王 珺,韓林子,張 森,王德光
維持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者常出現(xiàn)骨以外的軟組織鈣化,包括血管鈣化和心臟瓣膜鈣化(cardiac valve calcification,CVC)。心臟瓣膜鈣化是新發(fā)心血管事件和心血管死亡的獨立危險因素,也是動脈粥樣硬化、左心室肥厚、動脈鈣化等心血管疾病發(fā)病率和死亡率的強(qiáng)烈預(yù)測因子[1]。
研究[2]表明,MHD患者體內(nèi)存在微炎癥狀態(tài)并可能參與血管鈣化的形成。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,也是被證實的在體內(nèi)外可促進(jìn)血管鈣化的炎癥因子。但TNF-α與心臟瓣膜鈣化的關(guān)系尚無相關(guān)研究;基質(zhì)Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)是血管平滑肌細(xì)胞分泌合成的蛋白,具有抑制血管鈣化的作用,參與多種血管病理生理過程。該研究測定MHD患者血清中TNF-α和MGP水平,并探討其與心臟瓣膜鈣化的關(guān)系。
1.1病例資料病例組選自2016年7月~2016年10月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科病房住院的MHD患者66例。入選標(biāo)準(zhǔn):① 年齡≥18歲;② 充分透析,每周3次,每次至少4 h;③ 規(guī)律血液透析3個月或以上。排除標(biāo)準(zhǔn):① 急性期感染;② 存在先天性瓣膜畸形、風(fēng)濕性心臟瓣膜病或行人工瓣膜置換者;③ 合并嚴(yán)重心功能不全、嚴(yán)重肝病或惡性腫瘤者。MHD患者再根據(jù)有無心瓣膜鈣化分為鈣化組(30例)和非鈣化組(36例)。對照組選擇同期健康體檢人群31例,年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)均與病例組相匹配,無高血壓、糖尿病、結(jié)締組織病、慢性腎臟病等病史,體檢肝腎功能、尿常規(guī)均正常。人口統(tǒng)計學(xué)、臨床和實驗室數(shù)據(jù)均通過醫(yī)院檢查記錄以及問卷調(diào)查獲得。
1.2空腹靜脈血樣標(biāo)本的處理靜脈血標(biāo)本均清晨空腹采取,離心后收集血清分裝于1.5 ml的EP管中,-80 ℃冰箱凍存。使用前取出至4 ℃冰箱中溶解,待完全溶解后作為實驗樣本。
1.3ELISA檢測血清TNF-α及MGP測定嚴(yán)格遵照ELISA試劑盒說明書執(zhí)行,在酶標(biāo)儀(Infinite F50)450 nm波長分別檢測TNF-α及MGP的吸光度(optical density, OD)值。以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,建立擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式,將樣本的OD值代入方程式,計算出樣本的濃度。ELISA試劑盒購自于武漢Bio-Swamp公司。
1.4診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2009年改善全球腎臟病預(yù)后組織(KDIGO)建議,采用超聲心動圖法(西門子ACUSON+S 2000)檢測心臟瓣膜鈣化[3]。鈣化標(biāo)準(zhǔn):主動脈瓣瓣膜、二尖瓣瓣膜可探及1個或多個點狀或團(tuán)狀回聲增強(qiáng),直徑超過1 mm。
2.1一般臨床資料病例組66例,年齡20~80(53.7±14.2)歲。原發(fā)?。郝阅I小球腎炎32例(48.48 %),高血壓腎病9例(13.64 %),糖尿病腎病7例(10.61 %),多囊腎7例(10.61 %),狼瘡性腎病3例(4.55 %),其他8例(12.12 %)。對照組為31例,年齡、性別及BMI均匹配的健康人群。在病例組中,心瓣膜鈣化者占45.45 %,顯著高于健康人群,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。而在MHD患者中,瓣膜鈣化組平均年齡、透析齡均顯著高于非瓣膜鈣化組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而這兩組的其他實驗室指標(biāo)包括血紅蛋白、白蛋白、三酰甘油、總膽固醇、血鈣、血磷、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶、C反應(yīng)蛋白比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。
2.2血清TNF-α及MGP水平比較病例組血清TNF-α水平顯著高于對照組,MGP水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。MHD患者心臟瓣膜鈣化組血清TNF-α水平高于非鈣化組(P=0.027),MGP水平低于非鈣化組(P=0.001),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1、表2。
2.3MHD患者血清TNF-α及MGP水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性血清MGP水平與年齡(r=-0.224,P<0.05)、堿性磷酸酶(r=-0.269,P<0.05)、TNF-α呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.242,P<0.05);而血清TNF-α水平與年齡、透析齡、血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、血鈣、血磷、鈣磷乘積、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶均無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。
表1 研究對象的人口學(xué)特征及重要指標(biāo)
表2 MHD患者心臟瓣膜鈣化組與非鈣化組的比較
表3 TNF-α及MGP與MHD患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性
2.4MHD患者心臟瓣膜鈣化的多因素Logistic回歸分析以瓣膜鈣化有無為因變量,多因素Logistic回歸分析顯示,透析齡、血清TNF-α水平是CVC的危險因素(P<0.05,P<0.01),而MGP是CVC的保護(hù)因素(P<0.05)。校正年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、血紅蛋白、白蛋白、C反應(yīng)蛋白、三酰甘油、總膽固醇、鈣磷乘積、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶后,透析齡每增加1個月,CVC發(fā)生風(fēng)險升高5.3 %;血清TNF-α每增加1 pg/ml,CVC發(fā)生風(fēng)險升高9.9 %;血清MGP每增加1 ng/ml,CVC發(fā)生風(fēng)險減少56.0 %。見表4。
心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是MHD患者常見的并發(fā)癥和首要死亡原因,而心臟瓣膜鈣化是預(yù)測MHD患者心血管疾病和全因死亡的獨立危險因素[4]。研究[5-6]顯示,心臟瓣膜鈣化在MHD患者中的發(fā)生率為25.5%~58%,該研究顯示,MHD患者心臟瓣膜鈣化的發(fā)生率為45.45%,且遠(yuǎn)高于健康人群,與既往研究[5-6]結(jié)果基本一致。CVC可致斑塊破裂、心肌缺血或梗死,晚期可能出現(xiàn)心律失常甚至心力衰竭等嚴(yán)重后果。本研究同賈鳳玉 等[7]研究均顯示,心臟瓣膜鈣化的患者透析齡顯著大于非瓣膜鈣化患者。且透析齡越長,CVC發(fā)生率越高。研究[8]顯示,MHD患者發(fā)生CVC與鈣磷代謝紊亂、高甲狀旁腺激素血癥、高C反應(yīng)蛋白密切相關(guān),但該研究并未顯示明顯相關(guān)性??赡芘c該研究樣本量較小,且研究對象有一定特殊性(均為MHD住院患者、病情較重)有關(guān)。
隨著年齡增長,骨礦含量逐漸減少,軟組織鈣化出現(xiàn),故有學(xué)者認(rèn)為瓣膜鈣化與衰老相關(guān),衰老過程伴有細(xì)胞內(nèi)鈣含量的增多,鈣從骨骼向軟組織轉(zhuǎn)移[9]。該研究顯示,心臟瓣膜鈣化的MHD患者年齡顯著高于非瓣膜鈣化患者,也進(jìn)一步驗證瓣膜鈣化與衰老相關(guān)的觀點。
在全身或局部沒有急性感染跡象時,尿毒癥患者血清炎癥標(biāo)志物水平仍輕度升高,稱之為“微炎癥狀態(tài)”,其實質(zhì)是免疫炎癥,具有相對隱匿且持續(xù)的特點[10]。該研究結(jié)果表明MHD患者體內(nèi)呈微炎癥狀態(tài)。筆者認(rèn)為,在血液透析過程中,反復(fù)穿刺動靜脈瘺管、透析液和透析膜的生物不相容性、透析液中內(nèi)毒素污染、透析用水不純、血管通路感染尤其是深靜脈置管的感染是引起MHD患者血清炎癥因子水平升高的主要原因。在該研究中,伴有CVC的患者血清TNF-α水平明顯升高,揭示TNF-α在瓣膜鈣化過程中起重要作用,具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究證實。
表4 心臟瓣膜鈣化的多因素Logistic回歸分析
MGP是維生素K依賴性循環(huán)蛋白,相對分子質(zhì)量約10 000 bp。體內(nèi)MGP缺乏的小鼠出生后約2個月就出現(xiàn)了廣泛性的動脈鈣化,最終導(dǎo)致血管破裂而死亡,揭示了MGP參與了動脈鈣化的抑制過程,是體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)的第一個血管鈣化抑制因子[11]。其主要作用機(jī)制可能為:① MGP與羥磷灰石結(jié)合直接抑制羥磷灰石的增加以及鈣的沉積;② MGP可與BMP-2結(jié)合,使其功能喪失,從而抑制血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換;③ MGP可能通過抑制VSMC的凋亡(使VSMC維持收縮表型)而直接抑制血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展[12]。MGP主要分布在軟骨、骨髓和動脈壁,在心臟也呈高水平表達(dá)。該研究說明了MGP的表達(dá)上調(diào)限制了瓣膜鈣化的發(fā)生。Venardos et al[13]發(fā)現(xiàn),分別從鈣化和非鈣化的瓣膜中分離出瓣膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),鈣化的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞MGP表達(dá)水平明顯減少。這些證據(jù)均表明,MGP是心臟瓣膜鈣化的抑制因子,其具體發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
隨著年齡增大,MGP表達(dá)下降甚至失活,機(jī)體失去鈣化防御機(jī)制,開始出現(xiàn)異位鈣化。堿性磷酸酶是一組同工酶,骨特異性堿性磷酸酶可表達(dá)于成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或有鈣化傾向的細(xì)胞如鈣化的VSMC,在組織鈣化的發(fā)展中起重要作用。高血清堿性磷酸酶被認(rèn)為是MHD患者冠狀動脈鈣化的獨立危險因素[14],但該研究并未顯示堿性磷酸酶在CVC組有顯著升高,可能是其他種類堿性磷酸酶代償?shù)慕Y(jié)果。
多因素Logistic回歸分析顯示, MHD患者的透析齡及血清TNF-α均為心臟瓣膜鈣化發(fā)生的獨立危險因素,校正其他相關(guān)因素后,透析齡每增加1個月,心臟瓣膜鈣化發(fā)生風(fēng)險升高5.3 %;血清TNF-α每增加1 pg/ml,心臟瓣膜鈣化發(fā)生風(fēng)險升高9.9%,而血清MGP每增加1 ng/ml,心臟瓣膜鈣化發(fā)生風(fēng)險減少56.0 %,說明MGP是心臟瓣膜鈣化的保護(hù)性因素。