長(zhǎng)鏈非編碼RNA在脂多糖刺激的大鼠腸巨噬細(xì)胞中的差異表達(dá)

劉路路，鄒松，錢小寶，陳吉祥，瞿建國(guó)，崔磊，張建新，黨勝春

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

腸黏膜屏障具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物吸收和防止細(xì)菌入侵的功能[1]。重癥急性胰腺炎、炎性腸病和感染性腹瀉綜合征等許多疾病可導(dǎo)致腸屏障功能障礙[2-4]。巨噬細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞因子分泌等作用方式調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答，在腸道免疫屏障中起重要作用[5]。

lncRNA轉(zhuǎn)錄物缺少顯著的開放閱讀框（open reading frame，ORF），由長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸分子組成，以前被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“噪音”[6-7]。隨著lncRNA基因芯片、高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中引起相當(dāng)大的關(guān)注[8-9]。它們具有許多生物學(xué)功能，包括基因組印記，染色體劑量補(bǔ)償，X染色體沉默，染色體修飾，核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)錄激活[10]。最近研究[11-13]表明lncRNA參與調(diào)控許多生物過(guò)程和人類疾病，包括造血、癌癥、肌肉生物學(xué)和免疫學(xué)等。最近研究[14-15]表明lncRNA可以調(diào)控炎癥反應(yīng)，其中最重要的效應(yīng)細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。然而，關(guān)于它們?cè)谀c巨噬細(xì)胞和腸屏障功能障礙中的潛在作用有待深入研究。在這項(xiàng)研究中，主要目的是研究LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠腸巨噬細(xì)胞炎癥模型中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜，為后期研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠200～250 g（揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、青霉素和鏈霉素購(gòu)自Hyclone公司。等滲細(xì)胞分離溶液（Percoll溶液）、膠原酶IV購(gòu)自Worthington公司。一抗為CD14兔源多克隆抗體，按1:300稀釋；二抗為FITC偶聯(lián)山羊抗兔IgG（H+L），稀釋比例為1:50（碧云天生物技術(shù)公司）。Agilent 2100生物分析儀（美國(guó)安捷倫科技公司）。TRIzol試劑、引物/探針、DEPC H2O、SuperScript III Reverse Transcriptase、SYBR Green I、oligo dT/Random primer、Platinum Taq DNA Polymerase、100mM dNTPs購(gòu)自Invitrogen公司，miRNAeasy Mini Kit（QIAGEN公司）。Rnase Inhibitor購(gòu)自Fermentas公司。上海其名生物技術(shù)公司進(jìn)行選擇芯片，設(shè)計(jì)探針，分析數(shù)據(jù)等工作。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)及鑒定腸巨噬細(xì)胞 分離培養(yǎng)及鑒定腸巨噬細(xì)胞同本課題組前期研究方法[16]。用RPMI 1640 培養(yǎng)基（10%FBS，青霉素 100 μg/mL；鏈霉素100 U/mL）將細(xì)胞濃度調(diào)到5×l05/L接種于96孔板和6孔板中，每孔分別為200 μL和2 mL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將其接種于24孔板，讓其貼壁。待生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，PBS清洗，甲醇固定后，分別加1 mL PBS-T、PBS-B 液并分別于 4 ℃下處理細(xì)胞 10 min，37 ℃處理細(xì)胞30 min。加一抗，4 ℃下孵育過(guò)夜。次日移除一抗PBS清洗5 min，加二抗37 ℃下孵育，1 h后用PBS洗滌3次，每次5 min。封片，用熒光顯微鏡觀察并拍照，呈綠色熒光則陽(yáng)性。

1.2.2 提取腸巨噬細(xì)胞總RNA 對(duì)照組不給藥，實(shí)驗(yàn)組 LPS給藥濃度為 1 mg/L，培養(yǎng) 6h后使用TRIzol試劑提取總RNA。用含RNA的水相和miRNAeasy Mini試劑盒進(jìn)行總RNA純化。通過(guò)使用分光光度計(jì) 2000（Thermo Scientific）測(cè)量 260 nm和280 nm處的吸光度的比率來(lái)評(píng)估RNA的純度。在瓊脂糖凝膠上觀察測(cè)量RNA完整性。

1.2.3 基因芯片分析及構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖在 Genminix Informatic Ltd（中國(guó)上海） 進(jìn)行微陣列實(shí)驗(yàn)，選擇 Affymetrix Gene Chip Mouse Transcriptome Array 1.0分析兩組差異表達(dá)的lncRNA。芯片檢測(cè)的大體步驟：樣本RNA抽提及質(zhì)量檢測(cè)、cDNA合成、正義鏈cDNA片段化、生物素標(biāo)記、芯片雜交、洗脫、掃描、檢測(cè)信號(hào)值過(guò)濾去除低于背景的弱信號(hào)值。構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，計(jì)算基因間Pearson相關(guān)系數(shù)，根據(jù)其大小篩選有共表達(dá)關(guān)系的基因構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 RT-qPCR 大鼠腸巨噬細(xì)胞總RNA提取后轉(zhuǎn)錄為cDNA。先根據(jù)lncRNA-mRNA-Network分析結(jié)果，挑選差異＞0.5的lncRNA。經(jīng)過(guò)此步篩選，剩下32個(gè)lncRNA。然后結(jié)合差異lncRNA分析結(jié)果，挑選差異程度比較大的lncRNA。篩選的閾值為差異倍數(shù)為2倍及以上，經(jīng)過(guò)此步篩選，剩下了7個(gè)lncRNA，再?gòu)闹须S機(jī)挑選1個(gè)上調(diào)及1個(gè)下調(diào)的lncRNA加以驗(yàn)證，為以后的研究做準(zhǔn)備，其逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下：NONMMUT024673上游引物 5'-TGT TGG GAT GTC AGC TCT GC-3'，下游引物 5'-TGG GCT GTG ACG GAC TAA AC-3'；NONMMUT047081上游引物 5'-TCA ATT CCA GGA CTC TGG ATG C-3'，下游引物 5'-GGA TGG GTC TTC TAA TTG CAC C-3'。用 SYBR 染料法，以MUS-actin為參照。使用熒光定量PCR儀（CFX96TM Real-Time Systerm，Bio Rad），用2-ΔΔCt方法分析目的基因表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

芯片差異lncRNA統(tǒng)計(jì)分析采用RVM修正后的t檢驗(yàn)（two-samplet-test with random variance model），使用工具為BRB-array Tools（V4.3.2）。聚類分析使用的是層次聚類，工具為Cluster 3.0和TreeViewer；RT-qPCR用的是配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腸巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

用顯微鏡觀察大鼠的腸巨噬細(xì)胞可見細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，活力約80%～85%，綠色熒光是CD14陽(yáng)性細(xì)胞，即為大鼠腸巨噬細(xì)胞（圖1）。

圖1 腸巨噬細(xì)胞的鑒定（×100） A：光鏡觀察；B： CD14熒光染色Figure 1 Identi fication of intestinal macrophages A: Microscopic view; B: fl uorescence staining for CD14

2.2 基因芯片分析lncRNA表達(dá)譜

應(yīng)用基因芯片分析LPS誘導(dǎo)的大鼠腸巨噬細(xì)胞組和未處理組之間lncRNA表達(dá)譜。LPS刺激的腸巨噬細(xì)胞組和對(duì)照組之間差異表達(dá)的lncRNA總共有357個(gè)，其中245個(gè)上調(diào)，112個(gè)下調(diào)（變化倍數(shù)＞1.5）（表1）。通過(guò)分層聚類的方法分析了兩組差異表達(dá)的lncRNA（圖2），可見LPS處理和未處理的腸巨噬細(xì)胞間存在差異表達(dá)的lncRNA。

2.3 構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析探討哪些lncRNA在大鼠腸巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用。結(jié)果表明，lncRNA NONMMUT047081，NONMMUT024673在網(wǎng)絡(luò)中可能起重要作用（圖3）。GO分析和通路分析顯示這些編碼基因參與多種生物過(guò)程，包括炎癥反應(yīng)，免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡。根據(jù)這些結(jié)果，篩選的lncRNA NONMMUT024673、NONMMUT047081可以進(jìn)一步分析，以闡明在腸巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用，以及在腸屏障功能失調(diào)中的作用機(jī)制。

表1 前20個(gè)差異表達(dá)的lncRNATable 1 Top 20 differentially expressed lncRANs

圖2 分層聚類分析差異表達(dá)的lncRNAFigure 2 Hierarchical clustering analysis of the differentially expressed lncRNAs

圖3 lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 lncRNA-mRNA co-expression network plot

2.4 RT-qPCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)篩選的兩個(gè)差異表達(dá)lncRNA NONMMUT024673、NONMMUT047081進(jìn)行驗(yàn)證，PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致（圖4）。

圖4 RT-qPCR驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)Figure 4 Veri fication of microarray data by RT-qPCR

3 討 論

腸黏膜屏障是保護(hù)人體的重要效應(yīng)器，多種因素如炎癥介質(zhì)、細(xì)菌毒素、缺血再灌注損傷等可引起腸屏障功能障礙[17]。腸黏膜中的巨噬細(xì)胞占人體組織中絕大部分巨噬細(xì)胞，并在腸道免疫屏障中起重要作用，它可促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，參與級(jí)聯(lián)的形成，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，從而引起腸屏障功能障礙[18]。LPS誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中TREM-1的表達(dá)，從而激活各種炎癥細(xì)胞因子例如TNF-α及IL-6等，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒和單核-巨噬細(xì)胞吞噬，這些現(xiàn)象導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的擴(kuò)增[19]。已有研究[20]表明巨噬細(xì)胞吞噬氯膦酸二鈉脂質(zhì)體通過(guò)抑制Akt和MAPK（ERK1/2）來(lái)減少炎癥因子釋放。目前已有許多研究腸巨噬細(xì)胞來(lái)阻斷炎癥的過(guò)度激活，以保護(hù)腸黏膜屏障。

盡管lncRNA在一些領(lǐng)域取得了快速進(jìn)展，但在炎癥反應(yīng)中的作用才嶄露頭角。最近，Carpenter等[21]證實(shí)小鼠lincRNA-Cox2與多種異質(zhì)核核糖核蛋白（hnRNPs）相互作用以調(diào)控免疫應(yīng)答基因的激活和抑制。Cui等[22]發(fā)現(xiàn)與IL-7受體α亞基（IL7R）基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）重疊的lnc-IL7R有助于炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。Chen等[23-24]揭示在潰瘍性結(jié)腸炎中，lncRNA具有調(diào)節(jié)腸屏障功能的作用。此外lncRNA也具有調(diào)控巨噬細(xì)胞的作用，Ma等[25]研究表明linc-Tnfaip3RNA作為NF-κB的調(diào)控因子，可調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞的炎癥基因轉(zhuǎn)錄。

本研究檢測(cè)LPS誘導(dǎo)大鼠腸巨噬細(xì)胞的炎癥模型中差異表達(dá)的lncRNA，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS處理的大鼠腸巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNA共有357個(gè)，其中245個(gè)上調(diào)，112個(gè)下調(diào)（變化倍數(shù)＞1.5）。lncRNA NONMMUT024673、NONMMUT047081在LPS刺激的腸巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)顯著。許多研究[26-27]表明lncRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)鄰近編碼基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)起作用。筆者推測(cè)lncRNA NONMMUT024673及NONMMUT047081通過(guò)調(diào)節(jié)鄰近的編碼基因來(lái)調(diào)控炎癥反應(yīng)。因此需要運(yùn)用生物信息學(xué)手段尋找表達(dá)差異lncRNA的靶基因，并用分子生物學(xué)技術(shù)加以驗(yàn)證。總之，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在LPS刺激的大鼠腸巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)譜，可能涉及調(diào)控腸屏障功能障礙時(shí)腸巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)，是腸屏障功能障礙潛在的靶點(diǎn)。

總之，本研究表明LPS處理的大鼠腸巨噬細(xì)胞改變了lncRNA在腸巨噬細(xì)胞中的表達(dá)譜。盡管需要更多的研究來(lái)證明這些lncRNA的確切調(diào)控機(jī)制，但我們鑒定的基因組數(shù)據(jù)可以增加在腸屏障功能障礙時(shí)，腸巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA調(diào)控炎癥反應(yīng)的了解，為進(jìn)一步研究做準(zhǔn)備。

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