尼氟酸結(jié)腸靶向小球的制備與體外釋藥評(píng)價(jià)

鄢雪梨 黃仁杰 肖健

摘 要 目的：制備尼氟酸結(jié)腸靶向小球，并進(jìn)行體外釋藥評(píng)價(jià)。方法：將尼氟酸包載于D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS1000 ）中形成納米膠束，考察尼氟酸納米膠束的包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位和多分散系數(shù)（PDI）。再采用銳孔-凝固法將納米膠束包裹于低酯果膠中形成尼氟酸結(jié)腸靶向小球，觀察尼氟酸結(jié)腸靶向小球的外觀形態(tài)，計(jì)算其粒徑和跨距。比較尼氟酸納米膠束和尼氟酸結(jié)腸靶向小球依次在人工胃液（2 h）、人工小腸液（3 h）和人工結(jié)腸液（3 h）中的釋藥情況。結(jié)果：尼氟酸納米膠束包封率為（93.42±2.33）%、載藥量為（8.54±0.36）%（n=3），粒徑為（25.8±0.6） nm、Zeta電位為（-18.73±0.23） mV（n=20），PDI為0.25。尼氟酸結(jié)腸靶向小球外形圓整，表面紋理粗糙，其粒徑為（1.33±0.14） mm（n=3），跨距為0.26。尼氟酸納米膠束在前5 h內(nèi)的累積釋放度已超過(guò)60%，而尼氟酸結(jié)腸靶向小球在前5 h內(nèi)的累積釋放度<30%，二者8 h內(nèi)的累積釋放度均>80%。結(jié)論：該制備方法簡(jiǎn)單可行，成功制得具有良好的結(jié)腸靶向性能的尼氟酸小球。

關(guān)鍵詞 尼氟酸；納米膠束；D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯；結(jié)腸靶向小球；制備；體外釋藥

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Niflumic acid colon-targeted delivery beads， and to evaluate in vitro drug release. METHODS： Niflumic acid-loaded nanomicelles were prepared with D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate （TPGS1000） as carrier material. Entrapment efficiency， drug-loading amount， particle size， Zeta potential and polydispersity coefficient （PDI） of Niflumic acid-loaded nanomicelles was investigated. The nanomicelles were encapsulated into pectin by using piercing-solidifying method to form Niflumic acid colon-targeted delivery beads. The morphology of Niflumic acid colon-targeted delivery beads was observed， and particle size and span was calculated. The drug release of Niflumic acid-loaded nanomicelles and Niflumic acid colon-targeted delivery beads in artificial gastric juice （2 h）， artificial intestinal fluid （3 h） and artificial colon fluid （3 h） were compared. RESULTS： The encapsulation efficiency of Niflumic acid-loaded nanomicelles was （93.42±2.33）%， drug-loading amount was （8.54±0.36）%； particle size was （25.8±0.6） nm （n=3）； Zeta potential was （-18.73±0.23） mV （n=20）； PDI was 0.25. Niflumic acid colon-targeted delivery beads were round in appearance and rough in texture； the particle size was （1.33±0.14） mm （n=3） and span was 0.26. Accumulative release rate of Niflumic acid-loaded nanomicelles was more than 60% within first 5 h. Accumulative release rate of Niflumic acid colon-targeted delivery beads was lower than 30% within first 5 h， and accumulative release rate were both higher than 80% in 8 h. CONCLUSIONS： The preparation method is simple and reliable. Niflumic acid colon-targeted delivery beads are prepared successfully.

KEYWORDS Niflumic acid； Nanomicelles； D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate； Colon-targeted delivery beads； Preparation； in vitro drug release

尼氟酸（Niflumic acid）又名尼氟滅酸，是一種非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，臨床上多用于風(fēng)濕性疼痛等軀體痛的治療，其常用劑型是片劑、膠囊劑、栓劑。近年研究發(fā)現(xiàn)，尼氟酸是超極化激活環(huán)核苷酸門控陽(yáng)離子通道2亞型（HCN2）的特異性阻滯藥，能選擇性作用于HCN2 S4電壓敏感區(qū)域的外區(qū)，從而改變起搏通道的門控作用[1]，而HCN2通道在軀體炎性疼痛與神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用[2-3]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，HCN2蛋白在腸易激綜合征（IBS）大鼠內(nèi)臟痛覺(jué)相關(guān)中樞上的表達(dá)顯著增強(qiáng)[4]，呈劑量依賴性抑制其內(nèi)臟痛覺(jué)敏化行為，可提高其內(nèi)臟痛閾[5]，顯著抑制IBS大鼠海馬突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)[6]。這些研究結(jié)果均一致表明HCN2可能參與IBS慢性內(nèi)臟痛覺(jué)敏化的形成，提示尼氟酸可能具有改善IBS內(nèi)臟痛的新作用。

尼氟酸經(jīng)口服給藥具有一定的胃腸道不良反應(yīng)及腎臟毒副作用。但口服結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)具有定位釋藥特點(diǎn)，可提高藥物的治療效果、減少其副反應(yīng)[7]。因此口服結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)可作為尼氟酸理想的藥物傳遞系統(tǒng)。有研究表明，減小粒徑可使藥物具有炎癥腸道細(xì)胞的上皮增強(qiáng)通透性和滯留效應(yīng)（eEPR）[8-9]，避免腹瀉外排[10]以及多孔性吸附[11]等作用，能有效提高藥物的結(jié)腸靶向性。因此，本課題組擬將尼氟酸包載于D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS1000 ）中形成納米膠束，并進(jìn)一步采用銳孔-凝固法將納米膠束包裹于低酯果膠中形成小球[12]，從而減少尼氟酸納米膠束在胃和小腸中的釋放量，提高制劑的結(jié)腸靶向性能。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津公司）； NovaNano-SEM230掃描電鏡和Tecnai G2 20ST透射電鏡（美國(guó)FEI公司）；Nicomp 380ZLS粒度檢測(cè)分析儀（美國(guó)PSS公司）；SCP85H 超速離心機(jī)（日本日立公司）；透析袋（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，截留分子量：8 000～14 000 Da）。

1.2 藥品與試劑

尼氟酸對(duì)照品（批號(hào)：140822，純度：>98%）、TPGS1000（批號(hào)：130610）、低酯果膠（批號(hào)：141021，酯化度：28%）、聚乙烯亞胺（PEI，批號(hào)：140715）、嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP，批號(hào)：160529）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF，批號(hào)：160311）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 尼氟酸結(jié)腸靶向小球的制備

2.1.1 尼氟酸納米膠束 按藥載質(zhì)量比為1 ∶ 10，分別精密稱取尼氟酸和TPGS1000，加入適量甲醇振蕩溶解，于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，形成均勻薄膜，加入50 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），37 ℃下超聲（240 W，40 kHz）振蕩水化至薄膜溶解，再依次用0.2、0.1 μm的聚碳酸酯膜過(guò)濾，各重復(fù)3次，凍干備用。

2.1.2 尼氟酸結(jié)腸靶向小球 在文獻(xiàn)[12]的基礎(chǔ)上，按納米膠束凍干粉與低酯果膠的質(zhì)量比為1 ∶ 10進(jìn)行投料，將低酯果膠分次撒入純化水中，溶解制成8%的溶液，再加入尼氟酸納米膠束凍干粉，攪拌混懸均勻，隨即用6號(hào)注射針頭將此混合液滴入至緩慢攪拌的10% 氯化鈣溶液中，固化30 min，過(guò)濾，于60 ℃烘干，再將小球浸泡在1.0%PEI溶液中，交聯(lián)6 h，過(guò)濾，純化水洗滌后于60 ℃烘干，即得。

2.2 尼氟酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L醋酸銨溶液-乙腈（40 ∶ 60，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：288 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL[13]。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取尼氟酸對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為1.25、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=2.335x+0.119（r=0.999 5）。結(jié)果表明，尼氟酸檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為1.25～50.0 μg/mL。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為10 μg/mL的尼氟酸對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次考察日內(nèi)精密度，每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定6 d考察日間精密度。結(jié)果顯示，峰面積的日內(nèi)RSD和日間RSD分別為1.3%和2.1%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.2.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一批次的尼氟酸結(jié)腸靶向小球適量，加入適量含有2%果膠酶的人工結(jié)腸液（pH為6）[12]超聲振蕩10 min，4 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，收集上清液，重復(fù)3次，合并上清液，用甲醇定容至50 mL，搖勻，再稀釋10倍制備成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，峰面積的RSD為1.5%（n=4），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批次的尼氟酸結(jié)腸靶向小球，按“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，尼氟酸結(jié)腸靶向小球中尼氟酸平均含量為8.23 mg/g，RSD=1.98%（n=6）。

2.2.6 回收率試驗(yàn) 精密量取空白小球研磨成細(xì)粉，分別精密稱取適量于量瓶中，按尼氟酸最終質(zhì)量濃度為8、10、12 μg/mL分別加入尼氟酸對(duì)照品，每個(gè)濃度水平3份，加入適量含有2%果膠酶的人工結(jié)腸液（pH為6）超聲振蕩10 min，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，平均加樣回收率為97.67%，RSD=2.53%（n=9），表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.2.7 含量測(cè)定 取3批尼氟酸結(jié)腸靶向小球，研磨成細(xì)粉，分別精密稱取0.8 g，各3份，加入適量含有2%果膠酶的人工結(jié)腸液（pH為6）超聲振蕩10 min，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，樣品中尼氟酸的含量為（8.37±0.24） mg/g（n=3）。

2.3 尼氟酸納米膠束的質(zhì)量控制

2.3.1 包封率 采用反透析法，精密稱取已知含量的尼氟酸納米膠束，置于50 mL PBS（pH為7.4）中，另將裝有2 mL PBS的透析袋兩端扎緊后置于其中進(jìn)行反透析，4 h后取袋內(nèi)的溶液0.5 mL，以甲醇稀釋定容至10 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按公式計(jì)算包封率（EE）[14]：EE（%）=（ctotal×50-cfree×52）/（ctotal×50）×100%，式中ctotal為尼氟酸納米膠束溶液中的尼氟酸的質(zhì)量濃度，cfree為游離尼氟酸的質(zhì)量濃度，50為透析袋外溶液的體積，52為透析袋內(nèi)外溶液的總體積。結(jié)果顯示，尼氟酸納米膠束的包封率為（93.42±2.33）%（n=3）。

2.3.2 載藥量 將“2.3.1”項(xiàng)下經(jīng)反透析后的膠束溶液進(jìn)行冷凍干燥，稱其質(zhì)量M，按公式計(jì)算載藥量（LC），LC（%）=（ctotal×50-cfree×52）/（M-cfree×50）×100%。結(jié)果顯示，尼氟酸納米膠束的載藥量為（8.54±0.36）%（n=3）。

2.3.3 粒徑和Zeta電位 取適量尼氟酸納米膠束，用純化水稀釋10倍，混勻，經(jīng)0.22 ?m的微孔濾膜過(guò)濾。使用粒度檢測(cè)分析儀測(cè)定膠束的粒徑和Zeta電位。每個(gè)樣品測(cè)定20個(gè)循環(huán)時(shí)間，測(cè)定溫度設(shè)定為25 ℃[15]。結(jié)果表明，尼氟酸納米膠束的粒徑較小且分布較窄，平均粒徑為（25.8±0.6） nm、Zeta電位為（-18.73±0.23） mV（n=20），多分散系數(shù)（PDI）為0.25，表明尼氟酸納米膠束的分散度良好。尼氟酸納米膠束的粒徑分布圖見(jiàn)圖1。

2.3.4 形態(tài) 取適量尼氟酸納米膠束，用純化水進(jìn)行稀釋，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，將鋪有碳膜的銅網(wǎng)漂放在納米膠束溶液上，1～2 min后取出銅網(wǎng)，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體。將銅網(wǎng)漂放在1%醋酸雙氧鈾染液上約1 min，取出，同樣用濾紙吸干多余液體。室溫放置過(guò)夜后，將晾干的銅網(wǎng)放入透射電鏡儀，在加速電壓160 kV下觀察納米膠束外部形態(tài)[15]。結(jié)果顯示，尼氟酸納米膠束均為球形，外觀圓整，粒徑均一，大約在20～30 nm 之間，粒徑大小與粒度檢測(cè)分析儀測(cè)得的結(jié)果一致。尼氟酸納米膠束的形態(tài)見(jiàn)圖2。

2.4 尼氟酸結(jié)腸靶向小球的粒徑與形態(tài)

隨機(jī)抽取100粒尼氟酸結(jié)腸靶向小球，分批置于載玻片上，用顯微鏡進(jìn)行觀察，通過(guò)Motic image plus 2.0圖像分析軟件逐一進(jìn)行粒徑測(cè)定（標(biāo)尺經(jīng)校正），用Excel 2003軟件計(jì)算平均值。經(jīng)對(duì)數(shù)正態(tài)分布擬合后，求D90、D50、D10，按公式計(jì)算跨距（SD）：SD=（D90-D10）/D50。結(jié)果顯示，尼氟酸結(jié)腸靶向小球的平均粒徑為（1.33±0.14） mm（n=3），跨距為0.26。

另將干燥的尼氟酸結(jié)腸靶向小球噴金粉后用導(dǎo)電膠黏在樣品臺(tái)上，用掃描電鏡觀察小球形態(tài)特征。結(jié)果顯示，尼氟酸結(jié)腸靶向小球外形圓整，表面紋理粗糙，已形成PEI疏水層。尼氟酸結(jié)腸靶向小球的電鏡掃描圖見(jiàn)圖3。

2.5 尼氟酸納米膠束的體外黏附性試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[16]方法，并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。稱取10 mg尼氟酸納米膠束，置于含0.1 mg/mL的ECP和TRF的PBS中，以100 r/min在37 ℃水浴中振蕩，分別于30、60、90、180 min取樣，10 000 r/min（離心半徑10 cm）離心30 min，取上清液適量，經(jīng)甲醇處理后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按公式計(jì)算黏附率（MBE）：MBE（%）=（c0-cs）/c0×100%，式中c0為初始尼氟酸的質(zhì)量濃度，cs為上清液中尼氟酸的質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示，尼氟酸納米膠束的黏附率隨時(shí)間呈逐漸上升趨勢(shì)，最高值達(dá)到94.5%，說(shuō)明該膠束與陽(yáng)離子蛋白之間有很好的黏附作用。尼氟酸納米膠束的黏附率曲線見(jiàn)圖4。

2.6 尼氟酸結(jié)腸靶向小球的溶脹-溶蝕性能

稱取100 mg尼氟酸結(jié)腸靶向小球，混懸于裝有人工胃液[pH為1.2，預(yù)熱至（37±0.2） ℃]的試管中，將試管置于（37±0.2） ℃恒溫水浴振蕩箱中100 r/min振蕩2 h；之后將介質(zhì)依次替換為人工小腸液（pH為6.8）、含2%果膠酶的人工結(jié)腸液（pH為6），分別振蕩3 h。每隔1 h從試管中取出所有尼氟酸結(jié)腸靶向小球，用濾紙吸去其表面多余的水分后稱質(zhì)量。按公式計(jì)算尼氟酸結(jié)腸靶向小球的溶蝕率（SER）[17]：SER（%）=（WT-WO）/WO×100%，式中WT為各取樣點(diǎn)尼氟酸結(jié)腸靶向小球的質(zhì)量；WO為初始干燥后尼氟酸結(jié)腸靶向小球的質(zhì)量。結(jié)果顯示，尼氟酸結(jié)腸靶向小球在人工胃液中吸水膨脹過(guò)程緩慢；在人工小腸液中3 h的溶脹達(dá)到最大程度，但小球的外觀仍保持完整，未出現(xiàn)明顯的溶蝕現(xiàn)象；而在含果膠酶的人工結(jié)腸液中，小球溶蝕率逐漸下降，出現(xiàn)溶蝕現(xiàn)象，提示尼氟酸納米膠束開始從小球中釋放出來(lái)。尼氟酸結(jié)腸靶向小球的溶脹-溶蝕曲線見(jiàn)圖5。

2.7 體外釋放研究

2.7.1 尼氟酸納米膠束 取已知含量的尼氟酸納米膠束20 mg與2 mL PBS（pH為7.4）混合，裝入預(yù)先處理好的透析袋中，并將透析袋置于人工胃液（pH為1.2）中，（37±0.2） ℃恒溫下振蕩（100 r/min）2 h；之后將介質(zhì)依次替換為人工小腸液（pH為6.8）振蕩3 h和含2%果膠酶的人工結(jié)腸液（pH為6）振蕩3 h[12，18]。定時(shí)取樣1 mL，并同時(shí)補(bǔ)充等溫等量的對(duì)應(yīng)介質(zhì)，取樣液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液經(jīng)甲醇處理后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算尼氟酸納米膠中尼氟酸的累積釋放度，并繪制釋藥曲線。結(jié)果顯示，尼氟酸納米膠束在前5 h內(nèi)（人工胃液和人工小腸液）累積釋放度已超過(guò)60%，說(shuō)明該納米膠束在未進(jìn)入結(jié)腸部位前已釋放大部分尼氟酸，結(jié)腸靶向性不顯著。

2.7.2 尼氟酸結(jié)腸靶向小球 稱取適量的尼氟酸結(jié)腸靶向小球按“2.7.1”項(xiàng)下方法依次置于人工胃液、人工小腸液、含2%果膠酶的人工結(jié)腸液中，同法處理，計(jì)算尼氟酸結(jié)腸靶向小球中尼氟酸的累積釋放度。結(jié)果顯示，尼氟酸結(jié)腸靶向小球在人工胃液和人工小腸液中釋藥緩慢，且累積釋放度低于30%，說(shuō)明尼氟酸納米膠束得到較好的保護(hù)，沒(méi)有釋放出大部分的尼氟酸；而在含果膠酶的人工結(jié)腸液中，小球溶脹之后釋藥加快，3 h后基本釋藥完全，累積釋放度大于80%，說(shuō)明小球包載尼氟酸納米膠束之后明顯提高了藥物的結(jié)腸靶向性。尼氟酸納米膠束和尼氟酸結(jié)腸靶向小球的體外釋放曲線見(jiàn)圖6。

3 討論

TPGS1000在水溶液中能自發(fā)聚集形成膠束，其具有的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)有利于形成較大的膠束疏水核空間，不僅能有效提高難溶性藥物的溶解度，而且對(duì)藥物有較高的包封率和載藥量。此外，結(jié)腸炎癥組織存在大量帶正電荷的嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白[17]，以帶有負(fù)電性的TPGS1000作為載體材料的膠束可通過(guò)靜電作用而黏附于結(jié)腸炎癥組織，可延長(zhǎng)藥物在病灶區(qū)的滯留時(shí)間。體外黏附性試驗(yàn)結(jié)果亦初步證實(shí)這一想法，進(jìn)一步的體內(nèi)黏附性實(shí)驗(yàn)將在后續(xù)試驗(yàn)中開展。

尼氟酸納米膠束在胃腸道中的大量水分和酶類物質(zhì)的作用下，可能發(fā)生納米膠束的結(jié)構(gòu)破壞或表面電荷改變等不穩(wěn)定現(xiàn)象。為此，課題組進(jìn)一步將尼氟酸納米膠束包裹在以低酯果膠為載體的小球中，在胃腸道中發(fā)揮保護(hù)作用，而結(jié)腸部位的果膠酶促進(jìn)小球降解釋放出納米膠束。

考慮到本試驗(yàn)中對(duì)制劑的包封率和載藥量起到關(guān)鍵作用的是納米膠束的制備過(guò)程，因此，本文僅針對(duì)尼氟酸納米膠束進(jìn)行這2個(gè)指標(biāo)的評(píng)價(jià)。此外，所設(shè)計(jì)的制劑中藥物釋放分為2個(gè)階段，在經(jīng)過(guò)胃腸道到達(dá)結(jié)腸部位后，首先以納米膠束的形式從結(jié)腸靶向小球中釋放，而后游離的尼氟酸再?gòu)募{米膠束釋放出來(lái)，試驗(yàn)結(jié)果表明符合預(yù)期。課題組將進(jìn)一步開展該制劑在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程與藥效學(xué)研究。

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（收稿日期：2018-01-15 修回日期：2018-06-07）

（編輯：鄒麗娟）