HPLC—QAMS法測定不同產(chǎn)地19批山茱萸中5種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量

孫玲 樊曉蘭 戴小麗

摘 要 目的：測定不同產(chǎn)地19批山茱萸中5種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量。方法：采用高效液相色譜（HPLC）-一測多評（QAMS）法。色譜柱為Agilent XDB-C18，流動相為甲醇-水，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為15 μL，檢測波長為240 nm。以山茱萸中的馬錢苷為內(nèi)參物，建立其與山茱萸中另外4種環(huán)烯醚萜苷類成分即莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷之間的相對校正因子并進行適用性評價后計算4種成分的含量；另采用HPLC-外標法測定19批藥材中上述5種成分的含量，比較兩種方法測定結果的差異，驗證QAMS法的準確性。結果：在適用性評價中，不同試驗條件下4種成分的相對校正因子的RSD均小于2%；兩種測定方法下，4種成分的含量比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均大于0.05）。結論：本研究建立的HPLC-QAMS法可用于山茱萸中5種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量測定，且方法準確、可靠、快速，成本更低。

關鍵詞 高效液相色譜法；一測多評法；山茱萸；環(huán)烯醚萜苷類；外標法；馬錢苷；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To determine the contents of 5 iridoid glycosides in 19 batches of Corni fructus from different origins. METHODS： HPLC-QAMS method was adopted. The determination was performed on Agilent XDB-C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃， and sample size was 15 μL. The detection wavelength was set at 240 nm. Using loganin in Corni fructus as internal standard， relative correction factors （RCF） of loganin to other 4 iridoid glycosides as monod glycosides， officinosides， cornus glucosides and cornus glucosides were established. The contents of 4 kinds of components were calculated after suitability evaluation. The contents of 5 kinds of components in 19 batches of samples were determined by HPLC external standard method. The differences of two methods were compared； the accuracy of QAMS was validated. RESULTS： RSDs of RCF for 4 components under different trial conditions were all lower than 2% in suitability evaluation. P value of content comparison of 4 components between 2 methods were all higher than 0.05. CONCLUSIONS： HPLC-QAMS method can be used for content determination of 5 iridoid glycoside in Corni fructus. It is accurate， reliable， rapid and less costly.

KEYWORDS HPLC method； QAMS method； Corni fructus； Iridoid glycosides； External standard method； Loganin； Content determination

中藥山茱萸為山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）的干燥成熟果肉，是一種常用的補益中藥，其味酸澀、性微溫，有溫補肝腎、固澀精氣之功效，用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等癥[1]，其主要產(chǎn)地有陜西、河南、浙江、山西等地，另外在安徽、四川等地也有部分種植。

已有研究從山茱萸中分離得到了環(huán)烯醚萜類、三萜類、鞣質類、黃酮類、有機酸及其酯類、糖類，以及蛋白質、氨基酸、維生素、揮發(fā)性成分和礦物質元素等[2]。其中，環(huán)烯醚萜苷類成分是山茱萸藥材中的一類重要成分，具有消炎、抗癌、防衰老、抗氧化、降血糖、強心、免疫調(diào)節(jié)活性等作用，主要活性成分包括莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷、馬錢苷、山茱萸裂苷等十余種[3]。因此，同步測定山茱萸中多個環(huán)烯醚萜苷類成分可以全面有效地評價山茱萸藥材的質量。但由于對照品價格昂貴等原因，在實際藥材生產(chǎn)和監(jiān)測中難以做到通過多指標測定來控制山茱萸的藥材質量。一測多評（QAMS）法是通過建立藥材中不同成分間的相對校正因子，測量藥材中其中一種成分的含量，進而計算出其余成分的含量，以實現(xiàn)對藥材中多個質量指標的測量的方法，該法已在白木通、三七、黃芩、柴胡等藥材中得以驗證[4-9]。

故本研究采用高效液相色譜（HPLC）-一QAMS法，以價格便宜、測定技術成熟的馬錢苷為內(nèi)參物，建立其與莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷等環(huán)烯醚萜苷類成分之間的相對校正因子，進而可以通過測定山茱萸中馬錢苷一種成分的含量，快速計算出其余4種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量，以實現(xiàn)對山茱萸藥材中多個環(huán)烯醚萜苷類成分含量的同步測定。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 HPLC儀，包括G1311A四元泵、G1313A 自動進樣器、G1316A 柱溫箱和Agilent Chem Station工作站（美國Agilent公司）；Dionex P680 HPLC儀，包括P680A 四元梯度泵，TCC-100柱溫箱和Chromeleon色譜工作站（美國Dionex公司）；AL-204電子分析天平、AE240 1/10萬電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；L535-1低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（ 昆山市超聲儀器有限公司）；DZF-6053 電熱真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；FW400A 高速萬能粉碎機（ 北京科偉永興儀器有限公司）；色譜柱有Agilent XDB-C18、Ultimate XB C18、Diamonsil C18、Kromasil C18，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 藥品與試劑

研究用19批山茱萸藥材分別于2016年9-10月采自浙江、安徽、四川、河南、陜西、山西等地，經(jīng)筆者本人鑒定為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉（使用時將果肉置于45 ℃恒溫箱中烘干，取出，粉碎、研磨，過4號篩，得山茱萸粉末，5 ℃干燥保存?zhèn)溆茫?；莫諾苷對照品（批號：111998-201602）、當藥苷對照品（批號：111742- 200501）、馬錢苷對照品（批號：111640-201606）均購自中國食品藥品檢定研究院；山茱萸苷對照品（批號：201602）、山茱萸裂苷對照品（批號：201605）均購自上海億欣生物科技有限公司，上述5種對照品經(jīng)峰面積歸一化法計算，純度均大于98%；甲醇為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 QAMS法基本原理

在一定的線性范圍內(nèi)，成分的量（質量或濃度）與檢測器響應值成正比，即f=W/A（W為濃度等，A為響應值，f為響應因子）。在多指標質量評價時，以藥材中某一典型組分（有對照品供應者）為內(nèi)參物，建立該組分與其他組分之間的相對校正因子，通過校正因子就可計算其他組分的含量。這種通過測定一個成分可實現(xiàn)對多個成分定量的方法即為QAMS法。

假設某樣品中含有i 個組分，fi=Wi/Ai（i=1，2，…，k，…，m），式中Ai為組分i峰面積，Wi為組分i的量。選取其中一個組分k為內(nèi)參物，建立組分k與其他組分m之間的相對校正因子（fkm）=fk/fm=（Wk×Am）/（Wm×Ak）；由此可導出定量計算公式：Wm=（Wk×Am）/（fkm×Ak）；式中Ak為內(nèi)參物峰面積，Wk為內(nèi)參物的量，Am為其他組分m的峰面積；Wm為其他組分m的量。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min，18%～20%A，11～20 min，27%～30%A，21～35 min，32%～35%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：15 μL；檢測波長：240 nm。在上述色譜條件下，取“2.3”項下的混合對照品溶液和供試品溶液（產(chǎn)地：浙江淳安）進樣分析，結果各待測峰間及與相鄰峰間的分離度均大于1.5，表明系統(tǒng)適用性良好。2種溶液的色譜圖見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液

稱取莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷、馬錢苷和山茱萸裂苷對照品適量，精密稱定，分別為49.58、3.81、2.03、32.28、17.36 mg。取上述對照品分別置于10 mL量瓶中，加75%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密吸取上述對照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加75%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液，5 ℃保存，備用。

2.3.2 供試品溶液

精密稱取山茱萸干燥粉末0.5 g，放入圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，搖勻，稱定質量；室溫超聲（功率：1 100 W，頻率：40 kHz）提取30 min，再次稱定質量，用75%甲醇補足損失的質量，室溫下離心（4 000 r/min、半徑17 cm）5 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系與定量限考察

精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液1、6、10、14、18、20 μL，注入色譜儀中，每個濃度進樣3次，取平均值。以進樣量為橫坐標（x，μg）、峰面積積分值為縱坐標（y）繪制標準曲線并進行回歸計算，得莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷、馬錢苷、山茱萸裂苷的標準曲線回歸方程及線性范圍；再按要求計算各成分的定量限。結果表明，各對照品進樣量與峰面積積分值間均具有良好的線性關系。5種成分的線性關系與定量限考察結果見表1。

2.4.2 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液15 μL，連續(xù)進樣6次，測定待測成分的峰面積，計算RSD。結果，莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷、馬錢苷、山茱萸裂苷峰面積的RSD分別為 0.49%、1.53%、1.33%、1.71%和0.64%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品（產(chǎn)地：浙江淳安）溶液15 μL，分別于制備后的0、2、6、12、18、24 h ，按“2.2”項下色譜條件進樣測定峰面積。結果顯示，待測成分莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷、馬錢苷、山茱萸裂苷峰面積的RSD分別為0.76%、1.16%、0.58%、1.35%和1.77%（n=6），表明供試品溶液中5種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗

將同一產(chǎn)地（產(chǎn)地：浙江淳安）的山茱萸干燥粉末，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.2”項下色譜條件進樣測定峰面積，計算5種成分的含量。結果顯示，莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷、馬錢苷、山茱萸裂苷含量的RSD分別為1.73%、1.05%、1.21%、0.96%和1.33%（n=6），表明本試驗方法重復性良好。

2.4.5 準確度試驗

精密稱取0.25 g已知各成分含量的山茱萸干燥粉末6份，分別加入一定量的對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定峰面積，計算加樣回收率。結果表明，本試驗方法準確度良好，加樣回收率試驗結果見表2。

2.5 HPLC-QAMS法的建立

2.5.1 相對校正因子的測定

取“2.3.1”項下的混合對照品溶液，分別以不同的進樣量（1、6、10、14、18、20 μL）進樣測定。以山茱萸中的馬錢苷為內(nèi)參物，按照公式fkm=fk/fm=（Wk×Am）/（Wm×Ak）分別計算山茱萸中莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷的相對校正因子，結果見表3。

2.5.2 QAMS法的耐用性評價

（1）不同HPLC儀和色譜柱對校正因子的重現(xiàn)性考察。取“2.3.1”項下制備的混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進樣6次，每次15 μL，考察Agilent 1200 HPLC儀、Dionex P680 HPLC儀，以及不同色譜柱Kromasil C18、Ultimate XB C18、Diamonsil C18時的相對校正因子。結果顯示，不同色譜系統(tǒng)對相對校正因子的影響較小（RSD<2%，n=6），重現(xiàn)性良好，詳見表4。

（2）不同流速對相對校正因子的影響。精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下的色譜條件進樣，分別測定流速在0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min時的相對校正因子。結果，莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷相對校正因子的RSD依次為0.93%、1.75%、1.16%、1.83%（n=6），均<2%，表明流速對相對校正因子值影響較小。

（3）不同柱溫對相對校正因子的影響。精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液15 μL，按“2.2”項下的色譜條件進樣，分別測定柱溫在20、25、30、35、40、45℃時的相對校正因子。結果，莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷相對校正因子的RSD分別為1.18%、1.52%、0.93%、0.76%（n=6），均<2%，表明柱溫對相對校正因子影響較小。

（4）不同進樣量對相對校正因子的影響。精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液各15 μL，按“2.2”項下的色譜條件進樣，分別測定在2、5、10、15、20、25 μL進樣量時的相對校正因子。結果，莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷相對校正因子的RSD依次為1.18%、1.57%、1.16%、1.82%（n=6），均<2%，表明進樣量對相對校正因子值影響較小。

2.5.3 待測成分色譜峰的定位

精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液15 μL，在2種色譜儀（Agilent 1200和Dionex P680）中，分別采用3種不同填料色譜柱（Kromasil C18、Ultimate XB C18和Diamonsil C18），測定并計算莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷與內(nèi)參物馬錢苷間色譜峰的相對保留值和保留時間差。結果，各待測成分間的相對保留值波動較小，其RSD分別為1.81%、1.25%、1.69%、1.72%（n=6），所以采用相對保留值法用于山茱萸環(huán)烯醚萜苷類成分QAMS法的定位。不同儀器及不同色譜柱時4種成分的相對保留值比較結果見表5。

2.6 QAMS法與外標法測定結果的比較

按“2.3.2”項下方法，取19批不同產(chǎn)地的山茱萸干燥粉末制備成供試品溶液。精密吸取各批供試品溶液15 μL，注入色譜儀測定，通過QAMS法計算各成分含量。同時采用外標法對山茱萸中5種環(huán)烯醚萜苷類成分進行多成分同步含量測定，結果見表6。

表6結果表明，山茱萸藥材中莫諾苷、馬錢苷的含量相對較高，當藥苷和山茱萸苷的含量較低；同時不同產(chǎn)地山茱萸藥材中5種環(huán)烯醚萜苷類成分含量差異較大，莫諾苷的含量范圍約為9.797～18.093 mg/g、當藥苷為0.415～1.180 mg/g、山茱萸苷為0.318～0.561 mg/g、馬錢苷為6.627～11.036 mg/g、山茱萸裂苷為2.550～5.462 mg/g。將兩種測定方法所得數(shù)據(jù)結果經(jīng)SPSS 22.0軟件采用t檢驗及非參數(shù)檢驗分析。結果，莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷的QAMS法計算值與外標法實測值的P值分別為0.667、0.329、0.812、0.759，均>0.05，表明兩種方法測得的結果無顯著性差異，提示建立的相對校正因子具有較好的可信度，QAMS法計算結果可靠。

3 討論

3.1 內(nèi)參物的選擇

在2010年版[10]和2015年版《中國藥典》中，均將馬錢苷作為山茱萸質量評價的指標性成分，其對照品廉價較易獲得，并且測定條件和技術成熟。因此，本研究將馬錢苷選為內(nèi)參物，構建其與其他4種環(huán)烯醚萜苷類成分間的相對校正因子，用于計算其他成分的含量。

3.2 測定波長的選擇

在預試驗中，筆者對供試品溶液和混合對照品溶液在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描。結果，莫諾苷、當藥苷、山茱萸苷、馬錢苷和山茱萸裂苷的最大吸收波長分別為240、240、237、240、221 nm，山茱萸苷在240 nm波長處與237 nm波長處的峰面積差異較小，山茱萸裂苷在240 nm波長處也有較大紫外吸收。因此，本試驗采用240 nm為檢測波長。試驗結果表明，此波長下各待測峰分離度良好。

3.3 樣品處理方法

在前期試驗中，根據(jù)文獻資料[11-13]，筆者分別考察了以不同體積分數(shù)的甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯為提取溶劑，采用加熱回流法和超聲提取法制備供試品溶液的情況，最終確定了采用75%甲醇溶液超聲提取30 min的方法，且該方法操作簡單、目標成分的提取效率高、各待測峰峰面積較大、干擾的雜質峰較少。

3.4 耐用性評價

在對建立的相對校正因子進行適用性評價時，考察了在不同液相色譜儀、不同色譜柱、不同柱溫、不同流速和不同進樣量時的相對校正因子，結果其RSD均<2%，提示以上因素對相對校正因子沒有顯著影響，表明建立的相對校正因子具有較好的適用性；而后通過峰面積相對保留值和保留時間差這兩種方法對色譜峰的位置進行了確定，結果顯示相對保留值法更適用于山茱萸中環(huán)烯醚萜苷類成分的含量測定。最后檢驗QAMS法計算值與外標法實測值的差異，結果二者P值均>0.05，提示兩組數(shù)據(jù)間比較差異無統(tǒng)計學意義，表明在缺少對照品的情況下，可以利用QAMS法對山茱萸藥材中的多種環(huán)烯醚萜苷類成分進行定量測定。

3.5 結果分析

通過對19批藥材含量測定結果進行分析，表明山茱萸藥材中5種環(huán)烯醚萜苷類成分含量受地域影響較大，在評價山茱萸藥材質量時應考慮其產(chǎn)地因素。但在試驗過程中筆者也發(fā)現(xiàn)同一產(chǎn)地的不同批次山茱萸藥材中5種環(huán)烯醚萜苷類成分含量也存在一定差異，這可能與藥材的采收時間、農(nóng)戶種植水平等因素有關，具體原因還有待進一步的試驗考察。

綜上，本研究建立了同時測定山茱萸中5種環(huán)烯醚萜苷類成分含量的多指標評價的HPLC-QAMS法，實現(xiàn)了快速、全面、準確地評價山茱萸藥材質量的要求，且檢測成本低，為中藥中多組分的質量評價標準的建立提供了一定的參考。

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（收稿日期：2017-10-30 修回日期：2018-01-19）

（編輯：劉 萍）