長鏈非編碼RNA在胃癌中作用的研究進展

高 敏，劉文博 綜述 顧康生 審校

據(jù)全國腫瘤登記中心最新數(shù)據(jù)估計[1]，2015年中國胃癌(gastric cancer, GC)新發(fā)病例約67.9萬例，胃癌死亡病例約49.8萬例，嚴重危害我國人民健康。手術(shù)切除是目前治療胃癌主要手段之一，然而由于胃癌早期缺乏特異性，加之確診胃癌的胃鏡檢查為有創(chuàng)檢查，多數(shù)患者確診時已處于進展期，從而失去了手術(shù)治愈的最佳時機，除手術(shù)以外，術(shù)后化療是治療胃癌的主要手段?；熜Ч蔀楦纳莆赴┗颊哳A后的關(guān)鍵因素，然而，廣泛見之于臨床的化療耐受性是抗腫瘤化療無效的最常見原因，更為嚴峻的是，缺乏有效預測胃癌對于化療藥物耐受性的方法，致使患者接受盲目和過度化療再所難免[2]。因此，在闡明胃癌耐藥形成機制的前提下，發(fā)展能有效預期化療耐受性的分子標記，是成功進行化療的必要前提。因而，尋找與胃癌發(fā)生發(fā)展、化療療效及預后相關(guān)的生物標志物變得非常有必要。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200 nt的RNA分子，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能。起初lncRNA一度被認為是基因組中的“垃圾”，轉(zhuǎn)錄的“噪音”[3]，但是隨著高通量測序等生物信息學技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)lncRNA在包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病中發(fā)揮著重要的生物學功能，其轉(zhuǎn)錄本有可能作為信號分子、誘餌分子、引導分子和支架分子四種模式發(fā)揮作用[4]。根據(jù)lncRNA基因在基因組上的位置可分為五類：基因間lncRNA(long intergenic lncRNA,lincRNA)、內(nèi)含子區(qū)lncRNA、正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA[5]。目前研究[3, 6]顯示，lncRNA主要在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平三個層面調(diào)控胚胎發(fā)育、細胞增殖、轉(zhuǎn)移和分化等各種生命活動。近年來，有研究[7-9]證實,lncRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展、化療敏感性及預后等均具有相關(guān)性。盡管關(guān)于lncRNA的研究不斷深入，但對于絕大多數(shù)lncRNA的功能仍然知之甚少，本文就與胃癌相關(guān)的lncRNA研究現(xiàn)狀做一綜述，以期為胃癌的診療及預后判斷的研究提供參考。

1 lncRNA對胃癌細胞增殖、凋亡的影響

通常，人體特定組織器官中的細胞類型和數(shù)目是相對恒定的，這種恒定性主要取決于貫穿生命過程中的細胞增殖、分化以及凋亡之間的動態(tài)平衡，而這一動態(tài)平衡一旦被打破，就會導致包括惡性腫瘤在內(nèi)的疾病的發(fā)生、發(fā)展。近些年，隨著對lncRNA的深入研究，結(jié)果顯示一些lncRNA的異常表達能夠干擾胃癌細胞凋亡，促進其無限增殖，從而導致胃癌的發(fā)生。

Yang et al[10]通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)H19在GC組織和細胞中過表達，細胞實驗證實H19的異位表達促進AGS細胞增殖，而H19 siRNA促成AGS細胞凋亡，可能與H19導致部分p53失活所致。最近，Yan et al[11]實驗證明H19和miR-675在GC組織和細胞系中相對表達增加，且其過表達促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，而敲低H19和miR-675則可抑制細胞增殖而促進細胞凋亡。進一步通過熒光素酶報告基因驗證miR-675的直接靶標為FADD，并通過H19/miR-675軸抑制FADD的表達，從而抑制胱天蛋白酶裂解(包括胱天蛋白酶8和3)。另外，研究者通過裸鼠移植瘤實驗表明H19/miR-675軸在體內(nèi)亦發(fā)揮相同的作用[11]。因此，H19可能通過H19/miR-675/FADD/caspase8/caspase3軸發(fā)揮作用，從而有望成為GC的潛在治療靶標。Hu et al[12]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤差別表達基因(colorectal neoplasia differentially expression, CRNDE)在GC組織和細胞中表達上調(diào)，MTT測定顯示CRNDE過表達促進細胞增殖，敲低CRNDE則抑制細胞增殖，探索其機制發(fā)現(xiàn)CRNDE可能通過競爭性結(jié)合miR-145促進GC細胞增殖。另外，其研究還顯示通過上調(diào)CRNDE表達，E2F3表達顯著增加，而shCRNDE顯著降低E2F3表達。因此，CRNDE可能通過CRNDE/miR-145/E2F3信號通路促進GC的發(fā)生。Huang et al[13]研究表明linc00673在GC中顯著上調(diào)，敲除linc00673抑制細胞增殖和侵襲并誘導細胞凋亡，而linc00673過表達具有相反的作用。研究者通過熒光素酶報告基因和ChIP測定證實SP1可以直接結(jié)合linc00673啟動子區(qū)域的SP1結(jié)合位點并激活其轉(zhuǎn)錄，而SP1激活的linc00673則發(fā)揮促進GC發(fā)生發(fā)展的致癌功能。另外通過linc00673還可能作為組蛋白去甲基化酶(lysine specific demethylase,LSD1)和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)的支架抑制鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子2(kruppel-like factor 2,KLF2)和大腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor kinase 2,LATS2)表達，進一步促進GC的發(fā)生。

當然，亦有一些lncRNA可以干擾GC細胞增殖，促進其凋亡。Zhang et al[14]研究發(fā)現(xiàn)linc00628通過抑制癌細胞的增殖、遷移和集落形成，在GC中作為抑癌基因發(fā)揮作用，并且通過小鼠異種移植模型，發(fā)現(xiàn)linc00628還可以抑制體內(nèi)腫瘤生長。進一步研究[14]證實linc00628主要位于細胞核中并與EZH2相互作用，通過調(diào)節(jié)Lys27位點三甲基化組蛋白H3(histone H3 methylated Lys27,H3K27me3)水平調(diào)節(jié)基因表達，同時，linc00628的過表達也可以誘導GC細胞中的G0/G1停滯，從而發(fā)揮抑癌基因的作用。

2 lncRNA對胃癌細胞轉(zhuǎn)移的作用

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最具特征性的表現(xiàn)，也是絕大多數(shù)腫瘤患者致死因素，腫瘤轉(zhuǎn)移是多因素、多基因相互協(xié)調(diào)作用的多階段過程。近年來，研究者們探索了lncRNA在胃癌轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控作用，以期未來人類能夠在阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移上取得突破性進展。

Liu et al[15]通過功能獲得和缺失實驗證明了lncRNA XLOC_010235(XLOC)的過表達可以顯著影響多種上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)分子(包括E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白等)的表達水平而促進GC轉(zhuǎn)移。進一步研究其轉(zhuǎn)移機制，顯示基因Snail1的mRNA水平在胃癌組織高表達，且Snail1表達與胃癌組織中XLOC轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)性，通過Western blot分析驗證了Snail1在蛋白質(zhì)水平上亦呈正相關(guān)性。所以，Snail1在mRNA和蛋白水平上均受到XLOC的正調(diào)控。因此XLOC與Snail1相互作用介導EMT促進GC細胞轉(zhuǎn)移。Du et al[16]研究表明，TRERNA1在GC組織中顯著上調(diào)，與GC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，經(jīng)體外和體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，TRERNA1促進GC細胞侵襲轉(zhuǎn)移。機制探索顯示，TRERNA1通過招募到EZH2來表征性調(diào)節(jié)CDH1基因的表達，并通過各種分子機制促進EMT，從而在GC進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。Yu et al[17]研究發(fā)現(xiàn)，linc00261在胃癌組織中的表達水平顯著下調(diào)，其表達水平與腫瘤進展及臨床分期呈負相關(guān)，linc00261在GC中主要通過降低Slug蛋白的穩(wěn)定性和抑制EMT來發(fā)揮抑制GC轉(zhuǎn)移的作用，其低表達提示GC患者預后不良。Qi et al[18]研究證明lncRNA MALAT1招募EZH2抑制PCDH10并促進胃癌轉(zhuǎn)移。近期，有研究[19]顯示MALAT1 在血管生成過程中也發(fā)揮重要作用，利用150例GC標本的原位雜交和CD31/高碘酸-希夫雙重染色顯示MALAT1表達與血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)和內(nèi)皮細胞的密度密切相關(guān)。敲低MALAT1顯著降低GC細胞遷移、侵襲、致瘤性、轉(zhuǎn)移和VM，同時限制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)血管生成和增加血管通透性。此外，MALAT1可以通過VE-鈣黏蛋白/β-連環(huán)蛋白復合物和ERK/MMP和FAK/paxillin信號通路促進VM和血管生成來促進GC中的致瘤性和轉(zhuǎn)移，因此，高MALAT1水平可以作為GC遠處轉(zhuǎn)移的潛在生物標志物。

3 lncRNA對胃癌化療耐藥的影響

化療是大多數(shù)晚期腫瘤患者最重要的治療手段，然而化療耐藥的產(chǎn)生往往是治療惡性腫瘤最大的障礙，因此，研究化療耐藥的機制以及如何克服化療耐藥性是腫瘤治療中亟待解決的難題。當然，lncRNA作為當前科學界的明星分子，其在胃癌中的異常表達亦與化療耐藥具有顯著的相關(guān)性。

Shang et al[20]研究發(fā)現(xiàn)，尿路上皮癌胚抗原1(urothelial carcinoma antigen,UCA1)在胃癌組織和細胞中高度表達，其高表達水平與胃癌的惡性病理特征呈正相關(guān)性，沉默UCA1顯著抑制胃癌BGC-823和SGC7901細胞的增殖。此外，沉默UCA1可抑制胃癌阿霉素(ADR)耐藥細胞(SGC7901/ADR)對阿霉素的耐藥性。進一步探索其機制顯示，沉默UCA1可誘導SGC7901/ADR細胞的晚期凋亡，上調(diào)裂解蛋白表達以及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，因此，UCA1作為致癌基因可調(diào)控GC細胞惡性增殖以及可能通過凋亡途徑介導阿霉素耐藥性。Lan et al[21]研究發(fā)現(xiàn)在INK4位點的反義非編碼RNA(antisense noncoding RNA in the INK4 locus,ANRIL)在順鉑(DDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)耐藥患者的GC組織以及GC細胞系中高度表達。另外，用ANRIL siRNA轉(zhuǎn)染并用DDP和5-FU處理的BGC823/DDP和BGC823/5-FU細胞分別顯示出存活率降低、侵襲能力減弱以及凋亡性腫瘤細胞的比例增多。通過測量BGC823/DDP和BGC823/5-FU細胞對DDP和5-FU的IC50值，評估敲低ANRIL對多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的影響，結(jié)果顯示，沉默ANRIL降低了GC細胞的IC50值。此外，qRT-PCR和Western blot顯示，ANRIL基因敲低降低MDR1和MRP1(均為MDR相關(guān)基因)的表達，回歸分析顯示，ANRIL的表達與MDR1和MRP1的表達呈正相關(guān)性，總而言之，GC細胞中ANRIL的敲低可抑制MDR的發(fā)生，為GC治療逆轉(zhuǎn)MDR提供了有效的靶標。Shang et al[22]研究證實癌癥易感候選基因9(cancer susceptibility candidate 9,CASC9)在GC細胞及組織中高表達，且與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均具有較好的相關(guān)性。此外，研究[22]通過MTT法測定顯示紫杉醇和阿霉素在耐藥細胞系BGC823/DR和SGC7901/DR細胞的IC50值較其在BGC823和SGC7901細胞中的IC50值顯著增高，表明CASC9過表達可能參與GC細胞的化學耐藥。敲低CASC9抑制耐藥GC細胞的生長和侵襲以及化學耐藥性，并能恢復GC細胞對紫杉醇和阿霉素的化療敏感性。通過Western blot實驗測定BGC823/DR和SGC7901/DR細胞在CASC9敲除前后的MDR1表達水平，表明CASC9的敲低與MDR表達呈正相關(guān)性。總之，lncRNA CASC9在GC中過表達，可以促進GC細胞增殖及紫杉醇和阿霉素的化療耐藥，為胃癌治療提供新靶點。

4 血液及胃液中l(wèi)ncRNA在胃癌中作用

由于GC的診斷金標準為胃鏡下取材活檢，切取組織時為侵入性手段，增加了患者的痛苦體驗，不利于多次取材監(jiān)測患者的腫瘤動態(tài)變化。因此，尋找可以代替GC組織活檢，并具有高度靈敏性和特異性的腫瘤標志物十分有意義，而血液、胃液中穩(wěn)定存在的lncRNA，有望成為GC診斷及腫瘤動態(tài)監(jiān)測的分子標志物。

Zhou et al[23]在70對GC患者和正常對照者中驗證了lncRNA H19表達水平在GC患者血漿中顯著升高，進一步通過ROC曲線分析顯示，ROC曲線下面積(AUC)為0.838，因此，H19高表達有助于GC的早期診斷。此外，術(shù)后樣本中H19的血漿水平顯著低于術(shù)前樣本。所以，血漿H19可以作為GC診斷和監(jiān)測術(shù)后腫瘤動態(tài)的潛在生物標志物。Jin et al[24]利用qRT-PCR用于大規(guī)模分析GC患者血清lncRNA HULC表達，可靠地檢測到循環(huán)HULC，并顯示其在GC患者中上調(diào)。血清HULC表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及幽門螺桿菌感染相關(guān)。HULC ROC的AUC達0.888，高于CEA(0.694)和CA72-4(0.514)。并通過隨訪檢測和Kaplan-Meier曲線分析顯示HULC是GC預后的良好預測指標。Shao et al[25]證實相較于癌旁組織，lncRNA線粒體RNA處理核糖核酸內(nèi)切酶RNA組分(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease, RMRP)表達水平在GC組織中顯著降低，與Borrmann分型、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、周圍神經(jīng)侵襲以及CEA和CA199表達密切相關(guān)。通過克隆測序技術(shù)證實血漿、胃液中也存在RMRP，且表達相對穩(wěn)定，經(jīng)ROC曲線分析血漿、胃液RMRP作為GC篩查標志物具有較高的靈敏度和特異性。進一步研究其機制顯示，RMRP可充當miR-206海綿，通過調(diào)控下游靶基因Cyclin D2表達發(fā)揮其調(diào)控細胞周期的效應，在GC中發(fā)揮抑癌作用，因此，血漿及胃液RMRP有望成為胃癌篩查和預后的潛在標志物。

5 lncRNA對胃癌預后的影響

由于lncRNA在GC細胞增殖與凋亡、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥中均發(fā)揮了重要作用，因而在某種程度上，lncRNA對GC的預后也產(chǎn)生一定的影響，因此，通過干預GC中l(wèi)ncRNA的表達來改善患者的預后，提高生存率，有望成為GC治療的一種新策略。

表1 長鏈非編碼RNA在胃癌中的作用

Zhang et al[26]研究顯示，與相應非腫瘤組織而言，ANRIL在GC組織中表達上調(diào)，與腫瘤大小和TNM分期相關(guān)，可作為GC總生存期的獨立預后因子，而且ANRIL可以在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)細胞生長。此外，研究者證明ANRIL可以通過結(jié)合PRC2表觀遺傳沉默miR-99a/miR-449a，從而調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和CDK6/E2F1通路，這在一定程度上可以解釋ANRIL介導細胞生長調(diào)節(jié)。通過ANRIL沉默miR-449a釋放E2F1表達，同時上調(diào)的E2F1反過來促進ANRIL表達，從而形成正反饋環(huán)，繼續(xù)促進GC細胞增殖。因此，ANRIL可以在表觀遺傳學水平與microRNAs相互作用，影響GC的預后。有研究[27]證實，富含核富集的轉(zhuǎn)錄物1(nuclear enriched abundant transcript1，NEAT1)在GC組織和細胞系中過表達，并與臨床分期、組織學類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與低表達NEAT1的患者相比，高表達 lncRNA NEAT1的患者預后更差。單因素和多因素Cox回歸分析顯示，NEAT1過表達是GC患者預后不良的獨立預后因素。Lü et al[28]報道了BC032469在GC組織中過表達，其表達水平與GC患者腫瘤大小、分化程度、生存期呈正相關(guān)性，下調(diào)BC032469在體外和體內(nèi)顯著抑制細胞增殖。深入研究其機制顯示，BC032469可以直接結(jié)合miR-1207-5p，并有效地作為miR-1207-5p的海綿來抑制端粒酶催化亞單位基因(hTERT)下調(diào)。因此，BC032469可以作為內(nèi)源性競爭性RNA(ceRNA)起作用以抑制miR-1207-5p依賴性hTERT下調(diào)，這表明其可能作為胃癌預后不良的生物標志物。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，lncRNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，其既可作為原癌基因促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，亦可作為抑癌基因來抑制腫瘤的進展與轉(zhuǎn)移，還可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，以及在GC的預后判斷中發(fā)揮重要作用(表1)。因此，通過檢測胃癌相關(guān)lncRNA的表達有望為胃癌患者的診斷、治療以及預后判斷提供依據(jù)。雖然在腫瘤組織中越來越多異常表達的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，但是，其發(fā)揮生物學功能的具體分子機制，以及如何將基礎研究向臨床應用轉(zhuǎn)化，仍然是該研究領域所面臨的巨大挑戰(zhàn)。而且，目前在lncRNA研究領域，尚無統(tǒng)一的命名原則，且關(guān)于lncRNA的數(shù)據(jù)庫還不夠完善，以及用于研究lncRNA的新技術(shù)不多等難題都需要進一步的探索，因此關(guān)于lncRNA能否在臨床領域得以應用，還有很長的路要走。