葡萄查耳酮合酶基因克隆及其進(jìn)化分析

蔡建平　侯和勝

摘 要： 利用RT-PCR 技術(shù)從葡萄中克隆到兩個(gè)查耳酮合酶（CHS）的cDNA 開放閱讀框（ORF）序列，分別命名為VvCHS1 和VvCHS3。其中，VvCHS1 序列長(zhǎng)1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸；VvCHS3 序列長(zhǎng)1 170 bp，編碼389個(gè)氨基酸。對(duì)兩個(gè)CHS 基因編碼的氨基酸序列的分析表明，二者均具有CHS基因家族的保守結(jié)構(gòu)域。多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明，兩個(gè)CHS基因與其他高等植物CHS基因具有較高的相似性，然而VvCHS1和VvCHS3在結(jié)構(gòu)和功能上出現(xiàn)歧化。

關(guān)鍵詞：葡萄遺傳；查耳酮合酶；基因克??；進(jìn)化分析

中圖分類號(hào)：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.01.002

查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHS）是將苯丙烷類代謝途徑引向類黃酮合成的第1個(gè)關(guān)鍵酶，它催化3分子的丙二酰輔酶A （Malonyl CoA） 與1分子的香豆酰CoA（Coumaryl CoA）生成4，5，7-三羥基黃烷酮（Narigenin chalcone）。類黃酮類物質(zhì)是廣泛存在于高等植物中的次生代謝物，包括黃酮、異黃酮、黃烷酮、查耳酮、花色素苷、原花色素[1-4]。研究表明，類黃酮作為植物體內(nèi)一種重要的保護(hù)性物質(zhì)，在植物中具有重要的生理功能，包括抵御病原菌侵害、參與豆科植物根瘤菌形成、吸引昆蟲和動(dòng)物、促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)、防止紫外線傷害、促進(jìn)色素形成，等等。在應(yīng)用方面，類黃酮類物質(zhì)具有軟化血管、抗癌、清除體內(nèi)自由基等生理功能，已經(jīng)成為植物次生代謝物應(yīng)用研究的熱點(diǎn)[5-10]。CHS基因是一個(gè)較大的基因家族，屬于聚酮化合物合酶（PKS）超家族的一個(gè)分支。為探討CHS在葡萄次生代謝中的調(diào)節(jié)和代謝途徑轉(zhuǎn)換作用，本研究采用RT-PCR 的方法，克隆得到葡萄CHS基因開放閱讀框，并對(duì)其系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)行分析，為加深理解葡萄CHS基因功能奠定基礎(chǔ)并提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

葡萄材料為本實(shí)驗(yàn)室種植的栽培種葡萄（Vitis vinifera）；E.coli DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存原菌；克隆載體為pMD19-T simple vector、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自上海Invitrogen公司； 試驗(yàn)中所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)其他物種中已報(bào)道的查耳酮合酶基因序列及葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，進(jìn)行BLAST比較，獲得2個(gè)VvCHS基因完整開放閱讀框序列，分別命名為VvCHS1和VvCHS3。利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：VvCHS1-F 5' TAGAAGCCAGTAAAGCAGG3'；VvCHS1-R5' TCACCCAAGAATGACTACG3'；VvCHS3-F 5' TACCACAAGCCTCATCCC 3'；VvCHS3-R 5' GCAATCTATTACACCATACCCT 3' ，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 葡萄CHS基因cDNA全長(zhǎng)的獲得

葡萄葉片總RNA的提取采用改良的SDS方法進(jìn)行操作，獲得的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用引物對(duì)VvCHS1、VvCHS3進(jìn)行擴(kuò)增。VvCHS1擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。VvCHS3擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。按試劑盒上的操作指導(dǎo)回收凝膠電泳后與預(yù)期目的片段大小一致的泳帶，經(jīng)電泳檢測(cè)后連接克隆載體（pMD19-T simple vector）并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（E.coli DH5α），通過(guò)藍(lán)白斑篩選及菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用ClustalX進(jìn)行同源序列比對(duì)，輸出結(jié)果使用Mega4.0 軟件進(jìn)行Neighbor-joining法Bootstrap進(jìn)化樹校驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄RNA的提取及CHS基因全長(zhǎng)cDNA的獲得

提取到的葡萄總RNA凝膠電泳結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，提取的總RNA完整無(wú)降解，質(zhì)量較高，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

以葡萄葉片cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的葡萄CHS特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2），得到單一條帶，且大小與預(yù)測(cè)的相符。將擴(kuò)增得到的條帶切膠回收后與pMD-19T連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，分別進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)和測(cè)序檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果證實(shí)克隆得到VvCHS1和VvCHS3的完整ORF序列，ORF序列大小分別為1 182 bp和1 170 bp。

2.2 植物CHS基因的系統(tǒng)發(fā)生及其進(jìn)化分析

在NCBI database數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到CHS 家族中目前已報(bào)道的cDNA 全長(zhǎng)核苷酸序列，推導(dǎo)出其編碼的氨基酸序列共20 條。并整合為Fasta 格式。根據(jù)氨基酸序列做進(jìn)化樹分析（圖3）。結(jié)果表明，20 個(gè)來(lái)源于不同植物的CHS聚類到3個(gè)大組中，第1組最大，包括14 個(gè)蛋白；第2組次之，包括4 個(gè)蛋白；第3組只有兩個(gè)蛋白。其中，第1組的14 個(gè)蛋白又分為至少3個(gè)亞組：5 個(gè)葡萄VvCHS，除VvCHS3 外，其余4 個(gè)形成第1亞組；豇豆和豌豆形成第2亞組；番茄、矮牽牛、藍(lán)莓和葡萄VvCHS3 形成第3亞組。本文報(bào)道的VvCHS1 和VvCHS3 分屬不同的兩個(gè)亞組，表明植物CHS 基因在植物的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了歧化，形成了該基因在構(gòu)成和功能上的多樣性。與VvCHS3 同組的番茄、藍(lán)莓和矮牽牛都是富含花青素的植物，說(shuō)明VvCHS3 與花青素合成密切相關(guān)。而VvCHS1 及其與其聚類在同一亞組的其他3個(gè)VvCHS與相思樹和非洲菊親緣關(guān)系更近，至于其催化形成的查爾酮主要轉(zhuǎn)化形成哪種次生代謝物，這還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

采用RT-PCR技術(shù)從葡萄中克隆得到兩個(gè)查耳酮合酶（CHS）的cDNA開放閱讀框（ORF）序列VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1序列長(zhǎng)1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸；VvCHS3序列長(zhǎng)1 170 bp，編碼389個(gè)氨基酸。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明，兩個(gè)CHS基因編碼的氨基酸分屬于第一大組的不同亞組，在進(jìn)化中產(chǎn)生了歧化，形成了植物CHS的多樣性。本文對(duì)葡萄查耳酮合酶基因及其系統(tǒng)發(fā)生的分析，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其在葡萄適應(yīng)性機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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3 結(jié) 論

采用RT-PCR技術(shù)從葡萄中克隆得到兩個(gè)查耳酮合酶（CHS）的cDNA開放閱讀框（ORF）序列VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1序列長(zhǎng)1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸；VvCHS3序列長(zhǎng)1 170 bp，編碼389個(gè)氨基酸。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明，兩個(gè)CHS基因編碼的氨基酸分屬于第一大組的不同亞組，在進(jìn)化中產(chǎn)生了歧化，形成了植物CHS的多樣性。本文對(duì)葡萄查耳酮合酶基因及其系統(tǒng)發(fā)生的分析，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其在葡萄適應(yīng)性機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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3 結(jié) 論

采用RT-PCR技術(shù)從葡萄中克隆得到兩個(gè)查耳酮合酶（CHS）的cDNA開放閱讀框（ORF）序列VvCHS1、VvCHS3。其中，VvCHS1序列長(zhǎng)1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸；VvCHS3序列長(zhǎng)1 170 bp，編碼389個(gè)氨基酸。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明，兩個(gè)CHS基因編碼的氨基酸分屬于第一大組的不同亞組，在進(jìn)化中產(chǎn)生了歧化，形成了植物CHS的多樣性。本文對(duì)葡萄查耳酮合酶基因及其系統(tǒng)發(fā)生的分析，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其在葡萄適應(yīng)性機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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