三七茜草宮內(nèi)緩釋硅橡膠棒的制備及體外釋放性能的初步評(píng)價(jià)

徐麗+曹廣尚+王信+李文明+師偉+李盼盼+張芳+李彥楠

[摘要]制備三七茜草宮內(nèi)緩釋硅橡膠棒并對(duì)其進(jìn)行體外釋放性能的初步評(píng)價(jià)。采用開(kāi)煉機(jī)開(kāi)練法進(jìn)行硅橡膠的塑煉。采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行硅橡膠與藥物的混煉工藝參數(shù)優(yōu)選。采用單因素試驗(yàn)法進(jìn)行硅橡膠棒硫化工藝參數(shù)的優(yōu)選。以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、羥基茜草素、大葉茜草素為指標(biāo)，進(jìn)行體外釋放性能的初步評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，硅橡膠與藥物混煉的最佳工藝參數(shù)為：輥距2 mm，速比1∶12，前輥溫55～60 ℃，后輥溫50～55 ℃，塑煉時(shí)間20 min。硅橡膠棒的最佳硫化工藝參數(shù)為：溫度90 ℃，時(shí)間60 min。體外釋放度試驗(yàn)表明，三七茜草宮內(nèi)緩釋硅橡膠棒在模擬宮腔液中的藥物釋放符合Higuchi方程，到90 d，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的累積釋放度為467%，羥基茜草素及大葉茜草素的累積釋放度為519%。結(jié)果表明，三七茜草宮內(nèi)硅橡膠棒制備工藝合理可行，具備良好的緩釋特性。

[關(guān)鍵詞]三七； 茜草； 宮內(nèi)緩釋硅橡膠； 體外釋放

放置宮內(nèi)節(jié)育器（intrauterine device，IUD）是國(guó)際普遍使用的女性主要避孕方法之一，但其出血副反應(yīng)的3年取出率高達(dá)5568%[1]，明顯影響IUD接受率和續(xù)用率，近年來(lái)臨床上研發(fā)的含藥宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)IUD能有效避免口服藥物副反應(yīng)，已成為防治該病的有效方法，如吲哚美辛（活性γIUD）、左炔諾孕酮（LNG，曼月樂(lè)）等[23]，但其仍存在點(diǎn)滴不規(guī)則出血等不足，目前尚無(wú)具有中醫(yī)理論的含中藥宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)IUD。宮寧顆粒是本課題組首創(chuàng)的專門防治IUD出血副反應(yīng)的中成藥（國(guó)家準(zhǔn)字號(hào)新藥Z20010155），本文擬選擇其組方代表藥物（三七、茜草），結(jié)合當(dāng)前的中藥有效組分研究成果，制備三七茜草宮內(nèi)緩釋硅橡膠棒，進(jìn)一步研發(fā)中藥宮內(nèi)緩釋IUD，將該病的中醫(yī)藥內(nèi)服治療轉(zhuǎn)化為宮腔內(nèi)持續(xù)外治給藥，提高藥物局部濃度，避免中藥口服繁瑣和依從性不穩(wěn)定等不足，豐富中醫(yī)婦科學(xué)外治法理論，拓展中醫(yī)藥在計(jì)劃生育避孕藥具研發(fā)中的應(yīng)用。

1材料

XK250型開(kāi)放式煉膠機(jī)（青島業(yè)飛機(jī)械有限公司）；LESI小型精密橡膠專用擠出機(jī)（廣州市普同實(shí)驗(yàn)分析儀器有限公司）；Aglient 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent有限公司）；AB135S型電子天平（Mettler Toledo公司）；B3125X柜式烘爐（上海安競(jìng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；5820型非接觸式厚度計(jì)量器（奧瑞克精密測(cè)量系統(tǒng)有限公司）；VR6100型自動(dòng)威廉塑度機(jī)（弘埔技術(shù)有限公司）；KD4011型橡膠雙頭快速切片機(jī)（江都市凱德試驗(yàn)機(jī)械廠）；IIC XLDS15型橡膠交聯(lián)密度儀（威訊科技有限公司）。

人參皂苷Rg1對(duì)照品（110703201027，純度963%），人參皂苷Rb1對(duì)照品（110704200420，純度949%），三七皂苷R1對(duì)照品（110745200210，純度984%），羥基茜草素對(duì)照品（111898201102，純度867%），大葉茜草素（110884201405，純度990%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；醫(yī)用硅橡膠A，B（南京羅恩硅材料有限公司）；三七總皂苷（總皂苷764%，人參皂苷Rg1 196%，人參皂苷Rb1 254%，三七皂苷R1 103%，自制）；茜草總蒽醌（總蒽醌721%，羥基茜草素417%，大葉茜草素126%，自制）；乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

21加成硅橡膠的塑煉

取1份醫(yī)用硅橡膠A，在開(kāi)煉機(jī)上煉成薄帶，輥距為3 mm，速比1∶112，前輥溫55～60 ℃、后輥溫50～55 ℃，塑煉時(shí)間8 min；另取1份醫(yī)用硅橡膠B，分次均勻加入A醫(yī)用硅膠薄帶塑煉，塑煉時(shí)間為10 min，形成加成硅橡膠。

22硅橡膠可塑度的測(cè)定

采用橡膠雙頭快速切片機(jī)制備直徑（16±05） mm，高（10±03） mm的圓柱形試樣，用厚度計(jì)測(cè)量試樣原高h(yuǎn)0。先將試樣預(yù)熱（70±1） ℃，3 min，測(cè)量在負(fù)荷作用下的高度h1，然后去掉負(fù)荷，取出試樣在室溫下放置3 min，測(cè)量恢復(fù)后的高度h2。計(jì)算硅橡膠的可塑度P。

計(jì)算公式P=（h0-h2）/（h0+h1），硅橡膠的可塑度越高，可塑性越好。

23正交試驗(yàn)優(yōu)選加成硅橡膠與藥粉的混煉工藝

采用開(kāi)煉機(jī)開(kāi)練法進(jìn)行加成硅橡膠與藥粉的混煉。取1份加成硅橡膠和1份三七總皂苷茜草總蒽醌混合物，以輥距、速比、前后輥溫、塑煉時(shí)間為因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，以硅橡膠可塑度P為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選加成硅橡膠與藥粉的混煉工藝參數(shù)。

徐麗等：三七茜草宮內(nèi)緩釋硅橡膠棒的制備及體外釋放性能的初步評(píng)價(jià)由以上數(shù)據(jù)分析可知，A，B，C，D 3因素影響硅橡膠可塑度的主次順序?yàn)镈>A>B>C， A，D因素為顯著因素（D>A），B，C為不顯著性因素，直觀分析最佳混煉工藝為A1B3C2D3。

24含藥硅橡膠棒的擠出硫化工藝參數(shù)優(yōu)選

241含藥硅橡膠棒的擠出工藝

取含藥硅橡膠適量，置小型精密橡膠專用擠出機(jī)中（直徑為08 mm圓形擠出口型），電機(jī)功率22 kW，擠出溫度25 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速120 r·min-1 。擠出的硅橡膠條表面光亮，相互間不黏連，裁剪成長(zhǎng)度為4 cm的小段，即得。

242硅橡膠棒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定[4]

2421液相色譜條件采用Kromasil C18柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相乙腈（A）水（B），梯度洗脫（0～12 min，15% A；12～85 min，15%～40% A），檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，流速10 mL·min-1，柱溫40 ℃。理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2422對(duì)照品溶液的制備取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg1 04 mg、人參皂苷Rb1 04 mg及三七皂苷R1 01 mg的混合溶液，即得。

2423供試品溶液的制備取硅橡膠棒適量，剪碎，取約01 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2424陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例，不加三七總皂苷提取物，制得缺三七的模擬制劑，按上述制備方法制備樣品，作為陰性對(duì)照溶液。

精密量取以上3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀。結(jié)果供試樣品在人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1對(duì)照品色譜峰位處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，陰性樣品無(wú)相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

243硅橡膠棒中大葉茜草素及羥基茜草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定[5]

2431液相色譜條件采用Kromasil C18柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇乙腈02%磷酸溶液25∶52∶23，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，流速10 mL·min-1；柱溫30 ℃。理論板數(shù)按羥基茜草素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2432對(duì)照品溶液的制備取羥基茜草素及大葉茜草素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含羥基茜草素004 mg及大葉茜草素01 mg的混合溶液，即得。

2433供試品溶液的制備同2423項(xiàng)下供試品溶液制備方法。

2434陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例，不加茜草總蒽醌提取物，制得缺茜草的模擬制劑，按2423項(xiàng)下制備方法制備樣品，作為陰性對(duì)照溶液。

精密量取以上3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀。結(jié)果供試樣品在羥基茜草素及大葉茜草素對(duì)照品色譜峰位處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，陰性樣品無(wú)相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

1 羥基茜草素；2 大葉茜草素。

244硅橡膠棒的硫化工藝參數(shù)優(yōu)選

硅橡膠棒經(jīng)過(guò)硫化得到定型，在硫化過(guò)程中，硅橡膠發(fā)生交聯(lián)，交聯(lián)密度越高，藥物的緩釋性能越好，其中硫化溫度及硫化時(shí)間是影響硅橡膠硫化的重要因素，因此采用單因素試驗(yàn)法，以硅橡膠的交聯(lián)密度和硅橡膠棒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，進(jìn)行硫化工藝參數(shù)的優(yōu)選。

2441硅橡膠棒交聯(lián)密度的測(cè)定[6]交聯(lián)密度的測(cè)定在ⅡC XLDS15型橡膠交聯(lián)密度儀上進(jìn)行，磁場(chǎng)強(qiáng)度為035 T，共振頻率為15 MHz。施加的脈沖序列為1個(gè)持續(xù)時(shí)間為20 μs的90°脈沖和1個(gè)持續(xù)時(shí)間為40 μs的180°脈沖。按設(shè)定的時(shí)間取點(diǎn)測(cè)試。測(cè)試溫度60～120 ℃。

2442硅橡膠棒硫化溫度的選擇取硅橡膠棒適量，分別置溫度為70，90，110 ℃的烘爐中進(jìn)行硫化，硫化時(shí)間為60 min，測(cè)定硅橡膠棒的交聯(lián)密度及人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

結(jié)果表明， 90，110 ℃下硅橡膠棒的交聯(lián)密度不再變化，而隨溫度的升高，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈逐漸下降的趨勢(shì)，綜合考慮硅橡膠棒性能及藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，選擇硫化溫度為90 ℃。

2443硅橡膠棒硫化時(shí)間的選擇取硅橡膠棒適量，置溫度為90 ℃的烘爐中，硫化時(shí)間分別為40，50，60，70，80 min，測(cè)定硅橡膠棒的交聯(lián)密度及人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。

結(jié)果表明，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，硅橡膠的交聯(lián)密度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，當(dāng)硫化時(shí)間為70 min時(shí)，交聯(lián)密度最大，而硫化時(shí)間對(duì)人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響不大，綜合考慮，選擇硫化時(shí)間為70 min。

51體外釋放度的測(cè)定方法

按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0931第三法進(jìn)行試驗(yàn)，取適量含藥硅橡膠棒，測(cè)定其在模擬宮腔液中（氯化鈉為497 g·L-1、氯化鉀為0224 g·L-1、氯化鈣為0167 g·L-1、碳酸氫鈉為025 g·L-1、磷酸二氫鈉為0072 g·L-1、葡萄糖為05 g·L-1、人血白蛋白為05 g·L-1）的釋放情況，每3 d測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定3個(gè)月，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，介質(zhì)溫度為（370±05） ℃，每3 d更換釋放介質(zhì)，取釋放液5 mL，并迅速補(bǔ)充等體積等溫度的溶出介質(zhì)，濾過(guò)，分別測(cè)定人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、羥基茜草素、大葉茜草素的含量，繪制藥物釋放曲線，計(jì)算藥物的累積釋放度（RR） [78]。

RR=（VCn+Σαj=1V′Cn-1）/W

Cn為第 n 次取樣時(shí)釋放介質(zhì)中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1濃度之和或羥基茜草素、大葉茜草素的濃度之和； V為釋放介質(zhì)的體積； V′為第n次取樣前的取樣體積； W為硅橡膠棒中所能釋放的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1質(zhì)量總和或羥基茜草素、大葉茜草素質(zhì)量總和。

252體外釋放度的測(cè)定及藥物釋放曲線的繪制

按上述測(cè)定方法，測(cè)定硅橡膠棒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的累積釋放度及羥基茜草素、大葉茜草素的累積釋放度，結(jié)果見(jiàn)表6（由于數(shù)據(jù)較多，表中只列明每6 d測(cè)得數(shù)據(jù)），并繪制釋藥曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3，同時(shí)分別采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和Higuchi方程進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明，制備的硅橡膠棒在模擬宮腔液中的藥物釋放符合Higuchi方程，到90 d，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的累積釋放度為467%，羥基茜草素、大葉茜草素的累積釋放度為519%，具有良好的緩釋性能。

3討論

本研究選用雙組份醫(yī)用硅橡膠經(jīng)塑煉后得到加成硅橡膠后與三七、茜草提取物混煉，經(jīng)擠出硫化工藝制備成硅橡膠棒，得到的硅橡膠外觀色澤均勻，富彈性，方便與IUD聯(lián)用，經(jīng)初步體外釋放特性研究，其藥物釋放符合Higuchi方程，到90 d，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的累積釋放度為467%，羥基茜草素、大葉茜草素的累積釋放度為519%，具有良好的緩釋性能，本研究后期將繼續(xù)對(duì)其體內(nèi)的釋放及吸收情況進(jìn)行深入研究。

本研究從首創(chuàng)的專門防治IUD出血副反應(yīng)的中成藥宮寧顆粒精選散瘀止血三七、茜草藥味，經(jīng)精

制得到三七總皂苷、茜草總蒽醌，經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加成硅橡膠與提取物質(zhì)量比為1∶1時(shí)，既保證硅橡膠棒成型，又具有合適的載藥量。

本課題組前期已經(jīng)開(kāi)展經(jīng)“陰道宮頸”途徑的無(wú)創(chuàng)法放置大鼠IUD研究，獲得實(shí)用新型專利“大鼠固定式自照明陰道窺器”（ZL2012 200239517）、“大鼠宮內(nèi)節(jié)育器及其放置器”（ZL2012 200227100），建立了較為成熟的IUD避孕大鼠動(dòng)物模型，本研究前期進(jìn)行了相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在放置16 d時(shí)，通過(guò)大鼠子宮病理切片觀察，制備的三七茜草宮內(nèi)緩釋硅橡膠棒能起到較好的止血抗炎作用，考慮到人和鼠的差異性，后期還需進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國(guó)家人口計(jì)生委科技司12萬(wàn)例宮內(nèi)節(jié)育器避孕效果調(diào)查報(bào)告[J]中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2007，15（3）：132.

[2]羅曉燕，許良智.含吲哚美辛緩釋系統(tǒng)宮內(nèi)節(jié)育器的應(yīng)用[J].中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2010（11）：702.

[3]鄧姍，郎景和.左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)的臨床功用及相關(guān)基礎(chǔ)研究[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè)，2004，31（5）：285.

[4]朱晶晶，王智民，匡艷輝，等一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定人參和三七藥材中多種人參皂苷的含量[J]藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43（12）：1211

[5]郭桂明，蔡樂(lè)，梁小雨，等HPLC法測(cè)定茜草飲片中大葉茜草素和羥基茜草素的含量[J]北京中醫(yī)藥，2011，30（7）：541

[6]汪志芬，佘曉東，李思東，等用核磁共振法研究微生物凝固天然橡膠硫化過(guò)程中交聯(lián)密度的變化[J]廣東化工，2010，37（1）：8

[7]張丹參，梅艷飛，宋曉敏，等大黃結(jié)腸靶向微丸的制備及處方優(yōu)化[J]中草藥， 2016，47（8）：1321

[8]朱鶴云，畢開(kāi)順，韓飛，等梔子大黃湯中活性成分在正常大鼠和酒精性肝損傷大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)比較[J]中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（22）：77[責(zé)任編輯孔晶晶]

2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1January， 2017

[收稿日期]20160907

[基金項(xiàng)目]北京市中醫(yī)管理局項(xiàng)目（QN201418） ； 首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)（15ZY04） ； 北京友誼醫(yī)院院?jiǎn)?dòng)項(xiàng)目（YYQDKT201420）；北京市醫(yī)院管理局“青苗”人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（QML20160106）；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)項(xiàng)目（首發(fā)201642024）

[通信作者]*趙奎君，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究，Tel/Fax：（010） 63138562，Email：zhao1959292@sinacom； *馬致潔，博士，主管藥師，主要從事肝毒性中藥減毒研究，Tel/Fax：（010）63138562，Email：13811647091@163com