超聲輔助提取結(jié)合高效液相色譜

曹玉嬪+閆麗珍+黃紅麗+鄧必陽

摘 要 用蛋白酶K和脂肪酶作為提取劑、用超聲波輔助提取牛蒡和三七樣品中的硒形態(tài)。建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定牛蒡和三七樣品中硒代胱氨酸（SeCys2）、亞硒酸鹽[Se]、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸鹽[Se]的新方法。用8 mmol/L pH 5.0的檸檬酸作為流動相，在8 min內(nèi)可分離4種硒形態(tài)。利用CH4作為DRC反應(yīng)氣體，可消除了40Ar40Ar+對80Se+的干擾，提高了準(zhǔn)確度。SeCys2、Se、SeMet和Se的檢出限分別為0.088， 0.033， 0.30和0.17 ng/mL，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.9995，加標(biāo)回收率范圍為95.1%～114.6%，RSD<3%。將本方法應(yīng)用于牛蒡和三七中硒形態(tài)分析，結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞 硒； 高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜； 牛蒡； 三七； 超聲提取

1 引 言

硒是人體必需微量元素之一[1，2]，具有清除體內(nèi)自由基、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金屬毒性等生物學(xué)功能[3]。許多疾病的發(fā)生與硒的攝入量偏低有關(guān)，硒的攝入量低于每日30 μg，就會出現(xiàn)衰老，易發(fā)心肌炎及其他疾病[4]；攝入量高于每日耐受上限400 μg，就會導(dǎo)致頭發(fā)指甲易斷、皮膚粗糙、腸胃功能紊亂、易怒以及神經(jīng)功能障礙等[5]。體內(nèi)硒的適宜濃度范圍很窄[6]，其生物有效性以及毒性在很大程度上取決于硒的化學(xué)形態(tài)[1，7，8]。

目前，對硒形態(tài)分析常采用液相色譜（LC）[9，10]、氣相色譜（GC）[11]、毛細(xì)管電泳（CE）[12] 等分離手段，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜 （ICP-MS）[7，10]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）[1]、原子吸收光譜（AAS）[13]及原子熒光光譜（AFS）[14]等檢測手段。

牛蒡（Burdock）又名東洋參、牛鞭菜，為菊科牛蒡?qū)俣晟荼局参颷15]。牛蒡是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，具有疏散分熱、解毒消腫的功效。自從牛蒡子中分離得到牛蒡苷以來，牛蒡的食用和藥用價值也越來越受到人們的重視。但牛蒡中硒形態(tài)分析尚未見報道。

三七是五加科人參屬植物三七（Panax notoginseng）的根，是中國特有藥用植物，產(chǎn)于我國的西南部的云南、廣西、江西、四川、湖北等地，當(dāng)?shù)孛耖g發(fā)掘使用源遠(yuǎn)流長[16]。三七是一種常年生中藥，作為一種傳統(tǒng)中草藥已有超過600年的歷史[17]。三七有多種藥理學(xué)活性，常用于治療心血管疾病、腦血管疾病、炎癥、外傷和出血等[18～20]。目前已報道了三七中無機(jī)硒形態(tài)[21，22]，但三七中有機(jī)硒形態(tài)未見報道。

電感耦合等離子體質(zhì)譜 （ICP-MS） 法具有靈敏度高、線性范圍寬、多元素多同位素同時檢測、干擾少等優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜 （HPLC） 具有多種不同的分離模式，強(qiáng)大的分離能力和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。HPLC與ICP-MS聯(lián)用，在靈敏度、準(zhǔn)確度和分析速度等方面表現(xiàn)出優(yōu)勢，而且接口相對簡單，因此HPLC-ICP-MS廣泛應(yīng)用于元素形態(tài)分析。超聲波輔助提取（USAE）具有提取速度快、提取效率高及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。本實驗集中了USAE、HPLC及ICP-MS的優(yōu)點(diǎn)，建立了USAE-HPLC-ICP-MS聯(lián)用的新方法，并用于牛蒡和三七樣品中硒形態(tài)分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

NexIon 300X 型ICP-MS儀器（美國PerkinElmer公司）配備一個動態(tài)反應(yīng)池（Dynamic Reaction Cell， DRC）系統(tǒng)，樣品溶液通過Meinhard玻璃霧化器和玻璃旋流霧室引入到ICP-MS；Flexar液相色譜儀（美國PerkinElmer公司）由Flexar Binary LC Pump和Flexar solvent manager組成，配備Flexar LC Autosampler；Hamilton PRP-X100分析柱（250 mm×4.1 mm， 10 μm， 瑞士Hamilton公司）， Hamilton PRP-X100 保護(hù)柱（20 mm×2.1 mm， 10 μm，瑞士Hamilton公司）；色譜柱與ICP-MS霧化器用PEEK管連接；Titan MPS微波消解儀（美國PerkinElmer公司）；SK3310HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；TG16-W微量高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DZF-300真空干燥箱（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；Purelab Option超純水系統(tǒng)（英國ELGA公司）。

硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（GSB G62029-90（3401），1000 μg/mL，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院）；SeO2（AR，北京市朝陽區(qū)中聯(lián)化工試劑廠）；Na2SeO4（AR，天津市化學(xué)試劑研究所）；硒代胱氨酸（SeCys2，純度98%，北京百靈威公司）；硒代蛋氨酸（SeMet，純度99%，美國Alfa公司）；脂肪酶（AR，北京索萊寶科技有限公司）；蛋白酶K（20 mg/mL，天根生化科技（北京）有限公司）； HNO3、H2O2 （超純，蘇州晶瑞化學(xué)有限公司）；甲烷（99.999%，大連大特氣體有限公司）；檸檬酸、乙酸、氨水、磷酸二氫銨、甲酸（AR，西隴化工股份有限公司）。質(zhì)譜調(diào)諧液（美國PerkinElmer公司）為Be， Mg， In， U， Ce濃度都為1 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。實驗用水為超純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 總硒的測定 牛蒡和三七樣品均購于桂林市藥店。將樣品置于真空干燥箱中低溫烘干，研細(xì)混合均勻，過100目篩。稱取上述樣品0.2000 g于消解罐中，加入6 mL HNO3和1 mL H2O2，按照表1微波消解程序進(jìn)行消解。消解結(jié)束后，冷卻，打開消解罐，樣品溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用超純水洗滌3次，合并洗滌液，再用超純水定容，搖勻備用。同樣方法制備試劑空白溶液。按照表2中ICP-MS條件進(jìn)行測定。

2.2.2 硒形態(tài)分析方法 稱取牛蒡和三七樣品各0.5000 g于10 mL離心管中，加入2 mL超純水，1 mL 20 mg/mL蛋白酶K和10 mg脂肪酶，在超聲頻率為53 kHz和37℃水浴中超聲處理1.5 h，然后以6000 r/min離心15 min，重復(fù)提取二次，將提取液合并，用水稀至10 mL，搖勻備用。同樣方法制備試劑空白溶液。所有溶液測定前經(jīng)0.45 μm水性濾膜過濾。按照表2操作條件，進(jìn)行測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動相類型及濃度的選擇

考慮到應(yīng)盡量采用簡單和無毒試劑作為流動相，本實驗選擇磷酸二氫銨和檸檬酸作為流動相進(jìn)行考察分析。當(dāng)NH4H2PO4作為流動相時，Se保留時間約30 min，并且SeMet信號強(qiáng)度較低。當(dāng)用檸檬酸溶液作為流動相時，可實現(xiàn)4種硒形態(tài)在8 min內(nèi)完全分離，且檸檬酸作為流動相時成分單一，配制簡單，因此，本實驗選擇檸檬酸溶液作為流動相。

考察了檸檬酸濃度對4種硒形態(tài)保留時間的影響，如圖1。隨著檸檬酸濃度的增大，Se的保留時間逐漸減小，當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)到10 mmol/L時，SeMet的保留時間與Se的保留時間重疊，當(dāng)檸檬酸濃度為8 mmol/L時，4種硒形態(tài)在8 min內(nèi)均能良好分離。因此，本實驗選擇檸檬酸濃度為8 mmol/L。

3.2 檸檬酸酸度的影響

在確定了流動相的組成和濃度后，考察了不同酸度條件下檸檬酸對硒形態(tài)分離效果的影響。本實驗采用20% NH3·H2O調(diào)節(jié)檸檬酸的酸度，在pH 4～6范圍內(nèi)，4種硒形態(tài)保留時間見圖2。隨著pH值增大，Se的保留時間逐漸減少。當(dāng)pH=4時，Se的保留時間為14.33 min；當(dāng)pH=6.0時，SeMet和Se已經(jīng)重疊，只出現(xiàn)3個峰；當(dāng)pH=5時，4種硒形態(tài)分離效果最佳。因此，本實驗選擇檸檬酸溶液的pH=5。

3.3 流動相流速對保留時間的影響

為了得到最佳的分離度，實驗考察了流動相流速對硒形態(tài)保留時間的影響，圖3 使用CH4（a）和O2（b）作為DRC氣體時的色譜圖

Fig.3 Chromatograms of selenium species using CH4（a） and O2（b） as dynamic veaction cell （DRC） gas

Concentrations of SeCys2， Se， SeMet and Se are 5 ng/mL each. The detection conditions are shown in Table 2 except CH4隨著流動相流速的增大，4種硒形態(tài)的保留時間均逐漸縮短，當(dāng)流動相流速達(dá)到1.7 mL/min時，SeCys2與Se分不開。綜合考慮，本實驗流動相的流速選擇為1.5 mL/min。

3.4 動態(tài)反應(yīng)池（DRC）條件的優(yōu)化

硒在自然界中有6種同位素，80Se+的豐度最大，然而80Se+容易受到ArAr+的干擾，而ArAr+是ICP中常見的離子，因此本實驗選擇DRC技術(shù)消除干擾。本實驗分別使用O2和CH4作為DRC反應(yīng)氣，考察其對于80Se+的干擾消除情況。當(dāng)SeCys2， Se， SeMet和Se的濃度均為5 ng/mL 時，分別用O2和CH4作為DRC反應(yīng)氣時，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖3。當(dāng)O2作為DRC氣體時，實驗檢測的是96SeO+，而96SeO+容易受到96Mo+的干擾，鉬在植物中含量較高，因此難以完全消除干擾。當(dāng)加入CH4作為DRC反應(yīng)氣時，CH4與40Ar40Ar+反應(yīng)，消除了40Ar40Ar+對于80Se+的干擾。在植物硒形態(tài)分析中，甲烷消除干擾的能力及硒形態(tài)的峰強(qiáng)度均優(yōu)于用O2作為DRC氣體。因此，本實驗選擇CH4作為DRC反應(yīng)氣體。

3.5 ICP-MS檢測條件的優(yōu)化

RF功率、霧化氣流速等工作參數(shù)是ICP-MS較重要的參數(shù)，這些參數(shù)對信號強(qiáng)度以及對氧化物和氫氧化物的形成有較大的影響。本實驗采用PE公司提供的ICP-MS調(diào)諧溶液選定ICP-MS工作參數(shù)見表2。在最佳工作條件下得到的考察指標(biāo)是： Be為4625 cps/（ng/mL）， Mg為44827 cps/（ng/mL），In為50930 cps/（ng/mL），U為41670 cps/（ng/mL），CeO+/Ce+為1.9%，Ce++/Ce+為0.9%。所有考察指標(biāo)滿足ICP-MS性能要求，因此所選條件符合實驗要求。詳細(xì)ICP-MS工作參數(shù)見表2。

3.6 分析性能

SeCys2， Se， SeMet和Se的檢出限分別為0.088， 0.033， 0.30和0.17 ng/mL（n=6，3σ），線性范圍分別為0.28～200 ng/mL，0.10～200 ng/mL，0.65～200 ng/mL和0.50～200 ng/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）分別為3.2%， 2.5%， 3.5%和2.9%，相關(guān)系數(shù)R2>0.9995，用峰面積定量，其分析性能見表3。

3.7 提取劑的選擇及樣品分析

理想的預(yù)處理方法既能夠有選擇性地將各種含硒化合物從植物固態(tài)基體中高效提取出來，還要盡量避免在處理過程中對天然存在的各種含硒化合物造成損失，保證提取前后形態(tài)不會發(fā)生轉(zhuǎn)變。根據(jù)文獻(xiàn)報道，蛋白酶K和脂肪酶提取效果較好[23]，因此，本實驗采用蛋白酶K-脂肪酶作為提取劑。為了便于比較，本實驗也使用超純水作為提取劑，考察提取效率。本實驗利用超聲波輔助酶提取需時1.5 h，而文獻(xiàn)報道硒形態(tài)的提取時間為24 h[2]，因此本方法大大縮短了提取時間。分析結(jié)果見表4。

4 結(jié) 論

利用超聲波輔助蛋白酶K-脂肪酶進(jìn)行樣品前處理，建立了HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)測定牛蒡和三七樣品中SeCys2， Se， SeMet和Se的新方法。結(jié)果表明，本方法簡便，快捷，在8 min內(nèi)可將4種硒形態(tài)良好分離，方法重復(fù)性和精密度較好，可滿足植物中硒形態(tài)分析的需要，為植物中硒形態(tài)分析提供了一種可行的分析方法。

References

1 Escudero L A， Pacheco P H， Gasquez J A， Salonia J A. Food Chem.， 2015， 169： 73-79

2 Bryszewska M A， Mge A. J. Trace Elem. Med. Bio.， 2015， 29： 91-98

3 Berger MM， Shenkin A， Revelly J P， Roberts E， Cayeux M C， Baines M， Chioléro R L. Am. J. Clin. Nutr.， 2004， 80： 410-416

4 TANG Xin-Xin. Medicine World， 2004， 10： 19

唐新欣. 醫(yī)藥世界， 2004， 10： 19

5 Johnson C C， Fordyce F M， Rayman M P. Proc. Nutr. Soc.， 2010， 69： 119-132

6 Sun M， Liu G， Wu Q. Food Chem.， 2013， 141（1）： 66-71

7 Peng H， Zhang N， He M， Chen B， Hu B. Talanta， 2015， 131： 266-272

8 QIU Jian-Hua， WANGQiu-Quan， HUANGBen-Li. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2006， 26（9）： 1692-1701

邱建華， 王秋泉， 黃本立. 光譜學(xué)與光譜分析，2006， 26（9）： 1692-1701

9 Bauelos G S， Arroyo I， Pickering I J， Yang S I， Freeman J L. Food Chem.， 2015， 166： 603-608

10 XIAO Zhi-Ming， SONG Rong， JIA Zheng， LI Yang， FAN Xia. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（9）： 1314-1319

肖志明， 宋 榮， 賈 錚， 李 陽， 樊 霞. 分析化學(xué)， 2014， 42（9）： 1314-1319

11 Bueno M， Pannier F. Talanta， 2009， 78（3）： 759-763

12 Deng B， Shen C， Qin X， Liang S， Liang Y. J. Anal. At. Spectrom.， 2014， 29（10）： 1889-1896

13 Yan L， Deng B， Shen C， Long C， Deng Q， Tao C. J. Chromatogr. A， 2015， 1395： 173-179

14 Kocot K， Leardi R， Walczak B， Sitko R. Talanta， 2015， 134： 360-365

15 Ishiguro Y， Ueno K J， Onodera S C， Benkeblia N， Shiomi N. J. Food Compos. Anal.， 2011， 24（3）： 398-401

16 SU Shi-Lin， HUANG Ke， ZENG Xiao-Biao， MA Bo. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy， 2011， 22： 26-29

蘇仕林， 黃 珂， 曾小飚， 馬 博. 中國民族民間醫(yī)藥， 2011， 22： 26-29

17 Yan X， Lin L， Liao X， Zhang W. Chemosphere， 2012， 87（1）： 31-36

18 Chen T， Gong X， Chen H， Qu H. J. Sep. Sci.， 2015， 38（2）： 346-355

19 Li S， Qiao C， Chen Y， Zhao J， Cui X， Zhang Q， Liu X， Hu D. J. Chromatogr. A， 2013， 1313： 302-307

20 Gao F， Hu Y， Fang G， Yang G， Xu Z， Dou L， Chen Z， Fan G. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2014， 87： 241-260

21 WANG Yang， MENG Jun. Journal of Henan Normal University （Natural Science Edition）， 2011， 39（2）： 72-75

汪 洋， 孟 君. 河南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2011， 39（2）： 72-75

22 ZENG Chu-Jie， FENG Jin-Rong， DENG Bi-Yang. Journal of Analytical Science， 2006， 22（4）： 410-413

曾楚杰， 馮金榮， 鄧必陽. 分析科學(xué)學(xué)報， 2006， 22（4）： 410-413

23 Huerta V D， Reyes L H， Marchante-Gayo′n J M， Sa′nchez M L F， Sanz-Medel A. J. Anal. At. Spectrom.， 2003， 18（10）： 1243-1247