蒙藥黑冰片熒光納米碳點的制備方法的研究

陳沙娜 特格喜白音 敖登其木格 王海榮

【摘?要】?熒光碳點（FCDs）是一種新型的碳納米顆粒，具有良好的分散性和熒光穩(wěn)定性。這種FCDs有特殊的光學(xué)特性和優(yōu)良的生物學(xué)性質(zhì)使其在生物醫(yī)學(xué)的光學(xué)影像和腫瘤診斷治療方面具有突出的優(yōu)勢和良好的發(fā)展前景。碳元素在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，其中傳統(tǒng)蒙藥“灰劑”中的炭藥就是典型的例子。蒙藥炭藥黑冰片在蒙醫(yī)中有悠久的使用歷史并療效顯著，黑冰片通過無氧鍛煉之后碳化成為生物炭，可以制備出熒光碳點。通過模擬黑冰片在人體胃腸道中消化吸收的過程，并成功合成綠色、經(jīng)濟、水溶性強的光致熒光碳點。本次研究對蒙藥納米藥的研究提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】?熒光碳點;黑冰片;碳納米顆粒;納米藥

【中圖分類號】?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）23-0000-00

碳元素作為自然界最重要的元素之一，參與了整個地球的組成與活動，在人體中也是重要的組成部分。碳元素在醫(yī)藥領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用，其中傳統(tǒng)蒙藥“灰劑”中的炭藥就是典型的例子。炭藥是將蒙藥飲片、動物藥或礦物藥經(jīng)過無氧煅燒成生物炭，然后磨成細(xì)粉入藥服用，最終這些藥經(jīng)過胃腸道消化成碳元素進(jìn)入五臟六腑發(fā)揮作用。炭藥通常在臨床上用于治療食道、胃腸道疾病或腫瘤等疾病療效顯著。蒙醫(yī)應(yīng)用炭藥治療疾病有著悠久的歷史，多年來不斷地研究和探索它的功能。近年來，由碳元素構(gòu)成的各種碳納米材料（Carbon?Nanomaterials，?CNMs）逐漸成為21世紀(jì)科技創(chuàng)新的研究熱點。其中，包括碳納米管、納米顆粒、納米纖維、氧化石墨烯和碳點（Carbon?Dots，CDs）等都引起了極大的關(guān)注[1-4]，其廣泛應(yīng)用于太陽能電池、生物成像、光催化、納米電子器件、光動力學(xué)治療和生物醫(yī)療等領(lǐng)域[5，6]。碳點（CDs）作為新型熒光碳納米材料，具有類似量子點優(yōu)良的光致發(fā)光性能，同時具有化學(xué)惰性和良好的生物相容性。根據(jù)文獻(xiàn)了解到CDs?對組織和器官不會引起任何異?；驌p傷，并沒發(fā)現(xiàn)急性毒性、亞急性毒性及基因毒性等。有研究比較了碳點、單壁碳管、二氧化硅和氧化鋅的細(xì)胞毒性與基因毒性后發(fā)現(xiàn)，碳點的毒性最低[2，5]。

目前，碳點的制備方法有合成方法、電化學(xué)方法、激光消融法、強酸溶解法、水熱一步法等等很多種[7-9]，可是，沒有一種方法能夠說明蒙藥和中藥等傳統(tǒng)炭藥在人體里正常消化和吸收并起到藥理作用的過程。因此本課題組經(jīng)過努力研究新的制備熒光碳點的方法，那就是酶切法，擬制備出蒙藥特色炭藥黑冰片的熒光碳點。本方法的優(yōu)點是主要模擬黑冰片在人體胃腸道里消化吸收的過程并激發(fā)后發(fā)生熒光。通過該方法制備的碳點，其表面富含官能性有機基團，使得其具有較好的分散性和水溶性，亦可非常便捷地對黑冰片熒光碳點進(jìn)行功能化修飾和生物偶聯(lián)標(biāo)記;同時也有非常好的生物形容性。

據(jù)文獻(xiàn)了解到，近年一些研究者們利用姜、生物秸稈、咖啡炭、雞蛋清、蠟燭灰、石墨烯等分別作為原料用不同的方法制備出CDs[10-13]，并發(fā)現(xiàn)所制備的CDs具有非常好的抑制肝癌、人肺癌、人乳腺癌、人宮頸癌細(xì)胞的生長和抗氧化作用，對正常乳腺上皮細(xì)胞和小鼠肝細(xì)胞具有低毒性。我們逐漸意識到熒光碳點是個潛在的可以突破傳統(tǒng)蒙醫(yī)藥的創(chuàng)新研究的新的亮點。

綜上述，本項目利用蒙藥黑冰片熒光碳點的良好發(fā)光性質(zhì)以便進(jìn)一步將其應(yīng)用于蒙醫(yī)藥研究領(lǐng)域及其治療胃腸道腫瘤的重大疾病的診斷治療研究。然后利用熒光碳點的光致發(fā)光性質(zhì)，基于某些蒙藥能引起黑冰片熒光碳點光致發(fā)光信號的變化來實現(xiàn)該藥物的檢測和跟蹤，從而建立簡單、快速、靈敏的檢測藥物的方法和標(biāo)準(zhǔn)，并利用熒光顆粒的光致發(fā)光性質(zhì)，跟蹤或檢測黑冰片顆粒對細(xì)胞與體內(nèi)做出的影響。本研究對炭藥的研究以及蒙醫(yī)藥的研究具有重要意義。

1?材料和方法

1.1?材料與儀器?電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶航亞試驗儀器有限公司，中國）或馬弗爐（北京西尼特電爐有限公司，中國）;U-3010紫外-可見分光光度計（日立公司，日本）用于碳點溶液吸收光譜的測定;F-2500型熒光分光光度計（日立公司，日本）用于測定熒光激發(fā)與發(fā)射光譜;碳點的水合粒徑及表面電荷由Zetasizer?Nano?（馬爾文儀器有限公司，英國）測定;?透射電子顯微鏡（TEM），用于測定合成碳點的元素組成和C?Is光譜，Spectrum?GX傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀（Perkin?Emer公司，美國），碳點的熒光壽命通過FL-TCSPC熒光光譜儀（喬平伊馮公司，法國）測定。

1.2?制備C-dots

1.2.1?模擬人胃、腸液的配制：??①胃液的配制：0.2g?NaCl，?0.32g?胃蛋白酶，?0.7mL?濃鹽酸，?雙蒸餾水定容于100mL。pH?約為1.2。（胃蛋白酶購自于Sigma?公司。胃蛋白酶的活力為2330U/mg?pro）。②模擬腸液的配制：將0.68g?KH2?PO4?溶于25mL?雙蒸水，?振蕩，?完全溶解后加19mL?0.2mol/L?NaOH?和40mL?的雙蒸水。加胰蛋白酶1.0g，混勻，?用0.2mol/L?NaOH?調(diào)pH?到7.5±0.1，?雙蒸水定容于100mL[4]。（胰蛋白酶購自于Sigma?公司。胰蛋白酶的活力為10010U/mg?prot。）

1.2.2?黑冰片熒光顆粒的制備實驗?本次熒光顆粒的制備通過三步進(jìn)行：首先，將1g黑冰片碳粉投入到在預(yù)先加入模擬人胃液的圓底燒瓶中，置于油浴鍋中37℃、磁力攪拌回流12h。反應(yīng)完后，離心分離除去未反應(yīng)物，取上面黃色上清液，轉(zhuǎn)入到透析袋（MWCO1000）在超純水中透析?2～3?天（期間不斷換水），直到?pH?值接近中性。透析處理后的黃色液體再逐級離心分離提純，最后以16000?轉(zhuǎn)/秒離心30min后提取上清液4℃保存。其次，將胃液消化離心沉淀的黑冰片碳顆?；厥?，并倒入適量超純水輕輕混勻然后16000?轉(zhuǎn)/秒離心?10min。以上方法重復(fù)兩次，最后把沉淀物溶于腸液置于油浴鍋中37℃、磁力攪拌回流?12h。反應(yīng)完后，離心分離除去未反應(yīng)物，取上面黃色上清液，轉(zhuǎn)入到透析袋（MWCO1000）在超純水中透析?2～3?天（期間不斷換水），直到?pH?值接近中性。最后以16000?轉(zhuǎn)/秒離心30min后提取上清液4?℃保存。然后，兩次提取的黃色上清液混合后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至?25mL?左右。接著把濃縮的液體放入微波爐以50Hz微波5min后放入冷凍干燥機干燥，然后加入適量超純水干燥碳顆粒里超聲1min后回收，在熒光檢測儀下檢測發(fā)熒光等情況后4℃保存。

2?表征分析

透射電子顯微鏡（TEM）?技術(shù)可以直接獲得樣品的三維圖像，根據(jù)圖像分析可以直接得到顆粒的三維尺寸。使用FEI?Tecnai?G2?Spirit在120kV的加速電壓下進(jìn)行透射電子顯微鏡（TEM）。?使用Nano?ZS90?Zetasizer（MRW11-ltx3200a）測定ζ電位。?在室溫下分別在UV-2550UV-vis分光光度計（Shimadzu，Japan）和Luminescence?Spectrometer?55（Perkin-Elmer）上記錄吸收和熒光光譜。?在Burker?Vector?22光譜儀上記錄傅里葉變換紅外（FTIR）光譜。

3?結(jié)果與討論

3.1?C-Dots的特征和性質(zhì)?黑冰片為豬科動物野豬（Susscrof.aL）的干燥成形糞便的炭化物，?蒙藥名為哈日-嘎布日（Har?Gabur），?是蒙藥成方常用藥之一，具有健胃、助消化等功效。主要治療胃腸疾病最有特色的炭藥材，與其它藥材配伍用于多種配方。野豬的雜食動物，只要能吃的東西都吃，包括各種草藥、果實、根、昆蟲、鳥蛋、大家鼠、腐肉，甚至也會吃野兔、蛇等。野豬對毒素有一定的免疫力，而且腸道免疫力特別強，有很多免疫蛋白和消化酶。野豬碳化糞中包含很多藥材碳化物，也包含很多腸道免疫蛋白和酶等。我們通過模擬蒙藥炭藥黑冰片在人體胃腸道里消化吸收的過程中制備出黑冰片納米熒光顆粒。圖1顯示透射電子顯微鏡（TEM）?技術(shù)直接獲得的C-Dots三維圖像。圖1根據(jù)圖像分析可以直接得到顆粒的三維尺寸。通過HRTEM和XRD表征了碳點的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。Cdots的XRD測量顯示了一個寬峰位于2θ的大約26°，通常25.8°為石墨烯的特征峰。樣品的峰與石墨烯的特征峰接近。

3.2?熒光碳點在不同波長近紅外激發(fā)光下的發(fā)射光譜圖?碳點的特性之一是吸收激發(fā)光電子，電子發(fā)生躍遷，轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)電子，激發(fā)態(tài)電子能量釋放過程中通常會發(fā)出熒光或磷光，這是熒光產(chǎn)生的基本原理。碳點隨著激發(fā)光的波長不同，發(fā)出的熒光顏色和強度也不同。圖2給出的不同激發(fā)光下的碳點的熒光發(fā)射光譜圖。激發(fā)光從400nm?增加到550nm?時，熒光強度隨之增加，熒光峰也發(fā)生紅移;當(dāng)繼續(xù)增加激發(fā)光的波長時，雖然熒光發(fā)射峰紅移，但是發(fā)射強度隨之急劇下降，說明了此裸碳點在550nm激發(fā)有最強的熒光發(fā)射峰。

3.3?碳點的表面成分分析?通過HRTEM的EDS光譜分析和XRD表征了碳點的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。Cdots的XRD測量顯示了一個寬峰位于2θ的大約26°，通常25.8°為石墨烯的特征峰。樣品的峰與石墨烯的特征峰接近。在透射電鏡圓形代表區(qū)域的EDS光譜分析峰中0.33，0.56處出現(xiàn)兩個強峰，分別為歸于碳、氧。因此，所制備的碳量子點的主要元素成分是C（26.88%），O（14.56%），（見表一）。EDS光譜表征實驗表明，樣品中以C、O?元素為主。根據(jù)HRTEM的EDS光譜分析和XRD分析結(jié)果樣品中含有石墨烯（GO）的結(jié)構(gòu)。

4?結(jié)論

本實驗利用酶切法成功制備出了黑冰片熒光納米碳點（CDs），更重要的是：我們認(rèn)為此法與黑冰片在人體里的消化和吸收具有密切的相關(guān)性，甚至?xí)苯佑绊懫渌幚碜饔?。我們在研究中發(fā)現(xiàn)用酶切方法制備出的黑冰片熒光碳點（CDs），其表面富含羥基、氨基等官能性有機基團，使其不僅具有良好的分散性和水溶性（傳統(tǒng)碳點難溶于水），而且易于功能化修飾和生物偶聯(lián)標(biāo)記，同時還有良好的生物相容性。我們課題組在這基礎(chǔ)上進(jìn)一步對黑冰片熒光納米碳點的生物醫(yī)藥方面臨床應(yīng)用研究，對其毒副作用的更加全面、客觀的評價，而且測定碳點對機體免疫功能的影響。碳點在改進(jìn)生物傳感器、醫(yī)學(xué)成像設(shè)備、蒙藥納米治療、藥物靶向輸送等領(lǐng)域都有非常好的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2019-06-26?編輯：劉?斌）