‘云香’水仙NAC基因克隆及表達(dá)分析

李夢(mèng)思 趙瀟俐 吳用 李歡 李科 陳曉靜

摘 要 從‘云香水仙轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出1條NAC基因序列，采用PCR技術(shù)克隆得到其cDNA序列。序列分析表明，該NAC基因包含822 bp的開放閱讀框，編碼273個(gè)氨基酸，分子量30 903.9 u，命名為NtNAC3153（GenBank登錄號(hào)：KU375569）。理化性質(zhì)分析和多重序列比對(duì)顯示，NtNAC3153蛋白是一個(gè)無跨膜區(qū)域的親水性蛋白，在N端具有一段保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，NtNAC3153與同為單子葉植物的小果野芭蕉MaNAC、二穗短柄草BdNAC和小米SiNAC親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，NtNAC3153基因能夠被ABA、鹽脅迫和高溫誘導(dǎo)表達(dá)。研究表明：NtNAC3153可能參與‘云香水仙的抗逆調(diào)控機(jī)制。

關(guān)鍵詞 ‘云香水仙；NAC轉(zhuǎn)錄因子；基因克?。恍蛄蟹治?；非生物脅迫

中圖分類號(hào)：S682.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract A sequence of one NAC gene from‘Yunxiangtranscriptome library was cloned using PCR technology. Sequence analysis indicates that the cDNA of NAC， named NtNAC3153（GenBank accession number： KU375569）， contained an open reading frame of length 822 bp（encoding 273 amino acids， molecular weight： 30.903 9 ku）. Physiochemical properties analysis and multiple sequence alignment showed that NtNAC3153 protein was a hydrophilic protein which was free of trans-membrane region and had a conserved N-terminal domain. Phylogenetic analysis indicated that the NtNAC3153 had the closest relationship with Musa acuminata MaNAC， Brachypodium distachyon BdNAC and Setaria italica SiNAC. Real-time PCR analysis showed that the expression of NtNAC3153 gene could be induced by ABA， salt stress and high temperatures. NtNAC3153 may be involved in the regulation of resistance mechanisms of‘Yunxiang.

Key words ‘Yunxiang； NAC transcription factor； cloning； sequence analysis； abiotic stress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.020

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[1]，在陸生植物中分布廣泛。NAC家族的命名起源于矮牽牛（Petunia hybrida）NAM、擬南芥（Arabidoposis thaliana）ATAF1、ATAF2和CUC2基因[2-3]。目前，已在擬南芥、水稻、大麥、小麥、玉米和大豆等多種植物中分離得到NAC家族基因[4-8]。NAC轉(zhuǎn)錄因子主要在高等植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用，參與調(diào)控相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[9-10]。近年來，大量關(guān)于NAC基因參與脅迫應(yīng)答的研究相繼被報(bào)道[11-14]，Yu Xingwang等[11]將鷹嘴豆CarNAC4基因轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CarNAC4轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)了擬南芥的抗旱性和抗鹽性；Liu Guanze等[12]將水稻SNAC1基因轉(zhuǎn)入棉花中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)水稻SNAC1基因能夠增加根系生長和降低蒸騰速率，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因棉花的抗旱性和抗鹽性；Xu Zhongyang等[14]將小麥TaNAC29基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)TaNAC29通過增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)和參與調(diào)控非生物脅迫相關(guān)信號(hào)途徑來減少H2O2的積累和對(duì)細(xì)胞膜的傷害，從而增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽性。由此可見，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)中起著十分重要的作用，但目前為止，對(duì)其分子機(jī)制的研究報(bào)道主要集中在模式植物和糧食作物上，因此進(jìn)一步開展NAC轉(zhuǎn)錄因子在園藝作物中的研究具有非常重要的意義。

‘云香水仙（Narcissus tazetta var. chinesis‘Yunxiang）是福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物遺傳育種研究所培育出的一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的水仙新品種[15]，與傳統(tǒng)中國水仙相比，植株大而健壯，鱗球較大且緊實(shí)，花期長，花香濃郁，抗病性強(qiáng)，在市場競爭中具有很大的優(yōu)勢(shì)。本研究從‘云香水仙不同開花時(shí)期花瓣轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出一個(gè)差異表達(dá)的NAC基因，在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，初步推測(cè)其可能與抗性相關(guān)，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析和抗性表達(dá)分析，研究該基因與‘云香水仙抗逆機(jī)制的關(guān)系，為該基因功能的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，為水仙抗性新品種的培育提供分子輔助育種資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)使用的‘云香水仙為大小一致，無病蟲害的一年生子球，由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物遺傳育種研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 使用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒（百泰克公司）提取‘云香水仙的總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA條帶的清晰度、完整性，將質(zhì)量完好的RNA置于

-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用Fermenta Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA用于克隆目的基因；用TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA用于熒光定量分析。具體步驟，見試劑盒說明書。

1.2.2 云香水仙NAC基因的克隆 用DNAMAN對(duì)基因序列進(jìn)行分析，根據(jù)其ORF兩端序列設(shè)計(jì)出1對(duì)特異性引物。以‘云香水仙的cDNA為模版，以NAC3153-F和NAC3153-R（表1）分別為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆NtNAC3153基因ORF。反應(yīng)采用25 μL體系：Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，Ex Taq酶0.2 μL，ddH2O 18.3 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，48.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。4 ℃恒溫保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后回收目的片段DNA，連接至pMD18-T載體（TaKaRa）后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定后送陽性克隆菌液至博尚測(cè)序。

1.2.3 NAC3153基因生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN軟件對(duì)基因ORF及編碼氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)；用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam）對(duì)氨基酸理化性質(zhì)進(jìn)行分析；使用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)氨基酸序列進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè)；利用SOPMA分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過Swiss-model（http：//swissmodel，expasy.org/）在線預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。用NCBI中的Blastp程序來檢索NtNAC3153的同源蛋白，用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)，在MEGA5.05中用鄰近相法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4 ‘云香水仙NAC3153基因的脅迫表達(dá)分析

將‘云香水仙子球消毒處理后水培，待長出新葉達(dá)到3～4 cm后，用100 μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl分別浸泡鱗球1、3、6、12、24和48 h，將水培的鱗球置于50 ℃高溫，處理同樣的時(shí)間，用清水處理的水培水仙作為對(duì)照。提取清水處理的和ABA、NaCl與高溫處理1、3、6、12、24和48 h后的‘云香水仙葉片RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模版，將其稀釋10倍后作為初始模板，以中國水仙actin（genebank accession： JN204912.1）為內(nèi)參基因，NAC3153-Q-F和NAC3153-Q-R為上下游引物檢測(cè)NtNAC3153基因的表達(dá)水平（表1）。qRT-PCR使用25 μL體系：SYBR Premix ExTaqTM（2×）12.5 μL，cDNA 2 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。每種處理做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，qPCR時(shí)重復(fù)3次。qRT- PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?.94 ℃ 3 min；2.94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線。采用2-△△Ct法進(jìn)行目的基因的相對(duì)表達(dá)量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘云香水仙NAC基因cDNA克隆

以‘云香水仙RNA 反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到1條1 000 bp左右的條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果得到1條為984 bp的cDNA片段，命名為NtNAC3153。結(jié)合NCBI上Blast比對(duì)，用DNAMAN進(jìn)行序列分析表明，NtNAC3153包含長度為822 bp的ORF，編碼蛋白由273個(gè)氨基酸組成（圖2）。

2.2 ‘云香水仙NAC基因的生物信息學(xué)分析

理化性質(zhì)分析表明，NtNAC3153編碼蛋白的分子式為C1 363H20 91N373O414S18，分子量為30 903.9 u，等電點(diǎn)為6.09，屬于穩(wěn)定蛋白；NtNAC3153蛋白是親水性蛋白，其親水性氨基酸多于疏水性氨基酸；NtNAC3153蛋白沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，可能不是膜蛋白。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NtNAC3153編碼蛋白的氨基酸序列中有59處α-螺旋（Alpha helix），占二級(jí)結(jié)構(gòu)的21.53%；55處延伸鏈（Extended strand），占二級(jí)結(jié)構(gòu)的20.07%；25處β-轉(zhuǎn)角（Beta turn），占二級(jí)結(jié)構(gòu)的9.12%；135處無規(guī)卷曲（Random coil），占二級(jí)結(jié)構(gòu)的49.27%（圖3-A）。無規(guī)則卷曲所占比例最高，推測(cè)其作用主要為連接其他二級(jí)結(jié)構(gòu)原件。

用Swiss-model分析NtNAC3153蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3-B），結(jié)果顯示，NtNAC3153蛋白與水稻抗性相關(guān)NAC1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性為51.88%。

將NtNAC3153蛋白的氨基酸序列與其他9個(gè)物種的NAC蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，這9個(gè)NAC蛋白分別為：大豆GmNAC（Glycine max，XP_003554001.1）、葡萄VvNAC（Vitis vinifera，XP_

002277068.1V）、木本棉GaNAC（Gossypium arboreum，KHG13515.1）、朝鮮薊CcNAC（Cynara cardunculus var. scolymus， KVI00075.1）、無油樟AtNAC（Amborella trichopoda，XP_006827310.1）、小果野芭蕉MaNAC（Musa acuminata subsp. malaccensis，XP_009420240.1）、荷花NnNAC（Nelumbo nucifera，XP_010276452.1）、油棕EgNAC（Elaeis guineensis，XP_010938118.1）和綠豆VrNA（Vigna radiata var. radiata，XP_014491001.1）。經(jīng)DNAMAN比對(duì)，結(jié)果顯示（圖4），所有10個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子都在N端有一段保守的氨基酸序列，包括約150個(gè)氨基酸，含有A、B、C、D、E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，與前人研究結(jié)果相一致，由此斷定NtNAC3153為NAC蛋白。

2.3 NtNAC3153蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了研究NtNAC3153蛋白的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA5.05軟件將NtNAC3153和與其同源的其他植物NAC轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。結(jié)果表明，NtNAC3153與同為單子葉植物的小果野芭蕉MaNAC（芭蕉科）、二穗短柄草BdNAC（禾本科）和小米SiNAC（禾本科）親緣關(guān)系最近。

2.4 NtNAC3153基因的脅迫表達(dá)分析

熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ABA、鹽脅迫和高溫，均可明顯誘導(dǎo)NtNAC3153基因的表達(dá)。其中，ABA處理后，NtNAC3153基因的表達(dá)明顯上升，在24 h達(dá)到最大值，而后下降；250 mmol/L NaCl處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)了NtNAC3153基因的表達(dá)，但卻出現(xiàn)3 h和24 h兩個(gè)峰值，呈現(xiàn)出先上升，后下降，再上升，而后又下降的趨勢(shì)；高溫處理后，NtNAC3153基因的表達(dá)迅速上升，在3 h即達(dá)到最高水平，而后逐漸下降（圖6）。

將3種處理后達(dá)到最高峰值的時(shí)間進(jìn)行比較，NaCl處理和高溫處理后，NtNAC3153基因的表達(dá)迅速上升，在3 h即達(dá)到最高峰值，而ABA處理后，NtNAC3153基因的表達(dá)是逐漸上升，在24 h才達(dá)到最高峰。

由此可見，ABA、鹽脅迫和高溫誘導(dǎo)了NtNAC3153基因的表達(dá)，而且隨處理時(shí)間的延長，趨勢(shì)明顯。由此推斷，NtNAC3153基因可能參與了‘云香水仙的抗逆調(diào)控機(jī)制。

3 討論

本研究克隆得到了‘云香水仙NtNAC3153基因，其編碼蛋白在N端有一段保守的氨基酸序列，與其他物種NAC轉(zhuǎn)錄因子相同，而C端結(jié)構(gòu)則與其他物種差異很大，高度變異，與前人研究結(jié)果一致[16]。已有研究報(bào)道表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子的N端保守氨基酸序列可以被分為A、B、C、D 和E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域[17]，可能參與調(diào)控DNA與其他蛋白的結(jié)合[18]，而C端是高度變異的，這與不同類型NAC轉(zhuǎn)錄因子的不同功能相關(guān)。

植物NAC家族成員在響應(yīng)非生物脅迫的進(jìn)程中起重要作用，研究NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物脅迫反應(yīng)的機(jī)制具有重要的意義。目前，多種植物的NAC基因已經(jīng)被克隆出來，不同植物NAC基因在逆境脅迫下的表達(dá)模式存在差異。小麥中，TaNAC29參與了NaCl、PEG和ABA脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[14]。胡楊PeNAC1基因能被干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而ABA脅迫處理下相應(yīng)較弱，超表達(dá)PeNAC1基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽能力[19]。甘菊中DlNAC1基因可以被低溫、高鹽和干旱脅迫分別誘導(dǎo)，對(duì)ABA和高溫脅迫不敏感[20]。過表達(dá)水稻SNAC1基因，增加了棉花的抗旱性和抗鹽性[12]。本研究中，‘云香水仙NtNAC3153基因，能夠被ABA、NaCl和高溫3種非生物處理分別誘導(dǎo)表達(dá)，且趨勢(shì)明顯。在ABA、NaCl和高溫處理下，NtNAC3153基因的表達(dá)量都是先上升，后下降，在最高處，表達(dá)量分別為對(duì)照的18倍、24倍和16倍，與小麥TaNAC29基因[14]在ABA處理下和NaCl處理下的表達(dá)情況相似。不同的是，在NaCl處理下，NtNAC3153基因的表達(dá)在3 h即達(dá)到最高峰，而小麥TaNAC29基因在NaCl處理下表達(dá)則在12 h才達(dá)到最高峰。高溫處理時(shí)，NtNAC3153基因的表達(dá)也是在3 h即達(dá)到高峰。由此，可以推測(cè)，NtNAC3153基因是‘云香水仙逆境脅迫應(yīng)答基因，并且在非生物脅迫處理下有特異的表達(dá)模式，但其在參與逆境脅迫中的作用尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

轉(zhuǎn)錄因子可能同時(shí)參與多個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控，因而僅通過調(diào)控1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，就可能調(diào)控多個(gè)相關(guān)功能的基因發(fā)揮作用，達(dá)到改良植物性狀的目的[16]。目前，筆者通過對(duì)‘云香水仙NAC轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行了克隆，研究分析了其在幾種脅迫下的表達(dá)情況，初步了解了其在‘云香水仙遭受脅迫后的應(yīng)答，對(duì)其調(diào)控抗性表達(dá)提供了直接依據(jù)，為進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證打下了基礎(chǔ)，為日后培育水仙抗性新品種提供了基因資源。

參考文獻(xiàn)

[1] Olsen A N， Ernst H A， Leggio L L， et al. NAC transcription factors： structurally distinct， functionally diverse[J]. Trends in Plant Science， 2005， 10（2）： 79-87.

[2] Erik S， Adele van H， Daisy K， et al. The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries[J]. Cell， 1996， 85： 159-170.

[3] Mitsuhiro A， Tetsuya I， Hidehiro F， et al. Genes involved in organ separation in Arabidopsis： an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. The Plant Cell， 1997， 9： 841-857.

[4] Collinge M， Boller T. Differential induction of two potato genes， Stprx2 and StNAC， in response to infection by Phytophthora infestans and to wounding[J]. Plant Mol Biol， 2001， 46（5）： 521-529.

[5] Eliasson A， Gass N， Mundel C， et al. Molecular and expression analysis of a LIM protein gene family from flowering plants[J]. Molecular and General Genetics MGG， 2000， 264（3）： 257-267.

[6] John I， Hackett R， Cooper W， et al. Cloning and characterization of tomato leaf senescence-related cDNAs[J]. Plant Mol Biol， 1997， 33（4）： 641-651.

[7] Xie Q， Sanz-Burgos A P， Guo H， et al. GRAB proteins， novel members of the NAC domain family， isolated by their interaction with a geminivirus protein[J]. Plant Mol Biol， 1999， 39（4）： 647-656.

[8] Ruiz-Medrano R， Xoconostle-Cazares B， Lucas W J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA： implications for supracellular regulation in plants[J]. Development， 1999， 126（20）： 4 405-4 419.

[9] Singh K B， Foley R C， O Ate-Sánchez L. Transcription factors in plant defense and stress responses[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2002， 5（5）： 430-436.

[10] Jeong J S， Park Y T， Jung H， et al. Rice NAC proteins act as homodimers and heterodimers[J]. Plant Biotechnology Reports， 2009， 3（2）： 127-134.

[11] Yu Xingwang， Liu Yanmin， Wang Shuang， et al. CarNAC4， a NAC-type chickpea transcription factor conferring enhanced drought and salt stress tolerances in Arabidopsis[J]. Plant Cell Reports， 2016， 35（3）： 613-627.

[12] Liu Guanze， Li Xuelin， Jin Shuangxia， et al. Overexpression of rice NAC gene SNAC1 improves drought and salt tolerance by enhancing root development and reducing transpiration rate in transgenic cotton[J]. Plant Growth Regul， 2015， 76： 211-223.

[13] An Xia， Liao Yiwen， Zhang Jingyu， et al. Overexpression of rice NAC gene SNAC1 in ramie improves drought and salt tolerance[J]. Plant Growth Regulation， 2015， 76（2）： 211-223.

[14] Xu Zhongyang， Gongbuzhaxi， Wang Changyou， et al. Wheat NAC transcription factor TaNAC29 is involved in response to salt stress[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2015， 96： 356-363.

[15] 陳曉靜， 申艷紅， 呂柳新， 等. ‘云香 水仙新品種選育[Z]. 中國觀賞園藝研究進(jìn)展， 2013： 216-219.

[16] 魏艷玲， 黃先忠. 無苞芥NAC轉(zhuǎn)錄因子基因OpNAC026的克隆與分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2015， 35（1）： 37-43.

[17] Hisako O， Kouji S， Koji D， et al. Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana[J]. DNA Research， 2003（10）： 239-247.

[18] Ernst H A， Olsen A N， Larsen S， et al. Structure of the conserved domain of ANAC， a member of the NAC family of transcription factors[J]. EMBO Rep， 2004， 5（3）： 297-303.

[19] Wang Junying， Wang Junping， et al. A Populus euphratica NAC protein regulating Na+/K+ homeostasis improves salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Gene， 2013， 521（2）： 265-273.

[20] Yang Yanfang， Zhu Kai， Wu Jian， et al. Identification and characterization of a novel NAC-like gene in chrysanthemum （Dendranthema lavandulifolium）[J]. Plant Cell Rep， 2016， 35（8）： 1 783-1 798.