MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA在結(jié)腸癌患者外周血中的表達及意義

鄭宇，張德進，劉俊，殷杰

（江蘇省海安縣人民醫(yī)院 普通外科，江蘇 海安 226600）

血液循環(huán)中的腫瘤細胞是導致結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)的重要原因之一[1-2]。RT-PCR的應用為外周血中腫瘤細胞的檢測提供了一種具有高度敏感性和特異性的分子生物學方法[3]。相關(guān)研究[4-7]表明基質(zhì)金屬蛋白酶11（MMP-11）、癌胚抗原（CEA）、細胞角蛋白20（CK-20）、CD44與消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。本研究采用RT-PCR方法檢測結(jié)腸癌患者外周血中游離腫瘤細胞及組織標本中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA的表達情況，研究其與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，為結(jié)腸癌的早期篩查及臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集江蘇省海安縣人民醫(yī)院結(jié)腸癌患者臨床資料（初診結(jié)腸癌患者、晚期結(jié)腸癌患者各20例）及健康體檢者20例血液標本。初診結(jié)腸癌患者20例，男13例，女7例；平均年齡（70.8±4.2）歲。晚期結(jié)腸癌患者20例，男14例，女6例；平均年齡（68.3±5.6）歲。初診結(jié)腸癌患者高、中分化癌17例，低分化癌3例。晚期結(jié)腸癌患者高、中分化癌14例，低分化癌6例。初診結(jié)腸癌患者Dukes分期：A期4例，B期15例，C期1例，均行根治性切除。晚期結(jié)腸癌患者根治性切除8例，姑息性切除者12例。同期健康體檢者20例，其中男13例，女7例，平均年齡（67.5±6.2）歲。

1.2 分組

⑴ 試驗組（40例）：初診結(jié)腸癌患者（未經(jīng)放化療、未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移）和晚期結(jié)腸癌患者（已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移）各20例外周血樣本10 mL。⑵ 對照組（40例）：陽性對照組為上述20例晚期結(jié)腸癌患者手術(shù)切除的癌組織樣本；陰性對照組為健康體檢者20例外周血樣本10 mL，分別提取上述各組樣本的總RNA，采用RT-PCR檢測MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA的表達情況。

1.3 方法

1.3.1 儀器與主要試劑 主要設備：COBE外周血細胞分離機、OLYMPUS倒置顯微鏡、Thermofisher PCR 儀、Thermofisher超低溫冰箱、Thermofisher液 氮儲存箱、Eppendorf臺式高速離心機、純水儀等設備。主要試劑：Power SYBR Green PCR Master Mix（2X）（Life technologies），RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit（Thermo scientific），Trizol Reagent（Life technologies），異丙醇（西隴化工股份有限公司），無水乙醇（無錫市晨陽化工有限公司），三氯甲烷（宜興市第二化學試劑廠），碳酸氫鉀（上海潤捷化學試劑有限公司），氯化銨（江蘇彤晟化學試劑有限公司），乙二胺四乙酸二鈉（江蘇彤晟化學試劑有限公司），氫氧化鈉（江蘇彤晟化學試劑有限公司），MMP-11、CEA、CK-20、CD44試劑（羅氏公司）。

1.3.2 RT-PCR操作過程 ⑴ RNA的提?。焊鹘MEDTA 抗凝血 10 mL，Trizol法提取全血 RNA，凍存于-80℃?zhèn)溆?。癌組織塊500 mg，用液氮研磨至粉狀，用Trizol提取總RNA。⑵ 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（反應體系：4μL 5× 逆轉(zhuǎn)錄 buffer，0.4 μL 下游引物（10 pmol/μL），0.5 μL dNTPs（10 mM），l μL MMLv（200 U/μL），10.1 μL DEPC 水，4μL RNA模板，總體積 20 μL，加 2 μL RNA 提取液，37℃水 浴 60 min，95 ℃ 3 min。⑶ RT-PCR：MMP-11 mRNA上、下游引物序列分別為5'-GAG AAG ACG GAC CTC ACC TAC A-3'、5'-CTC AGT AAA GGT GAG TGG CGT C-3'；CEA mRNA 上、 下游引物列 5'-TCT AAC CCA TCC CCG CAG TA-3'、5'-TTA TTG CGG CCA GTA GCC AA-3'；CK-20 mRNA 上、下游引物序列 5'-AAG AAC CTT CAA GAG GCC AA-3'、5'-CTA GAG TGT GCT CCA AAG ACT-3'；CD44 mRNA 上、下游引物 列 5'-CAG CAA CCC TAC TGA TGA TGA CG-3'、5'-GCC AAG AGG GAT GCC AAG ATG A-3'。β-actin 上、下游引物序列分別為 5'-AGA AAA TCT GGC ACC ACA CC-3'、5'-AGA GGC GTA CAG GGA TAG CA-3'。每個反應均取PCR反應液50 μL、Tag酶2 μL、RT 反應產(chǎn)物 5 μL；MMP-11：反應條件：94 ℃變性 45 s，60 ℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，擴增35個循環(huán)。CD44反應條件：94 ℃變性40 s，60 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 60 s，擴增 40 個循環(huán)。CEA 反應條件為：93 ℃變性 30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸45 s，共40循環(huán)；CK20反應條件為：95 ℃變性 40 s，58 ℃退火 50 s，70 ℃延伸 40 s，共38循環(huán)。

1.4 RT-PCR定量檢測與相對定量

定量檢測MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達水平，通過MMP-11、CEA、CK-20、CD44的Ct值與β-actin的Ct值得到△Ct值。通過△Ct計算2-△△Ct比較各組MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達的相對定量關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達

結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標志物表達水平高于健康體檢者（P＜0.05）；晚期結(jié)腸癌患者癌組織中各腫瘤標志物水平均高于其外周血中的腫瘤標志物水平（均P＜0.05）；Dukes C-D期結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標志物含量均高于Dukes A-B期患者（均P＜0.05）；低分化結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標志物含量均高于高、中分化結(jié)腸癌患者（均P＜0.05）（表1）。

2.2 相對定量分析

通過△Ct計算2-△△Ct比較以上各組MMP-11，CEA，CK-20，CD44 mRNA表達的相對定量顯示：結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標志物水平明顯高于健康體檢者；晚期結(jié)腸癌患者癌組織中各腫瘤標志物水平明顯高于其外周血腫瘤標志物水平；Dukes C-D期結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標志物水平明顯高于Dukes A-B期患者；低分化結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標志物明顯高于高、中分化結(jié)腸癌患者（表2）。

表1 各組MMP-11，CEA，CK-20，CD44 mRNA比較（△Ct，±s）

表1 各組MMP-11，CEA，CK-20，CD44 mRNA比較（△Ct，±s）

注：1）與陰性對照組比較，P＜0.05；2）與晚期結(jié)腸癌癌組織比較，P＜0.05；3）與Dukes C-D期比較，P＜0.05；4）與低分化者比較，P＜0.05

標本 MMP-11 CEA CK-20 CD44試驗組外周血 12.79±0.791) 11.95±1.981) 14.99±1.671) 4.20±0.701)陰性對照組外周血 13.28±0.89 13.12±1.55 15.94±1.46 4.94±0.56晚期結(jié)腸癌外周血 12.50±0.672) 11.22±1.992) 14.37±1.802) 3.96±0.592)晚期結(jié)腸癌癌組織 4.82±2.06 2.42±2.75 3.31±3.14 2.15±0.90 Dukes A-B 外周血 13.08±0.833) 12.69±1.723) 15.60±1.293) 4.43±0.743)Dukes C-D 外周血 12.50±0.67 11.22±1.99 14.37±1.80 3.96±0.59高、中分化外周血 12.89±0.564) 12.30±1.774) 15.26±1.564) 4.32±0.664)低分化外周血 12.05±0.78 9.49±1.76 13.09±1.11 3.35±0.22

表2 各組MMP-11，CEA，CK-20，CD44 mRNA表達的相對定量關(guān)系（2-△△Ct）

3 討 論

腫瘤標志物是由腫瘤細胞合成、釋放或者是宿主對癌類反應性的一類物質(zhì)，它們的存在或在血液中水平的變化可以提示腫瘤的性質(zhì)，同時有助于了解腫瘤的組織發(fā)生、細胞分化及細胞功能[8]。MMP-11是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族的成員之一，其作用底物主要是基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白，能降解細胞外基質(zhì)和基底膜，可以導致細胞外基質(zhì)代謝平衡的失調(diào)，從而引發(fā)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，在人體不同實體瘤中MMP-11有不同程度的增高，與腫瘤進展及預后相關(guān)[9-10]。CEA是一種糖蛋白抗原，是常見的大腸癌腫瘤標志物，正常情況下CEA經(jīng)胃腸道代謝，而腫瘤狀態(tài)時CEA則進入血和淋巴循環(huán)，引起血清CEA異常增高[11-13]。細胞角蛋白20（CK-20）具有嚴格的上皮組織特異性，它非常局限于胃腸上皮細胞，在腫瘤組織及其血液中表達升高[14-15]。CD44是一種分布廣泛的跨膜糖蛋白分子，具有激活淋巴細胞、參與信號傳遞、促進細胞間黏附等多種生物學功能，許多類型的惡性腫瘤存在不同程度CD44分子表達，高表達CD44分子的腫瘤細胞通過與細胞外基質(zhì)中透明質(zhì)酸、血管內(nèi)皮細胞的黏著，賦予腫瘤細胞很強的侵襲轉(zhuǎn)移能力，與腫瘤的生長、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后密切相關(guān)[16-17]。

本研究結(jié)果顯示：結(jié)腸癌患者外周血中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 4種腫瘤標志物水平明顯高于健康體檢者（P＜0.05）；結(jié)腸癌Dukes C-D期患者外周血中各腫瘤標志物含量明顯高于Dukes A-B期患者（P＜0.05）；低分化結(jié)腸癌患者外周血中各腫瘤標志物明顯高于高、中分化結(jié)腸癌患者（P＜0.05）。本實驗說明MMP-11、CEA、CK-20、CD44可作為結(jié)腸癌診斷的腫瘤標志物，且隨著結(jié)腸癌惡性程度的增高和Dukes分期的進展，結(jié)腸癌患者外周血中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達水平也增加，從而提示外周血中腫瘤標志物水平也逐漸增高，可為結(jié)腸癌患者的早期診斷、惡性程度的判斷、及疾病分期提供有價值的信息。腫瘤標志物均存在敏感性和特異性較低的局限性，特別是單一的標志物對結(jié)腸癌的早期診斷意義有限，而多種腫瘤標志物聯(lián)合檢測有助于提高診斷的敏感性和準確性，目前多種腫瘤標志物聯(lián)合檢測已成為結(jié)腸癌早期診斷、手術(shù)方式選擇、判斷預后的一種重要手段[18]。聯(lián)合檢測上述四種腫瘤標志物可提高結(jié)腸癌診斷的敏感性和準確性，但目前尚無文獻報道聯(lián)合檢測外周血中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA的表達以早期篩查、診斷結(jié)腸癌。今后可進一步行聯(lián)合檢測結(jié)腸癌患者外周血MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA的表達及其相關(guān)性的研究。

總之，外周血中MMP-11、CEA、CK-20、CD44 mRNA表達水平的變化對于結(jié)腸癌的診斷及臨床分期很有價值，為結(jié)腸癌的早期篩查提供了較準確的檢查方案。

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