二甲雙胍增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞對吉西他濱敏感性機(jī)制的研究

鄧海山 俞文隆

膽管癌是一種死亡率極高的惡性腫瘤，無明顯早期癥狀且病程進(jìn)展迅速[1]。腫瘤細(xì)胞的侵襲性和對治療藥物的不敏感性是導(dǎo)致膽管癌不良預(yù)后的主要因素[2]。丙酮酸激酶 M2（pyruvate kinase M2,PKM2）是糖酵解途徑中一種重要的限速酶。PKM2在腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性過程中起到重要作用，而靶向作用于PKM2能夠有效提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。研究表明，PKM2表達(dá)的上調(diào)與腫瘤細(xì)胞對吉西他濱和順鉑的敏感性降低有關(guān)[3-4]。二甲雙胍是一種常用的口服降糖藥，體內(nèi)及體外研究均發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗癌作用，且可下調(diào)PKM2的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[5-7]。線粒體是細(xì)胞的能量源，在腫瘤細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮著重要作用[8]。基于已有的研究，本研究將二甲雙胍用于膽管癌細(xì)胞，進(jìn)一步探討二甲雙胍對PKM2表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而闡明其增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞對吉西他濱敏感性的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 10%FBS（批號：11875-093）和 1%青霉素鏈霉素（批號：15070-063）均購自美國GIBCO-Invitrogen公司；Trizol試劑（批號：15596-026）購自美國Ambion公司；qPCR檢測試劑盒（批號：QP001）購自廣州復(fù)能基因有限公司；PKM2激動劑ML265（批號：1221186-53-3）購自美國 Targetmol公司；二甲雙胍（批號：D9351）和吉西他濱（批號：G8970）均購自北京索萊寶科技有限公司；線粒體膜電位檢測（JC-1）試劑盒（批號：C2006）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）定量檢測試劑盒（批號：C0016）均購自中國碧云天生物技術(shù)公司；乳酸定量檢測試劑盒（批號：A019-2-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號：QuantStudio 6）購自美國 Applied Biosystems（ABI）公司；微量分光光度計(jì)（型號：Nano-100）購自杭州奧盛儀器有限公司；酶標(biāo)儀（型號：MULTISKAN MK3）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；細(xì)胞超聲破碎儀（型號：SCIENTZIID）購自寧波新芝生物科技股份有限公司；熒光顯微鏡（型號：IX51）購自奧林巴斯（中國）有限公司。

1.1.3 細(xì)胞 人膽管癌細(xì)胞HCC9810和RBE細(xì)胞系由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組 人膽管癌細(xì)胞HCC9810和RBE在含有10%FBS和1%青霉素鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，并分為以下各組：（1）HCC9810/RBE+溶劑組：HCC9810/RBE細(xì)胞在含有終濃度5%二甲基亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；（2）HCC9810/RBE+吉西他濱組：HCC9810/RBE細(xì)胞在含有終濃度為100 nmol/L吉西他濱（溶于5%DMSO）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；（3）HCC9810/RBE+二甲雙胍+吉西他濱組：HCC9810/RBE細(xì)胞在含有終濃度為10 mmol/L二甲雙胍和100 nmol/L吉西他濱（溶于5%DMSO）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；（4）HCC9810/RBE+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組：HCC9810/RBE細(xì)胞在含有終濃度為10 mmol/L二甲雙胍、100 nmol/L吉西他濱和100 nmol/L ML265（溶于 5%DMSO）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h。

1.2.2 細(xì)胞存活率檢測 采用噻唑藍(lán)（MTT）染色法。將 HCC9810和RBE細(xì)胞系（5×104個(gè)/孔）接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁培養(yǎng)12 h。按上述分組，細(xì)胞加入藥物干預(yù)后，參考文獻(xiàn)[9]方法，吸出培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處吸光度（optical density,OD）值；Blank為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基。細(xì)胞存活率=（測試組OD570nm-Blank OD570nm）/（正常培養(yǎng)組OD570nm-Blank OD570nm）×100%。

1.2.3 細(xì)胞PKM2 mRNA表達(dá)水平檢測 采用qRTPCR法。用Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并應(yīng)用qPCR檢測試劑盒進(jìn)行PCR檢測。PKM2引物序列：正向引物：5'-GACGGAGGTGGAAAATGGTG-3'，反向引物：3'-CAGATGCCTTGCGGATGAAT-5'。PCR循環(huán)過程：95℃ 10 min預(yù)變性，95℃ 15 s變性，60℃退火延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量測定 藥物處理各組細(xì)胞后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，離心取上清液。根據(jù)乳酸定量檢測試劑盒操作方法進(jìn)行檢測，待測樣品用分光光度計(jì)檢測450 nm波長處OD值，根據(jù)試劑盒對照樣品檢測所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乳酸含量。

1.2.5 細(xì)胞LDH活性檢測 藥物處理各組細(xì)胞后，收集細(xì)胞加入PBS，利用細(xì)胞超聲破碎儀在冰上破碎細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。按照LDH定量檢測試劑盒操作手冊進(jìn)行處理后，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處OD值。根據(jù)試劑盒對照樣品檢測，LDH活性＝（樣品OD490nm－Blank OD490nm）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD490nm－標(biāo)準(zhǔn)Blank OD490nm）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.2.6 細(xì)胞線粒體凋亡檢測 采用JC-1染色法。細(xì)胞接種至小玻片上待長至單細(xì)胞層，4%多聚甲醛固定，然后加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min；孵育結(jié)束后，吸除上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次；加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液；熒光顯微鏡下觀察并拍照。綠色熒光增強(qiáng)，紅色熒光減弱，表明線粒體凋亡增加。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細(xì)胞存活率均降低（均P＜0.05）；與HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；與 HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）。RBE細(xì)胞各組的細(xì)胞存活率結(jié)果與HCC9810細(xì)胞類似，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞存活率比較（a：HCC9810細(xì)胞經(jīng)處理后各組細(xì)胞存活率比較；與HCC9810+溶劑組比較，*P＜0.05；與HCC9810+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05；b：RBE細(xì)胞經(jīng)處理后各組細(xì)胞存活率比較；與RBE+溶劑組比較，*P＜0.05；與RBE+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與RBE+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05）

2.2 各組細(xì)胞PKM2 mRNA表達(dá)水平比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組PKM2 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）；與HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組PKM2 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組PKM2 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。RBE細(xì)胞各組的PKM2 mRNA表達(dá)水平變化與HCC9810一致，見圖2。

圖2 各組細(xì)胞PKM2 mRNA表達(dá)水平比較（a：HCC9810細(xì)胞經(jīng)處理后各組細(xì)胞PKM2 mRNA表達(dá)水平比較；與HCC9810+溶劑組比較，*P＜0.05；與HCC9810+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05；b：RBE細(xì)胞經(jīng)處理后各組細(xì)胞PKM2 mRNA表達(dá)水平比較；與RBE+溶劑組比較，*P＜0.05；與RBE+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與RBE+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05）

2.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量均降低（均 P＜0.05）；與 HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量均降低（均P＜0.05）；HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組和HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RBE細(xì)胞各組的細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量結(jié)果與HCC9810類似，見圖3。

圖3 各組細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量比較（a：HCC9810細(xì)胞經(jīng)處理后各組細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量比較；與HCC9810+溶劑組比較，*P＜0.05；與HCC9810+吉西他濱組比較，△P＜0.05；b：RBE細(xì)胞經(jīng)處理后各組細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量比較；與RBE+溶劑組比較，*P＜0.05；與RBE+ 吉西他濱組比較，△P＜0.05）

2.4 各組細(xì)胞LDH活性比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組LDH活性均升高（均P＜0.05）；與HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組LDH活性均升高（均P＜0.05）；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組LDH活性降低（P＜0.05）。RBE細(xì)胞各組的LDH活性結(jié)果與HCC9810類似，見圖4。

圖4 各組細(xì)胞LDH活性比較（a：HCC9810細(xì)胞經(jīng)處理后各組細(xì)胞LDH活性比較；與HCC9810+溶劑組比較，*P＜0.05；與HCC9810+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05；b：RBE細(xì)胞經(jīng)處理后各組細(xì)胞LDH活性比較；與RBE+溶劑組比較，*P＜0.05；與RBE+吉西他濱組比較，△P＜0.05；與RBE+二甲雙胍+吉西他濱組比較，▲P＜0.05）

2.5 各組細(xì)胞線粒體凋亡情況比較 與HCC9810+溶劑組比較，HCC9810+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細(xì)胞線粒體凋亡均增加（綠色熒光增強(qiáng)，紅色熒光減弱）；與HCC9810+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組、HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265組細(xì)胞線粒體凋亡均增加（綠色熒光增強(qiáng)，紅色熒光減弱）；與HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱組比較，HCC9810+二甲雙胍+吉西他濱+ML265細(xì)胞線粒體凋亡減少（綠色熒光減弱，紅色熒光增強(qiáng)）。RBE細(xì)胞各組的線粒體凋亡結(jié)果與HCC9810類似，見圖5（插頁）。

圖5 各組細(xì)胞線粒體凋亡情況比較（線粒體膜電位檢測染色，×200）

3 討論

癌細(xì)胞傾向于貪婪地吸收葡萄糖進(jìn)行糖酵解，以調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展、維持和轉(zhuǎn)移，該過程被稱為“Warburg效應(yīng)”[10]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的糖酵解率增加大約30倍，這一特點(diǎn)促進(jìn)了糖酵解靶向抗腫瘤治療新方法的探索[11]。二甲雙胍是一種常用的口服降糖藥物，可通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路抑制Warburg效應(yīng)[12]，發(fā)揮抗腫瘤作用[5-6]。PKM2在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，并在Warburg效應(yīng)和腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，耐藥癌細(xì)胞表現(xiàn)出更高的糖酵解率，這表明以糖酵解途徑為突破點(diǎn)可能是降低癌細(xì)胞耐藥性的一種新的研究方向[13]。最新研究表明，PKM2高表達(dá)預(yù)示肝內(nèi)膽管癌惡性程度，且與不良預(yù)后有關(guān)[14]。本研究探討二甲雙胍對PKM2的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而闡明其促進(jìn)膽管癌細(xì)胞對吉西他濱敏感性的機(jī)制。

膽管癌主要是肝門部膽管癌，是膽管系統(tǒng)的第二大腫瘤。由于膽管癌的隱匿性發(fā)病和高度惡性，患者預(yù)后較差。膽管癌患者平均生存時(shí)間約為1年，5年生存率＜10%。即使是根治性手術(shù)切除后，患者5年生存率也只有20%～40%[15]。化療敏感性仍然是影響患者生存率的最重要因素之一。在本研究中，體外培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞株HCC9810和RBE細(xì)胞，并用化療藥物吉西他濱、二甲雙胍處理細(xì)胞，結(jié)果表明，與吉西他濱單獨(dú)處理相比，二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱處理后明顯降低了細(xì)胞存活率。乳酸是主要的糖酵解產(chǎn)物，具有促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移作用[16]。LDH是糖酵解的關(guān)鍵酶之一，是維持細(xì)胞糖酵解不可或缺的部分[17]。本研究結(jié)果表明，二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱明顯降低細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸含量，提高細(xì)胞LDH活性。JC-1染色結(jié)果表明，二甲雙胍增加了吉西他濱的促線粒體凋亡作用。以上結(jié)果表明，二甲雙胍和吉西他濱在抑制膽管癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)膽管癌細(xì)胞線粒體凋亡方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。在機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱抑制了HCC9810和RBE細(xì)胞中PKM2的表達(dá)；PKM2激動劑ML265減弱了二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱對膽管癌細(xì)胞促凋亡作用，說明PKM2可能介導(dǎo)二甲雙胍協(xié)同吉西他濱的促凋亡作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可能通過抑制膽管癌細(xì)胞PKM2的表達(dá)、激活線粒體凋亡來增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。