以“甘潤濡養(yǎng)”立法的啟膈方抑制裸鼠食管癌肺轉(zhuǎn)移的研究

史會娟 ，薛健雄 ，石冬璇 ，孔令玉 ，李晶 *

食管癌發(fā)病有明顯的地域性差別，我國食管癌的發(fā)病率是世界平均發(fā)病率的2倍［1］。河北省磁縣、涉縣食管癌發(fā)病率和病死率均高居世界榜首［2］。而轉(zhuǎn)移是導致食管癌患者死亡的主要原因。即使行食管癌根治術(shù)的患者約50%在術(shù)后2～3年仍會發(fā)生局部復發(fā)或遠處器官轉(zhuǎn)移［3］。我國食管癌患者的5年生存率僅為20.9%［4］。因此，尋求抑制食管癌轉(zhuǎn)移的有效方法是目前的重要課題。

本課題組長期從事食管癌防治研究，提出食管癌（噎膈）的核心病機是“血液衰耗，胃脘干槁”［5］。瘀血、痰阻、逆氣只是其不同階段派生的不同表現(xiàn)，而非噎膈之本質(zhì)。尤其對于食管癌切除術(shù)后患者，只有徹底改變“血液衰耗，胃脘干槁”的狀態(tài)，應用“甘潤濡養(yǎng)”之法，從食管癌的本質(zhì)著手，才能徹底抑制食管癌轉(zhuǎn)移。本研究旨在探討以“甘潤濡養(yǎng)”立法的啟膈方對尾靜脈注射食管癌細胞裸鼠肺轉(zhuǎn)移的影響，并探討其作用機制，以期為以“甘潤濡養(yǎng)”立法抑制食管癌肺轉(zhuǎn)移提供更多基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及實驗動物 穩(wěn)轉(zhuǎn)Luciferase熒光素酶基因的人源性食管癌細胞株KYSE-150-Luc和熒光素酶底物購于上?？七h迪生物科技有限公司；BABL/c裸鼠共21只，5周齡，體質(zhì)量18～20 g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011 NO.11400700208569，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院實驗動物中心（SPF級）。

1.1.2 主要儀器及試劑 動物活體成像系統(tǒng)（NightOWL）購于德國Berthold公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶購于美國GIBCO公司；二甲基亞砜（DMSO）購于北京索萊寶科技有限公司；啟膈方藥物購自河北省石家莊市樂仁堂總店，由石家莊以嶺藥業(yè)制成水提凍干粉保存；卡培他濱片（希羅達，0.5 g×12片）產(chǎn)自上海羅氏制藥有限公司，產(chǎn)品批號SH2085。

1.2 實驗方法 本研究時間為2017年2—10月。

1.2.1 藥物制備 啟膈方提取物（QGF）制備：郁金25 g，沙參25 g，丹參15 g，浮小麥5 g，浙貝10 g，茯苓10 g，砂仁10 g，荷葉5 g，清夏10 g，天冬25 g，山藥25 g，為70 kg左右成人每人每日用量，采用水提法制備提取物凍干粉，約30 g。將凍干粉分裝并儲存于-80 ℃冰箱，應用時用完全培養(yǎng)基配制、倍比稀釋，并用濾器過濾。按照公式：小鼠給藥劑量（mg/kg）=9.1×人（70 kg）給藥劑量。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 低分化食管癌細胞株KYSE-150-Luc培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃、5% CO2、飽和濕度）連續(xù)培養(yǎng)。于倒置顯微鏡下觀察，待細胞貼壁生長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。每2～3 d換液1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.3 建立裸鼠食管癌肺轉(zhuǎn)移模型 取對數(shù)生長期的穩(wěn)轉(zhuǎn)Luciferase熒光素酶標記的低分化食管癌細胞株KYSE-150-Luc細胞消化，1 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），制成單細胞懸液，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×106/ml，用1 ml注射器接種于BABL/c裸鼠尾靜脈，每只100 μl，共接種21只。

1.2.4 分組及用藥情況 將接種癌細胞的裸鼠隨機分為對照組（7只）、卡培他濱組（7只）和啟膈方組（7只）。接種后第3天，對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃0.2 ml/d，卡培他濱組給予卡培他濱溶液（濃度400 mg/kg）灌胃0.2 ml/d，啟膈方組給予QGF溶液（濃度3 913 mg/kg）灌胃0.2 ml/d。其中卡培他濱組每灌胃2周停藥1周。3組均灌胃給藥12周，而后正常飲水、飲食。

1.2.5 動物活體成像系統(tǒng)觀測裸鼠肺轉(zhuǎn)移情況 接種后第4周應用動物活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤情況，使用WinLight 32軟件評估信號強度。觀測前每只裸鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉（劑量為35 mg/kg），待裸鼠完全麻痹后（3～5 min）按150 mg/kg腹腔注射0.2 ml由PBS稀釋的熒光素酶底物，10 min后通過動物活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤情況。之后每2周用動物活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠轉(zhuǎn)移瘤情況。接種后第16周統(tǒng)一脫頸處死裸鼠，取肺組織，觀察各組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)大小數(shù)目，記錄裸鼠體質(zhì)量。

1.2.6 Western blotting法檢測肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織中E鈣黏蛋白（E-cad）、角蛋白（KRT）8、snail、間隙連接蛋白（Connexin）43、WNT2表達水平 接種后第16周統(tǒng)一脫頸處死裸鼠，取肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織，每組標本取0.5 cm3小塊置于-80 ℃冰箱中備用；其余肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織置于10%福爾馬林中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，預備HE染色用。

將剪刀、鑷子等高壓滅菌后，用剪刀將組織切成綠豆大小的碎塊，后置于組織研磨器中，加入300 μl的蛋白裂解液和2 μl的苯甲基磺酰氟（PMSF），置于冰上充分研磨，并做標記。將研磨后的組織放入1.5 ml的EP管中，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），提取上清液至另一EP管中，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的操作步驟進行蛋白定量檢測。將Cx32與5×上樣緩沖液混合均勻，100 ℃沸水浴加熱5 min使蛋白變性，冷卻后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜、封固，一抗結(jié)合過夜，洗膜，二抗（Donkey Anti-Rabbit IgG H&L preadsorbed）結(jié)合。TTBS室溫洗膜3次，10 min/次，采用成像分析軟件對Western blotting顯色區(qū)帶的信號強度進行相對定量分析，掃描結(jié)果用灰度值表示。實驗獨立重復3次。

1.2.7 各組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織HE染色形態(tài)學觀察 取石蠟包埋肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織，將蠟塊切成4 μm的切片后常規(guī)脫蠟。使用蘇木素染色3 min，自來水沖洗2 min。過1%鹽酸酒精20 s后取出，自來水沖洗2 min，氨水返藍20 s，自來水沖洗2 min。伊紅溶液染色2 min，后依次進入70%酒精、80%酒精、95%酒精各5 min，無水乙醇10 min。晾干，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LDS-t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組裸鼠死亡情況 第16周末共16只裸鼠存活，5只死亡（其中對照組第73天死1只，第107天死1只；卡培他濱組第84天死1只，第109天死1只，第111天死1只）。

2.2 動物活體成像系統(tǒng)觀察結(jié)果 接種后第12周在肺部區(qū)域檢測到腫瘤細胞的生物發(fā)光信號，提示出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。其中啟膈方組和卡培他濱組光子強度均低于對照組（見圖1）。

2.3 3組體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比比較 3組第4、8、12、16周體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組、啟膈方組第4、8、12、16周體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比大于卡培他濱組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組第4、8、12、16周體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比小于啟膈方組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.4 3組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較 3組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)多于啟膈方組、卡培他濱組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；啟膈方組和卡培他濱組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表2）。

2.5 3組 肺 轉(zhuǎn) 移 結(jié) 節(jié) 組 織 中 E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT2表 達 水 平 比 較 3組 E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT2表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。啟膈方組及卡培他濱組E-cad、KRT8、Connexin43表達水平高于對照組，snail、WNT2表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；卡培他濱組E-cad、KRT8、Connexin43表達水平低于啟膈方組，snail、WNT2表達水平高于啟膈方組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3、圖2）。

表1 3組裸鼠體質(zhì)量與初始體質(zhì)量百分比比較（x±s，%）Table 1 Ratios of baseline weight to the weight at the end of 4，8，12，16 weeks of intervention in 3 groups of nude mice

圖1 動物活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠肺轉(zhuǎn)移情況Figure 1 Lung metastasis from esophageal cancer in nude mice observed by using in vivo small animal imaging

表2 3組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較（x±s，個）Table 2 Compare the number of lung metastatic nodules between 3 groups of nude mice

2.6 形態(tài)學 肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織經(jīng)HE染色后鏡下觀察（×200）發(fā)現(xiàn)，3組裸鼠腫瘤組織均呈巢狀生長，腫瘤細胞排列密集，異質(zhì)性明顯。3組均未見明顯腫瘤細胞壞死征象，結(jié)合活體成像及肺組織表面結(jié)節(jié)數(shù)結(jié)果考慮，啟膈方組及卡培他濱組均抑制了食管癌細胞肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，但在促進食管癌腫瘤細胞凋亡上效果并不明顯（見圖3）。

圖2 Western blotting法檢測3組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT 表達水平Figure 2 Western blotting results of the expression levels of E-cad，kRT8，snail，Connexin43 and WNT in lung metastases of 3 groups of nude mice

3 討論

食管癌根據(jù)其臨床表現(xiàn)，歸屬于中醫(yī)學的“噎膈”范疇?！秲?nèi)經(jīng)》云“三陽結(jié)，謂之膈。飲食不下，膈噎不通，食則吐?！迸R床中可觀察到食管癌患者常表現(xiàn)為大便干結(jié)、口苦咽干等胃陰衰耗征象。因此，本研究組提出食管癌的核心病機為“血液衰耗，胃脘干槁”。只有針對這一核心病機“甘潤濡養(yǎng)”，才能徹底改變患者的“干槁”狀態(tài)，防止轉(zhuǎn)移發(fā)生。啟膈方是由清代程鐘齡《醫(yī)學心悟》中的啟膈散化裁而成，以“甘潤濡養(yǎng)”立法。前期研究發(fā)現(xiàn)其能夠穩(wěn)定病灶、提高生存質(zhì)量、延長生存期［6］；初步研究發(fā)現(xiàn)啟膈方可明顯增強食管癌細胞間隙連接［7］，增強食管癌細胞間同質(zhì)黏附［8］，抑制食管癌細胞微絲骨架重構(gòu)［9］，從而降低食管癌細胞的侵襲能力及遷移能力［7-9］。

上皮細胞間質(zhì)化（EMT）是腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程［10-11］。上皮細胞通過間質(zhì)化改變使細胞同質(zhì)黏附減弱、細胞骨架重構(gòu)，從而獲得更強的遷移能力。Snail是鋅指轉(zhuǎn)錄的snail超家族的成員，是EMT的調(diào)控因子之一，具有促進細胞遷移的能力［12-13］；KRT8作為細胞骨架中間絲蛋白最大的亞型，對維持上皮細胞的穩(wěn)態(tài)具有重要意義，并具有調(diào)節(jié)癌細胞信號傳導的功能［14］；E-cad能維持細胞間黏附的穩(wěn)定和上皮細胞的極性，抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，E-cad功能喪失可促進EMT；Connexin被認為是一類腫瘤抑制基因。有研究證實食管癌細胞轉(zhuǎn)移常伴有Connexin的異常定位和表達［7，15-16］。

本研究通過建立裸鼠食管癌肺轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)應用啟膈方后肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量低于對照組，說明啟膈方具有抑制食管癌肺轉(zhuǎn)移的作用。Western blotting結(jié)果顯示啟膈方能夠升高食管癌細胞中細胞骨架蛋白KRT8、Connexin43表達水平，降低EMT相關(guān)蛋白E-cad、snail、WNT2表達水平，說明啟膈方通過增強細胞連接的穩(wěn)定性，抑制細胞骨架重構(gòu)，從而抑制EMT來進一步抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。但HE染色發(fā)現(xiàn)腫瘤組織并未出現(xiàn)明顯的壞死征象，提示啟膈方可能并不是通過細胞毒性作用來抑制食管癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

圖3 裸鼠肺轉(zhuǎn)移組織形態(tài)學（HE染色，×200）Figure 3 Microscopic examination of lung metastases

表3 3組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)組織E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT2表達水平比較（x ±s，灰度值/內(nèi)參灰度值）Table 3 Expression levels of E-cad，KRT8，snail，Connexin43 and WNT2 in lung metastases of 3 groups of nude mice

綜上所述，啟膈方能夠抑制食管癌肺轉(zhuǎn)移，可能與其增強裸鼠間隙連接、抑制EMT有關(guān)，且啟膈方在控制裸鼠體質(zhì)量減輕上效果明顯優(yōu)于卡培他濱。