸屬度=（指標(biāo)值-指標(biāo)最小值）/（指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值））。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，表3，并對結(jié)果進(jìn)行方差分析，考察因素A、B、C對綜合評分的主效應(yīng)。結(jié)果見表4。

從表4可知，因素A、B、C對綜合評分的主效應(yīng)不顯著（P>0.05），由表3中極差R值可知，各因素的影響大小依次為C>B>A，且C3>C2>C1，B2>B3>B1，A1>A3>A2由于C3與C2差異不大，從節(jié)約能源，利于生產(chǎn)考慮，選擇提取2次更合適。綜合比較后，確定A1B2C2為痛風(fēng)巴布膏劑的最佳提取工藝，即10倍量的水，提取2次，每次0.5h。

3?討論

本實(shí)驗(yàn)前期對乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8）、乙腈-異丙醇-3%磷酸溶液、甲醇-十二烷基磺酸鈉-磷酸二氫鉀三種流動相進(jìn)行了考察?？疾彀l(fā)現(xiàn)乙腈-異丙醇-3%磷酸溶液為流動相時(shí)黏性特別大，容易堵塞柱子;甲醇-十二烷基磺酸鈉-磷酸二氫鉀為流動相時(shí)馬錢子堿的色譜峰與其他峰分不開，且拖尾嚴(yán)重;乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8）為流動相時(shí)馬錢子堿的色譜峰與其他峰能較好的分開，且峰形較好。故本實(shí)驗(yàn)最終確定采用乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8）為測定指標(biāo)成分馬錢子堿的流動相。

本研究使用的復(fù)方中選用的是制馬錢子，生馬錢子毒性大，僅供外用，且有毒成分能經(jīng)皮膚吸收，外用不宜大面積涂敷。馬錢子經(jīng)炮制后毒性降低，可入丸散劑，供內(nèi)服。制馬錢子中馬錢子堿的含量降低，馬錢子堿氮氧化物含量明顯增加，且馬錢子堿及其氮氧化物藥理作用相似，但馬錢子堿的毒性成分比其相應(yīng)的氮氧化物大15倍，而馬錢子氮氧化物的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于馬錢子堿，且具有藥效發(fā)揮遲而藥力持久的特點(diǎn)[4]。因此，為了保證臨床用藥安全、有效，復(fù)方選用制馬錢子。以馬錢子堿的含量為控制指標(biāo)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，痛風(fēng)巴布膏劑最佳提取工藝為A1B2C2，即10倍量的水，提取2次，每次0.5h。在此工藝下，馬錢子堿的含量為0.1481%，小于2015版藥典規(guī)定的含量，保證了臨床用藥安全。另外，本研究采用馬錢子堿和出膏率兩個指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，能夠較全面地評價(jià)痛風(fēng)巴布膏劑的提取工藝，且方法簡單、成本低、精密度高，重現(xiàn)性好，為日后痛風(fēng)巴布膏劑的研制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：50-51.

[2]趙正奇，葉超，王澤然，等.葉新苗針?biāo)幗Y(jié)合治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗(yàn)[J].中華中醫(yī)藥雜志，2019，43（4）：1527-1539.

[3]鄭莉，楊家福，蘇虹，等.彭江云分期辨治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[J].遼寧中醫(yī)雜志，2019，46（1）：38-40.

[4]陸兔林，金傳山.中藥炮制學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2018：199-200.

（收稿日期：2019-09-22?編輯：陶希睿）

基金項(xiàng)目：貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題：QZYY-2018-092;貴州省國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目編號：（中藥學(xué)）（GNYL[2017]008?號）;黔高教發(fā)[2017]158號-02-04?號。

作者簡介：謝鑫（1980-），男，仡佬族，碩士，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┭芯俊-mail：7257097@qq.com

通信作者：侯曉杰（1984-），女，漢族，碩士，助教，研究方向?yàn)橹兴幣谥蒲芯俊-mail：605128843@qq.com;張建鋒（1981-），男，漢族，碩士，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幖夹g(shù)工藝及中藥配方顆粒研究。E-mail：286911082@qq.com