擬黑多刺蟻5-HT2A受體基因cDNA的克隆及表達(dá)

楊　森，譚　娥，奚耕思

(1陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710119；2咸陽(yáng)師范學(xué)院 體育學(xué)院,陜西 咸陽(yáng)712000)

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是一種單氨類的神經(jīng)遞質(zhì)，又名血清素，能調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的多種生理功能及行為[1]。在動(dòng)物及人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT參與調(diào)節(jié)睡眠、體溫、痛覺(jué)、情緒和學(xué)習(xí)記憶等過(guò)程。當(dāng)人體內(nèi)的5-HT功能失調(diào)時(shí)，會(huì)引發(fā)多種精神疾病，如焦慮癥、抑郁癥、自閉癥等[2-3]。5-HT對(duì)昆蟲的取食、晝夜節(jié)律、好斗、記憶、群居和散居等行為也具有調(diào)節(jié)作用[4]。

5-HT通過(guò)受體實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物和人類生理功能的調(diào)節(jié)作用。目前已從脊椎動(dòng)物體內(nèi)克隆得到14個(gè)5-HT受體亞型，分為7類，即5-HT1R～5-HT7R，除5-HT3R屬于配體門控離子通道受體外，其他的均屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCR)。目前，從昆蟲體內(nèi)克隆得到的5-HT受體基因主要屬于5-HT1、5-HT2、5-HT7受體基因。從黑腹果蠅體內(nèi)克隆得到的5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A、5-HT2B、5-HT7受體基因分別與哺乳類的5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A、5-HT2B、5-HT7受體基因同源[5]。哺乳動(dòng)物的5-HT2A受體屬于5-HT2受體家族成員之一，這個(gè)家族成員中除5-HT2A受體亞型外，還包括5-HT2B和 5-HT2C受體亞型，這3個(gè)受體亞型在分子結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑方面很相似[6]。人體的5-HT2A受體定位于13號(hào)染色體的q14～21區(qū),編碼471個(gè)氨基酸[7]，與大鼠的5-HT2A受體同源性為87%[6]。通常情況下，5-HT2A受體與Gq/11偶聯(lián)，從而激活磷脂酶C，使三磷酸肌醇含量增加，而細(xì)胞質(zhì)中三磷酸肌醇可以作為第二信使，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放[7]。哺乳類的5-HT2A受體較多分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前腦區(qū)，特別是皮質(zhì)區(qū)、尾狀核、伏核、嗅球及海馬[8-10]，其與平滑肌收縮、血小板聚集、激素調(diào)控、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、性行為控制、睡眠、運(yùn)動(dòng)行為、精神疾病發(fā)生密切相關(guān)[7]。

第一個(gè)5-HT2A受體是從大鼠的腦部克隆得到的[11]，迄今為止5-HT2A受體已經(jīng)從人類[12-13]、小鼠[14]、倉(cāng)鼠[15]、豬[12,16]和獼猴[12,16]體內(nèi)克隆得到。5-HT2A受體已在昆蟲黑腹果蠅(Drosophilamelanopgaster)、意大利蜜蜂(Apismellifera)、黃斑黑蟋蟀(Gryllusbimaculatus)體內(nèi)克隆得到[4]。研究發(fā)現(xiàn)，5-HT2A受體主要分布在昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、咽下腺、唾液腺、中腸，對(duì)于調(diào)控昆蟲的進(jìn)攻行為、表皮形成、晝夜節(jié)律及提高胞內(nèi)Ca2+濃度具有重要作用[4]。

擬黑多刺蟻(PolyrhachisvicinaRoger)屬于節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱膜翅目蟻科多刺蟻屬，是一類營(yíng)群居的雜食性社會(huì)昆蟲，廣泛分布于我國(guó)東南部。擬黑多刺蟻屬于完全變態(tài)性昆蟲，生命周期為卵、幼蟲、蛹、成蟲，其中成蟲分為雌蟻、雄蟻和工蟻3個(gè)品級(jí)，各品級(jí)有明確分工，雌蟻在群體中個(gè)體最大，負(fù)責(zé)生育后代，雄蟻主要作用是與雌蟻交配，工蟻主要負(fù)責(zé)覓食、飼養(yǎng)幼蟲、建造和清理蟻穴，在雌蟻短缺時(shí)可恢復(fù)生殖能力，替代雌蟻行使繁育后代的功能[17]。擬黑多刺蟻是一種優(yōu)良的食藥兩用螞蟻,是衛(wèi)生部目前唯一允許使用的無(wú)毒無(wú)害螞蟻，也是研究社會(huì)性昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化的優(yōu)良材料。但目前關(guān)于擬黑多刺蟻5-HT2A基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究以擬黑多刺蟻為材料，克隆了擬黑多刺蟻5-HT2A受體基因，并以其推測(cè)出的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)擬黑多刺蟻不同齡期幼蟲和不同品級(jí)成蟲的5-HT2A受體mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探索5-HT2A受體基因?qū)M黑多刺蟻發(fā)育調(diào)控的影響作用，為深入了解5-HT2A受體基因在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)擬黑多刺蟻生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材　料

1.1.1供試動(dòng)物擬黑多刺蟻購(gòu)于浙江瑞豐螞蟻工坊，3窩螞蟻，每窩300～500只，雌蟻體長(zhǎng)9～9.8 mm,雄蟻體長(zhǎng)6.5～8 mm,工蟻體長(zhǎng)6.5～7.5 mm，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)箱中，飼養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，相對(duì)濕度為60%～70%。每天飼喂螞蟻冰糖和蜂蜜，水放于紙盤中供螞蟻?zhàn)杂扇∈场?/p>

1.1.2主要試劑RNA提取試劑Trizol(TaKaRa)、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidFirst Strand cDNA SynthesisKit，MBI)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京百泰克)、SYBRPremix Ex TaqKit(TaKaRa)、2×PCR Mix(TaKaRa)、6×DNA loading buffer(TaKaRa)、DNA Marker(TIANGEN)、瓊脂粉(華大)、溴化乙錠(Sigma)。

1.2　方　法

1.2.1擬黑多刺蟻總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成取25只工蟻頭部于含有液氮的研缽中研磨，加入適量Trizol試劑提取總RNA。取2 μL RNA樣品、1 μL 6×DNA loading buffer電泳檢測(cè)總RNA的完整性。取2 μL RNA樣品稀釋25倍，在核酸蛋白分析儀上以260 nm處的吸光值確定RNA濃度，以O(shè)D260/OD280進(jìn)行純度檢測(cè)，純度較好的RNAOD260/OD280應(yīng)在1.7～2.0。經(jīng)完整性和純度檢測(cè)合格的RNA進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。cDNA第一鏈的合成使用MBI的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，產(chǎn)物可直接進(jìn)行PCR反應(yīng)或置于-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2全長(zhǎng)cDNA的克隆依據(jù)意大利蜜蜂(Apismellifera)、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)和黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)5-HT2A基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,引物序列見(jiàn)表1，均由金斯瑞公司合成。利用巢式PCR克隆擬黑多刺蟻5-HT2A基因。第一輪PCR反應(yīng)使用引物DF1和DR1，反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，10×ExPCR 緩沖液(含Mg2+)2 μL，RNase Free ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第二輪PCR反應(yīng)使用稀釋10倍的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，引物DF2和DR2，在與第一輪相同的PCR反應(yīng)條件下擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，再用Bioteke膠回收試劑盒純化回收目的基因片段，連接到pMD-18T質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，陽(yáng)性克隆菌落再進(jìn)行PCR鑒定后送上海生工公司測(cè)序。

根據(jù)擴(kuò)增獲得的中間片斷序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1),采用5′RACE和3′RACE試劑盒擴(kuò)增5′RACE和3′RACE 端。5′RACE PCR進(jìn)行兩輪，第一輪加2 μL反轉(zhuǎn)錄混合物，8 μL 1×cDNA 稀釋緩沖液Ⅱ，4 μL 10×LA PCR緩沖液Ⅱ(無(wú)Mg2+)，3 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.25 μL LATaq(5 U/μL),外圍特異性引物(10 μmol/L)(5R1)和5′RACE外圍引物(10 μmol/L)(5R outer)到總體積50 μL。外圍PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min，20個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。內(nèi)圍PCR以1 μL外圍 PCR混合物為模板,5 μL 10×LA PCR 緩沖液 Ⅱ(無(wú)Mg2+),5 μL MgCl2(25 mmol/L),8 μL dNTP混合物(2.5 mmol/L),0.5 μL Takara LATaq(5 U/μL),內(nèi)圍特異性引物(10 μmol/L)(5R2)和5′RACE內(nèi)圍引物(10 μmol/L)(5R inner)以及26.5 μL無(wú)菌水。內(nèi)圍PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性3 min；94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。3′RACE反應(yīng)的試劑和條件與5′RACE相似。PCR產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化回收。擴(kuò)增出的片段與質(zhì)粒載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，再進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3序列分析用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的分子量和等電點(diǎn)，Blast比較蛋白質(zhì)序列的同源性，PROSITE(http://prosite.expasy.org/)分析氨基酸序列的功能位點(diǎn)，NetNGlye分析糖基化位點(diǎn)，TMHMM分析跨膜域，Signal P 4.1分析信號(hào)肽。

1.2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹用Clustal X進(jìn)行核酸和氨基酸序列的多重比對(duì)，MEGA 6.0比鄰法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)行1 000次多重比對(duì)，計(jì)算聚集重復(fù)比率。

1.2.5Pv5-HT2A實(shí)時(shí)定量表達(dá)取卵、1～4齡幼蟲(L1～L4)、蛹、雌蟻、雄蟻、工蟻?zhàn)鳛闇y(cè)試樣本用于實(shí)時(shí)定量表達(dá)。用RNAiso試劑盒提取8～10只螞蟻總RNA，取1 μg RNA 樣品合成第一條cDNA。基因特異性引物擴(kuò)增的112 bp片段用于基因表達(dá)的研究，內(nèi)參基因合成250 bp片段。SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在Biorad上進(jìn)行，反應(yīng)體系(25 μL)：12.5 μL SYBR Premix ExTaqⅡ,1 μL PCR上游引物(10 μmol/L)，1 μL PCR下游引物(10 μmol/L)，1 μL DNA模板和9.5 μL無(wú)菌水；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后，觀察熒光值變化曲線和熔解曲線，熔解曲線(65～90 ℃，每15 s升高0.5 ℃)保證只有一種PCR產(chǎn)物被擴(kuò)增和檢測(cè)。

表1　試驗(yàn)所用引物序列Table 1　Primers used in this study

2　結(jié)果與分析

2.1　Pv5-HT2A受體cDNA克隆及序列分析

利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出長(zhǎng)443 bp的片段，再根據(jù)該片段設(shè)計(jì)5′RACE 和3′RACE 的特異性外圍和內(nèi)圍引物，分別擴(kuò)增出1 344 bp的5′RACE端和1 517 bp的3′RACE 端，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明成功獲得Pv5-HT2A受體的中間片段、5′RACE片段及3′RACE片段序列(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker;1.中間序列；2.5′RACE產(chǎn)物；3.3′RACE 產(chǎn)物M.DL2000 DNA Marker;1.Intermediate sequence;2.5′RACE product;3.3′RACE product圖1　擬黑多刺蟻5-HT2A 基因全長(zhǎng)cDNA序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR amplification of full-length cDNA sequence of P.vicina

Pv5-HT2A受體cDNA (NCBI GenBank登錄號(hào):KJ666537.2)全長(zhǎng)2 965 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1 926 bp，編碼641個(gè)氨基酸，5′和3′非編碼區(qū)(UTR)分別包含593和446個(gè)核苷酸。Pv5-HT2A氨基酸序列的分子量為69.68 ku，等電點(diǎn)為9.60。Pv5-HT2A氨基酸序列有8個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、5個(gè)蛋白激酶A磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)酰基化位點(diǎn)(圖2)。

預(yù)測(cè)的Pv5-HT2A受體氨基酸序列在圖中以單個(gè)密碼子表示。起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)用黑色背景顯示。星號(hào)(*)代表終止密碼子， N-糖基化位點(diǎn)用下劃線表示，蛋白激酶A磷酸化位點(diǎn)用下弧線表示，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)用上弧線表示，?；稽c(diǎn)用雙下劃線表示?？缒そY(jié)構(gòu)域Ⅰ-Ⅶ用灰色背景和黑色邊框顯示The deduced amino acid sequence of the Pv5-HT2A receptor is shown in a single letter under the respective codon.The initiation condon (ATG) and termination codon (TAA) are highlighted in black.The asterisk represents the terminator codon,potential N-glycosylation sites are highlighted in single underline,putative protein kinase A phosphorylation sites are highlighted in downward arc underline,putative protein kianse C phosphorylation sites are highlighted in double upward arc underline,putative palmitoylation sites are highlighted indouble underline.The transmembrane domains Ⅰ-Ⅶ determined are shaded and boxed in black圖2　擬黑多刺蟻5-HT2A受體的核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.2　Nucleotide and deduced amino acid sequence of full-length 5-HT2A receptor of P.vicina

2.2　Pv5-HT2A受體的系統(tǒng)進(jìn)化樹

由NCBI網(wǎng)站獲取5-HT2A氨基酸序列，用Clustal X進(jìn)行多重比對(duì)，Pv5-HT2A與其他物種5-HT2A受體蛋白的進(jìn)化關(guān)系如圖3所示。由圖3可以看出，5-HT2A氨基酸序列分為脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物兩個(gè)組， 擬黑多刺蟻Pv5-HT2A受體蛋白與紅收獲蟻的親緣關(guān)系最近，相似度為69%，與阿根廷蟻的親緣關(guān)系次之，相似度為58%，與意大利蜜蜂的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相似度為48%。

圖3　擬黑多刺蟻受體與其他物種5-HT2A受體蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3　Phylogenetic analysis of 5-HT2A receptors of P.vicina and other animals

2.3　Pv5-HT2A受體mRNA的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Pv5-HT2A mRNA在擬黑多刺蟻不同發(fā)育階段和不同品級(jí)成蟲中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，Pv5-HT2A mRNA在擬黑多刺蟻不同發(fā)育階段和不同品級(jí)成蟲中均有表達(dá)，其中卵、3齡幼蟲及蛹期的表達(dá)量較高，1，2，4齡幼蟲的表達(dá)量相對(duì)較低；成蟲中,雄蟻表達(dá)量最高，工蟻次之，雌蟻的表達(dá)量最低，且工蟻的表達(dá)量顯著高于雌蟻。

*表示P<0.1時(shí)差異顯著，**表示P<0.05時(shí)差異顯著，***表示P<0.01時(shí)差異顯著* means significant at P<0.1,** means significant at P<0.05,*** means significant at P<0.01圖4　擬黑多刺蟻5-HT2A受體基因mRNA在擬黑多刺蟻不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.4　Relative expressions of 5-HT2A receptor mRNA in different developmental stages in whole body of P.vicina

3　討　論

本研究成功克隆了擬黑多刺蟻Pv5-HT2A受體的cDNA序列，其全長(zhǎng)為2 965 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)大小為1 926 bp，編碼641個(gè)氨基酸，5′和3′非編碼區(qū)(UTR) 分別包含593和446個(gè)核苷酸。通過(guò)對(duì)Pv5-HT2A氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，它具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體類型[13]。Pv5-HT2A受體的典型特征是具有糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)及?；稽c(diǎn)[6]，這些特征實(shí)際是氨基酸序列翻譯后的修飾，以提高受體的穩(wěn)定性，便于與細(xì)胞膜結(jié)合[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Pv5-HT2A氨基酸序列有8個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、5個(gè)蛋白激酶A磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)?；稽c(diǎn)。

將不同動(dòng)物的5-HT2A氨基酸序列與擬黑多刺蟻Pv5-HT2A受體進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)擬黑多刺蟻Pv5-HT2A與其他物種5-HT2A受體具有高度的同源性，從而進(jìn)一步證實(shí)所克隆基因?qū)儆跀M黑多刺蟻Pv5-HT2A受體基因,同時(shí)也證實(shí)了5-HT2A受體基因保守性的特點(diǎn)[13]。擬黑多刺蟻5-HT2A受體蛋白與紅收獲蟻的親緣關(guān)系最近，相似度為69%。

熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，Pv5-HT2A受體mRNA在擬黑多刺蟻不同發(fā)育階段和不同品級(jí)成蟲中均有表達(dá)，且表達(dá)量有顯著差異性。說(shuō)明5-HT2A對(duì)擬黑多刺蟻的發(fā)育存在調(diào)控的階段特異性，與Markus等[19]的研究結(jié)果相吻合。Markus等[19]發(fā)現(xiàn)，5-HT2A受體在意大利蜜蜂不同發(fā)育階段的腦部均有表達(dá)，且不同階段的表達(dá)量不均勻，這與腦部5-HT2A含量對(duì)其不同發(fā)育階段產(chǎn)生的影響有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Pv5-HT2A受體mRNA在擬黑多刺蟻的卵、3齡幼蟲、蛹期的表達(dá)量較高；成蟲中，雄蟻的表達(dá)量最高，工蟻次之。有研究表明，5-HT2A受體在黑腹果蠅的胚胎發(fā)育期有表達(dá)[20],其表達(dá)對(duì)于維持胚胎正常發(fā)育和存活率很有必要[21],黑腹果蠅Dm5-HT2A受體可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育中胚帶延長(zhǎng)和角質(zhì)層形成[22-23]，由此推測(cè)擬黑多刺蟻在胚胎期及蛹期的高表達(dá)可能與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育及蛹期的角質(zhì)層增厚有關(guān)。5-HT可以促進(jìn)蜜蜂尋找食物及提高運(yùn)動(dòng)能力[24]， 5-HT2還與雄性果蠅的攻擊行為有關(guān)[25-26]，由此推測(cè)擬黑多刺蟻雄蟻中5-HT2A受體mRNA的高表達(dá)可能與其運(yùn)動(dòng)能力和攻擊行為有關(guān)，具體有待進(jìn)一步研究。

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