激素受體陽性乳腺癌患者CYP2D6基因多態(tài)性及拷貝數(shù)變異與他莫昔芬治療預(yù)后的相關(guān)性研究

李涌濤,齊新海,巴合提·哈立亞,張明帥,蔣威華,王曉文,甫拉提·吾瓦力汗

我國乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，已成為女性高發(fā)的惡性腫瘤，其中2/3以上的乳腺癌患者雌激素受體陽性，其發(fā)生發(fā)展與患者體內(nèi)雌激素相關(guān)[1]。與此相對應(yīng)，乳腺癌的內(nèi)分泌治療臨床療效確定、耐受性好，同時經(jīng)濟、便于患者持久服用，是乳腺癌的重要治療手段。在激素敏感性乳腺癌的輔助治療中，他莫昔芬在乳腺癌內(nèi)分泌治療領(lǐng)域一直占有主導(dǎo)地位，但是臨床上約有30%～50%的乳腺癌患者對他莫昔芬發(fā)生耐藥[2]，近年來，他莫昔芬藥物代謝酶之一細胞色素氧化酶P450 2D6(cytochrome P450 2D6，CYP2D6)遺傳多態(tài)變異對他莫昔芬的療效及復(fù)發(fā)率和生存期具有明顯相關(guān)性，該實驗對不同結(jié)局的激素敏感性乳腺癌患者CYP2D6基因單核苷酸多態(tài)性和拷貝數(shù)變異情況進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1病例資料選取來自2008年1月～2012年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)的乳腺癌患者，患者均有明確的乳腺癌病理診斷，均為浸潤性乳腺癌，其激素受體陽性，且表達均在10%以上，人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)陽性的患者均接受曲妥珠單抗治療1年，所有患者在化療或放療結(jié)束后口服他莫昔芬進行內(nèi)分泌治療。所有患者在進行內(nèi)分泌治療前(即接受規(guī)范化的化療或放療結(jié)束后)進行了相關(guān)的檢查，無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的臨床征象，所有患者服用他莫昔芬時間超過6個月。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查，所有患者簽署知情同意書。共納入253 例乳腺癌患者進行CYP2D6基因分型和拷貝數(shù)變異檢測，這些患者均為女性，年齡28～67歲，其中漢族126例，維吾爾族78例，哈薩克族49例；病理類型浸潤性導(dǎo)管癌239例，浸潤性小葉癌12 例，髓樣癌1 例，黏液癌1 例?；颊呦嚓P(guān)臨床病理資料見表1。

1.2乳腺癌預(yù)后的判定及分組局部復(fù)發(fā)是指在患側(cè)乳腺或胸壁發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)病灶，且均活檢證實，同時將患側(cè)所屬區(qū)域經(jīng)活檢證實的腫大淋巴結(jié)也定位局部復(fù)發(fā)。轉(zhuǎn)移是指非患側(cè)所屬區(qū)域經(jīng)活檢證實的腫大淋巴結(jié)，或遠處器官，以活檢病理結(jié)果作為診斷依據(jù)，不易再次病理活檢的以前后影像學(xué)資料作為轉(zhuǎn)移診斷依據(jù)。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)入組的乳腺癌患者分為無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，各141例、112例。

1.3CYP2D6基因分型和拷貝數(shù)變異檢測留取患者5 ml外周靜脈血，保存在4 ℃的10 ml EDTA 抗凝管中。定期進行DNA 提取。對CYP2D6基因的編碼區(qū)、外顯子內(nèi)含子拼接區(qū)進行PCR 擴增，引物序列依據(jù)條件和要求進行設(shè)定。總體積25 μl 的PCR反應(yīng)體系包括以下成分：100 ng基因組DNA，15 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，10 /mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L 引物，0.2 μl TaqDNA聚合酶(5 U/μl)(美國Clontech公司)。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min 預(yù)變性后，進行35個周期的循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，最后一步72 ℃ 5 min)。

CYP2D6基因分型采用TaqMan實時熒光定量PCR技術(shù)。CYP2D6基因拷貝數(shù)測定采用上海天昊公司的AccuCopyTM多重基因拷貝數(shù)檢測試劑盒進行檢測。

1.4CYP2D6的等位基因及相應(yīng)的代謝表型劃分CYP2D6的等位基因與表型相關(guān)性參考人類細胞色素P450等位基因命名的信息委員會的網(wǎng)站(http://www.cypalleles.ki.se)。CYP2D6代謝表型的劃分參考CPIC(Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium)關(guān)于藥物基因組學(xué)的網(wǎng)站(https://www.pharmgkb.org)。依據(jù)CPIC指南將CYP2D6藥物代謝表型分為：超快代謝型(ultrapid metabolizers，UM)、泛代謝型(extensive metabolizers，EM)、中間代謝型(intermedia metabolizers，IM)和弱代謝表型(poor metabolizers，PM)。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進行分析。本研究所有數(shù)據(jù)為計數(shù)資料，兩組患者的基線特征比較、不同預(yù)后乳腺癌患者CYP2D6等位基因分布頻率、代謝表型及拷貝數(shù)變異情況的比較均采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1患者臨床病理特征及基線特征情況比較將兩組患者的年齡、月經(jīng)情況、民族、分期、Her-2情況、組織學(xué)分級進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，基線特征基本一致。

2.2不同預(yù)后乳腺癌患者的CYP2D6等位基因多態(tài)性及拷貝數(shù)檢測結(jié)果全部253例乳腺癌患者，無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組有4例患者、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組有2例患者血標(biāo)本未檢測到CYP2D6等位基因突變，即97.6%(247/253)的患者都檢測到了CYP2D6等位基因多態(tài)性或拷貝數(shù)變異情況。CYP2D6基因多拷貝的發(fā)生率為14.3%(36/253)，其中功能型等位基因(*1、*2)多拷貝表達發(fā)生率約2.8%(7/253)。依據(jù)CPIC指南關(guān)于等位基因突變對CYP2D6酶活性的影響，將 CYP2D6的等位基因及相應(yīng)的代謝表型劃分PM、IM、EM、UM四型，無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組患者PM型分別為0.73%(1/141)、1.82%(2/112)，IM型分別為10.22%(14/141)、12.73%(14/112)，EM型分別為83.94%(115/141)、85.45%(94/112)，UM型分別為5.11%(7/141)、0(0/112)。見表2。

表1 兩組患者的基線特征情況比較(n)

2.3不同預(yù)后乳腺癌患者CYP2D6基因代謝表型的比較UM型CYP2D6代謝表型患者共7例，均為功能等位基因*1、*2多拷貝所致。無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組乳腺癌患者CYP2D6代謝表型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

但是分別將不同代謝表型在兩組患者中的表達變異進行比較(表4)，結(jié)果顯示無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組有7例UM，而復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組未發(fā)現(xiàn)有UM，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。即存在功能等位基因*1、*2多拷貝的乳腺癌患者，在服用他莫昔芬治療后，效果更好。

2.4不同預(yù)后乳腺癌患者CYP2D6基因拷貝數(shù)變異的比較CYP2D6基因除有單核苷酸多態(tài)性外，還存在拷貝數(shù)變異情況，因此又依據(jù)CYP2D6不同等位基因的拷貝數(shù)情況，對不同預(yù)后乳腺癌患者進行比較，結(jié)果見表5，可見不同預(yù)后兩組乳腺癌患者CYP2D6 基因拷貝數(shù)變異的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 不同預(yù)后乳腺癌患者的CYP2D6等位基因分型及代謝表型結(jié)果

表3 不同預(yù)后乳腺癌患者CYP2D6基因代謝表型的比較[n(%)]

表4 不同代謝表型在不同預(yù)后乳腺癌患者中的表達變異比較(n)

表5 不同預(yù)后乳腺癌患者CYP2D6基因拷貝數(shù)變異的比較

3 討論

新疆作為西部欠發(fā)達地區(qū)，在激素敏感性乳腺癌的輔助治療中，他莫昔芬由于經(jīng)濟、便于患者持久服用，在乳腺癌內(nèi)分泌治療領(lǐng)域一直占有主導(dǎo)地位。但是臨床上約有30%～50%的乳腺癌患者對他莫昔芬發(fā)生耐藥[3-4]。CYP2D6是細胞色素氧化酶P450酶系中的一個重要成員，是他莫昔芬在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶[5]，相關(guān)研究[6]顯示其具有基因多態(tài)性，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名了70多個等位基因。而CYP2D6基因遺傳多態(tài)變異則很可能是導(dǎo)致他莫昔芬療效及不良反應(yīng)的內(nèi)在因素。在本研究中，253例新疆地區(qū)激素受體陽性乳腺癌患者的CYP2D6基因單核苷酸多態(tài)性及拷貝數(shù)變異情況進行檢測，97.6%(247/253)的患者都檢測到了CYP2D6等位基因多態(tài)性或拷貝數(shù)變異情況。

在人體內(nèi)，4-羥基他莫昔芬和4-羥-N-去甲基他莫昔芬與雌激素受體的親和力顯著高于他莫昔芬，是體內(nèi)抗雌激素的主要活化成分[7]。在CYP2D6代謝酶的介導(dǎo)下，他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬形成4-羥基他莫昔芬和4-羥-N-去甲基他莫昔芬。依據(jù)CPIC關(guān)于CYP2D6藥物代謝表型指南，將研究的乳腺癌患者分為UM、EM、IM和PM[8]。相關(guān)研究[9-10]顯示，攜帶CYP2D6基因多拷貝的超快代謝型個體的4-羥基他莫昔芬和4-羥-N-去甲基他莫昔芬成分顯著高于快代謝型及慢代謝型個體，這揭示超快代謝型個體用他莫昔芬治療效果會更好。本研究顯示預(yù)后好的無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，有7例UM，而復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組未發(fā)現(xiàn)有UM，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這個結(jié)果顯示存在功能等位基因*1、*2多拷貝的乳腺癌患者，在服用他莫昔芬治療后，效果更好。這個結(jié)果與意大利的一項他莫昔芬預(yù)防試驗[11]和德國的一項關(guān)于不同基因分型個體接受他莫昔芬治療效果[12]的研究結(jié)論相一致。

CYP2D6基因突變發(fā)生的主要原因除了有單核苷酸變異(堿基的插入、刪除或重組)，還存在拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)，即大片段基因的缺失以及基因的復(fù)制或擴增[13]。CYP2D6基因CNVs可以引起重要的代謝表型多態(tài)性。比如功能型等位基因(*1、*2)多拷貝表達可以引起酶的活性增加。相關(guān)研究[6]報道，在高加索人及亞洲人中，CYP2D6*1×2、CYP2D6*2×2的發(fā)生率約為0.5%～1.5%，而在非洲人群中約為1.6%～3.3%。在本研究中，CYP2D6基因多拷貝的發(fā)生率為14.3%(36/253)，其中功能型等位基因(*1、*2)多拷貝表達發(fā)生率約2.8%(7/253)，UM型CYP2D6代謝表型患者均為功能等位基因*1、*2多拷貝所致。將不同預(yù)后的乳腺癌患者分為兩組，分別將這兩組患者的拷貝數(shù)情況進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因為CYP2D6功能基因多拷貝變異發(fā)生率低，本研究樣本例數(shù)相對較少，還需要更多樣本量的試驗去進一步的探索。

本研究結(jié)果提示，存在功能等位基因*1、*2多拷貝的乳腺癌超快代謝型患者，在服用他莫昔芬治療后，效果更好。但CYP2D6功能基因多拷貝變異發(fā)生率低，需要更大的樣本量去研究驗證。CYP2D6基因的多態(tài)性及拷貝數(shù)變異情況在指導(dǎo)臨床他莫昔芬用藥、預(yù)測藥物療效等方面具有重要意義。后期還需要進一步的研究該基因的多態(tài)性及拷貝數(shù)變異情況，為他莫昔芬個體化治療、提高治療有效性和改善患者生存率提供理論依據(jù)。