藥用植物DNA標(biāo)記輔助育種（一）：三七抗病品種選育研究

董林林+陳中堅(jiān)+王勇+魏富剛++張連娟+徐江++尉廣飛+王瑞+楊娟+劉偉林++李西文+余育啟+陳士林

[摘要]藥用植物DNA標(biāo)記輔助育種以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)，依據(jù)分子雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、高通量測(cè)序等技術(shù)，篩選與高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等表型關(guān)聯(lián)的DNA片段作為標(biāo)記，輔助新品種的選育。該研究采用DNA標(biāo)記輔助育種結(jié)合系統(tǒng)選育的技術(shù)，選育首個(gè)三七抗病新品種“苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)”。結(jié)果表明，基于RADSeq技術(shù)檢測(cè)出抗病品種包含12個(gè)特異SNP位點(diǎn)，經(jīng)驗(yàn)證record_519688位點(diǎn)與三七抗根腐病相關(guān)，包含此位點(diǎn)的基因片段可作為抗病品種的遺傳標(biāo)記輔助三七系統(tǒng)選育；與常規(guī)栽培種相比，抗病品種種苗根腐病及銹腐病的發(fā)病率分別下降836%，718%；二年生及三年生三七根腐病的發(fā)病率分別下降436%，629%。此外，依據(jù)與抗病關(guān)聯(lián)的SNP篩選三七潛在的抗病群體，該模式擴(kuò)大目標(biāo)群體并提高選育效率。藥用植物DNA標(biāo)記輔助育種將加快藥用植物新品種選育及推廣的進(jìn)程，保障中藥材產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]藥用植物； DNA標(biāo)記輔助育種； 三七； 連作障礙； 抗病品種；簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)； 單核苷酸多態(tài)性

藥用植物傳統(tǒng)育種主要依賴于植物的表型選擇，一個(gè)優(yōu)良品種的培育往往需要花費(fèi)幾年甚至十幾年的時(shí)間，如何提高育種效率，是育種的關(guān)鍵。基因型與環(huán)境間互作等多重因素會(huì)影響表型選擇效率，現(xiàn)代分子生物技術(shù)可加快藥用植物育種進(jìn)程，而且縮短育種周期，其中藥用植物DNA標(biāo)記輔助育種以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)，依據(jù)分子雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、高通量測(cè)序等技術(shù)，篩選與高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等表型相聯(lián)的DNA片段作為標(biāo)記，輔助新品種的選育，該技術(shù)可應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記定位、種質(zhì)資源遺傳多樣性、分子標(biāo)記輔助選擇等方面。隨著測(cè)序成本的降低，已經(jīng)陸續(xù)在中草藥開(kāi)展了轉(zhuǎn)錄組、全基因組測(cè)序，這些序列信息提供了大量的SSR和SNP等分子標(biāo)記，有利于高密度遺傳圖譜和物理圖譜的構(gòu)建，高密度圖譜加速了分子標(biāo)記與優(yōu)良性狀之間的連鎖研究，為發(fā)掘植物抗逆及參與有效成分合成途徑的新基因提供了許多線索和啟示，提高了選育的效率。陳士林等首次提出“Herbgenomics”的概念，該學(xué)科涉及中草藥結(jié)構(gòu)基因組、功能基因組、基因組輔助育種、中草藥蛋白質(zhì)組學(xué)、中草藥宏基因等內(nèi)容，并闡明本草基因組學(xué)將加速藥用植物優(yōu)良品種的選育并促進(jìn)綠色中藥農(nóng)業(yè)的科學(xué)化和規(guī)?；l(fā)展[12]。

本文以三七Panax notoginseng（Burk）FH Chen為例，介紹了藥用植物依據(jù)DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)，利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選與抗病相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，輔助三七抗病新品種的選育。三七是五加科人參屬植物，其性溫、味甘、微苦，具有散瘀止血、消腫定痛的功能，是片仔癀、云南白藥、復(fù)方三七口服液等常見(jiàn)中藥制劑的主要原料之一[3]。三七在心腦血管方面的獨(dú)特療效越來(lái)越被人們所認(rèn)可，其需求量逐年增加。為滿足日益增長(zhǎng)的需求，三七已經(jīng)開(kāi)展了系統(tǒng)的栽培技術(shù)研究，形成了較為規(guī)范的GAP技術(shù)體系[4]。然而三七為典型的生態(tài)脆弱型陰生植物，其分布區(qū)域較窄，連作障礙等問(wèn)題嚴(yán)重[56]。三七的人工栽培過(guò)程中病蟲(chóng)害比較嚴(yán)重，例如根結(jié)線蟲(chóng)病害顯著抑制了三七塊根的生長(zhǎng)，抑制率高達(dá)30%以上[7]；三七種植導(dǎo)致根際土壤微生物多樣性及組成的變化，隨著其種植年限增加根腐病致病菌Fusarum oxysporum的豐度顯著增加[8]。在病害防治過(guò)程中，高毒農(nóng)藥的投入破壞了三七田間生態(tài)系統(tǒng)，并造成三七農(nóng)殘及重金屬超標(biāo)。而三七不同栽培品種的抗病性存在顯著性差異，選育抗病性品種可獲得性狀優(yōu)良、抗逆性強(qiáng)的三七群體植株，有效的減少農(nóng)藥的使用量[911]。抗病新品種的選育是保障三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的策略之一。

系統(tǒng)選育是三七遺傳改良的方式之一，也是三七育種的重要手段。孫玉琴等對(duì)三七植株性狀差異進(jìn)行比較，結(jié)果表明三七植株的莖、塊根、休眠芽、花序、葉、果實(shí)存在明顯變異，為三七育種工作提供了依據(jù)[12]。通過(guò)對(duì)三七不同變異類(lèi)型中皂苷含量的比較分析，確定將紫根、復(fù)葉柄平展型、長(zhǎng)形根、寬葉4種類(lèi)型作為三七品種選育的目標(biāo)[13]。然而系統(tǒng)選育育種周期長(zhǎng)，受環(huán)境影響較大，在短時(shí)間內(nèi)選擇優(yōu)良性狀難度極大。采用DNA標(biāo)記輔助三七新品種的選育，該方法不僅準(zhǔn)確性高，而且縮短育種周期。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)抗病群體中的SNP位點(diǎn)，結(jié)合PCR技術(shù)篩選與三七抗病關(guān)聯(lián)的DNA片段，以此基因片段作為標(biāo)記輔助系統(tǒng)選育，并利用該關(guān)聯(lián)基因片段篩選潛在的抗病群體。該模式可加快新品種選育及推廣的進(jìn)程，為中藥材可持續(xù)發(fā)展提供思路及策略。

1材料與方法

11三七DNA標(biāo)記輔助新品種選育流程從文山周邊收集抗病單株并播種于云南文山三七科技示范園的試驗(yàn)田，該試驗(yàn)田為三七連作5年病圃。采集病圃中存活三七單株的種子，建立抗病群體；采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)（restrictionsite associated dna sequencing，RADSeq） 結(jié)合PCR技術(shù)篩選抗病群體的關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)，輔助三七新品種的系統(tǒng)選育；通過(guò)淘汰非目標(biāo)性狀，分離和純化抗病群體，選育三七抗病新品種，三七DNA標(biāo)記輔助選育流程見(jiàn)圖1。

12SNP位點(diǎn)分析采用高通量測(cè)序技術(shù)篩選抗病植株特異的SNP位點(diǎn)，闡述其特異性。分別采集30株抗病及感根腐病三七植株，采用HiSeq PE150測(cè)序，有效數(shù)據(jù)用于分析尋找SNP標(biāo)記。測(cè)序流程為：利用多種限制性內(nèi)切酶對(duì)該物種DNA分別進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇合適的酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；質(zhì)檢合格的DNA樣品，采用RAD建庫(kù)方式構(gòu)建長(zhǎng)度范圍在300～500 bp的pairend文庫(kù)；Illumina HiSeq PE150測(cè)序，有效數(shù)據(jù)用于分析尋找海量SNP標(biāo)記。

首先，對(duì)每個(gè)樣品中的RADtag進(jìn)行比對(duì)歸類(lèi)，按照每類(lèi)tag的深度信息由大到小進(jìn)行排序，得到每個(gè)個(gè)體的RADtag頻數(shù)表[14]。每個(gè)樣品的RADtag內(nèi)部進(jìn)行比對(duì)得到樣品內(nèi)部的雜合位點(diǎn)信息。不同樣品之間的RADtag進(jìn)行互相的比對(duì)，尋找個(gè)體之間單堿基差異信息[15]。綜合考慮每個(gè)個(gè)體RADtag的頻數(shù)表信息和比對(duì)信息，過(guò)濾掉可能來(lái)自重復(fù)區(qū)域的結(jié)果，從而得到高可信度的群體SNP標(biāo)記基因分型結(jié)果[16]。其中性狀關(guān)聯(lián)的算法參照GLM（General Linear Model）模型[17]。

13SNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)基于RADSeq技術(shù)獲得的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物篩選與三七抗病性關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。在人工病圃中分別采集60株三七抗病株及感根腐病植株，采用植物基因組提取試劑盒（天根，中國(guó)）提取三七葉片總DNA，DNA濃度及質(zhì)量經(jīng)檢驗(yàn)后，于-20 ℃?zhèn)溆?。隨機(jī)挑選SNP位點(diǎn)進(jìn)行開(kāi)發(fā)，以record_519688位點(diǎn)設(shè)計(jì)抗病及對(duì)照群體的通用引物，引物序列為F1：5′TCATTATTATTATCCTC3′，R1：5′GAGCTTAACTAGCCCAG3′。針對(duì)上述SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)抗病群體的特異引物，為提高SNP分析的特異性，在特異引物的3′端區(qū)域加入1個(gè)人工錯(cuò)配堿基，序列信息為Fk1：5′CATTATTATTATCCTCTTC3′，其中反向引物為R1。采用Pyrobest DNA Polymerase（貨號(hào) DR005A，日本TaKaRa公司）對(duì)供試DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系參照王瑞等[18]報(bào)道。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，產(chǎn)物送美吉公司進(jìn)行測(cè)序。將產(chǎn)物的序列信息與RADSeq獲得的序列進(jìn)行比對(duì)，確定與抗病相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。

14種苗等級(jí)分析將抗病群體的種子收集并播種后，分析種苗等級(jí)（n=186），其分類(lèi)等級(jí)依據(jù)見(jiàn)表1，同時(shí)以常規(guī)栽培品種（n=186）為對(duì)照，分析抗病品種的種苗質(zhì)量。表1三七種苗分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

Table 1The classification standard of notoginseng seedlings

分級(jí)單株重/g外觀形態(tài)一級(jí)≥25休眠芽肥壯，根系生長(zhǎng)良好，無(wú)病蟲(chóng)感染和機(jī)械損傷二級(jí)125～25休眠芽肥壯，根系生長(zhǎng)良好，無(wú)病蟲(chóng)感染和機(jī)械損傷三級(jí)075～125休眠芽生長(zhǎng)一般，根系生長(zhǎng)一般，無(wú)病蟲(chóng)感染和機(jī)械損傷

15病害調(diào)查隨機(jī)取30株種苗，分析其病害類(lèi)型及發(fā)病情況，以常規(guī)栽培種為對(duì)照，3次重復(fù)；調(diào)查二年生及三年生三七病害類(lèi)型及發(fā)病率（n=60），并以常規(guī)栽培種為對(duì)照，3次重復(fù)。

16利用與抗病關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)篩選潛在抗病群體采用與抗病性關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)（record_519688）的引物篩選留種基地的三七單株，保留含目標(biāo)位點(diǎn)的植株栽種到人工病圃中進(jìn)行系統(tǒng)選育，該模式擴(kuò)大三七目標(biāo)株系的繁育群體，提高育種效率并加快其新品種推廣的進(jìn)程。

17數(shù)據(jù)分析采用SPSS 160軟件，在005水平進(jìn)行顯著性方差分析。

2結(jié)果

21抗病植株的SNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)結(jié)合SNP數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)，使用tassel v52進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析，與感病群體相比，抗病群體具有12個(gè)差異的SNP位點(diǎn)（極顯著LOD>3）.

833%），而感病株無(wú)條帶，見(jiàn)圖2B。測(cè)序產(chǎn)物序列與RADSeq序列結(jié)果一致，感病株與抗病株的變異位點(diǎn)，見(jiàn)圖2C。結(jié)果表明，本試驗(yàn)中該SNP位點(diǎn)與三七抗病性相關(guān)，可作為三七抗病品種的DNA標(biāo)記。依據(jù)該位點(diǎn)對(duì)抗病群體后代進(jìn)行選擇，目標(biāo)株為667%，淘汰非目標(biāo)株輔助系統(tǒng)選育。

A通用引物PCR產(chǎn)物；B特異引物PCR產(chǎn)物；C感病株與抗病株的PCR產(chǎn)物序列信息；1～10及a～k抗病品種；11～12感病品種；MDNA Marker；CK感病株；RC抗病株。

22三七抗病品種的種苗等級(jí)基于三七種苗質(zhì)量及外部形態(tài)，制定了種苗的等級(jí)指標(biāo)見(jiàn)圖3A。休眠芽肥壯，根系生長(zhǎng)良好，無(wú)病蟲(chóng)感染和機(jī)械損傷，單株質(zhì)量大于等于25 g的種苗為一級(jí)，單株質(zhì)量125～25 g的種苗為二級(jí)；休眠芽及根系生長(zhǎng)一般，無(wú)病蟲(chóng)感染和機(jī)械損傷，單株質(zhì)量075～125 g的種苗為三級(jí)；單株質(zhì)量小于075 g為級(jí)下種苗。常規(guī)栽培種與抗病品種的一級(jí)種苗分別為400%，389%；二級(jí)種苗分別為156%，267%，三級(jí)種苗分別為111%，167%，級(jí)下種苗分別為333%，178%見(jiàn)圖3B。常規(guī)栽培種及抗病品種的一級(jí)和二級(jí)種苗總量分別為556%，656%。

23三七抗病品種的病害類(lèi)型及發(fā)病率調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該試驗(yàn)區(qū)內(nèi)常規(guī)栽培種及抗病品種種苗的主要病害類(lèi)型為根腐病及銹腐病，見(jiàn)圖4。常規(guī)栽培種及抗病品種種苗根腐病的發(fā)病率分別為67%，11%，而銹腐病發(fā)病率分別為156%，44%，抗病品種的根腐病及銹腐病發(fā)病率分別下降836%，718%。結(jié)果表明，抗病品種種苗對(duì)根腐病及銹腐病表現(xiàn)顯著的抗性。

調(diào)查結(jié)果表明，二年及三年生三七主要病害類(lèi)型為根腐病，見(jiàn)圖5A，B。常規(guī)栽培種及抗病品種的

二年生三七根腐病發(fā)病率分別為34%，19%，三年生三七該病的發(fā)病率為114%，42%，見(jiàn)圖5C。與對(duì)照相比，二年及三年生三七抗病品種的根腐病發(fā)病率顯著下降了436%，629%。結(jié)果表明，二年及三年生三七抗病品種對(duì)根腐病表現(xiàn)出顯著的抗病性。

24利用與抗病關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)篩選潛在抗病群體在3個(gè)留種基地進(jìn)行5 000份單株留種，利用抗病品種的SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選，見(jiàn)圖6。留種基地分別為平遠(yuǎn)鎮(zhèn)蓮花塘、硯山縣郊址村及文山縣平壩鎮(zhèn)。隨機(jī)抽取每個(gè)基地100份單株，采用通用引物（F1，R1）均檢測(cè)出清晰的目標(biāo)條帶（n=300），特異引物（Fk1，R1）檢測(cè)該300份三七樣品的56份樣品包含清晰的目標(biāo)條帶。結(jié)果表明，隨機(jī)檢測(cè)的自然群體中，包含目標(biāo)位點(diǎn)的單株為187%。后續(xù)試驗(yàn)中將目標(biāo)株通過(guò)人工病圃進(jìn)行系統(tǒng)選育，加快抗病品種的擴(kuò)繁。

4討論

本研究利用DNA標(biāo)記輔助系統(tǒng)選育技術(shù)獲得首個(gè)三七抗病新品種，選育純化后的抗病品種表現(xiàn)一致性、穩(wěn)定性及特異性，作為新品種進(jìn)行登記，該品種命名為“苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)” （云林園植新登第2016060號(hào)），對(duì)根腐病具有顯著的抗性。本研究采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，快速檢測(cè)抗病品種的SNP位點(diǎn)，依據(jù)抗病表型結(jié)合PCR技術(shù)篩選并確定與抗病相關(guān)的SNP位點(diǎn)，利用該位點(diǎn)篩選目標(biāo)株輔助系統(tǒng)選育，加快三七抗病新品種的選育。此外，利用該關(guān)聯(lián)位點(diǎn)輔助篩選留種基地潛在的抗病群體，之后將包含目標(biāo)位點(diǎn)的株系在人工病圃中進(jìn)行系統(tǒng)選育，進(jìn)一步篩選并純化抗病群體，該模式擴(kuò)大了目標(biāo)株系的繁育群體，提高育種效率并加快中藥材的選育及推廣，研究結(jié)果將陸續(xù)發(fā)表。

利用DNA序列的遺傳多態(tài)性可建立物種的遺傳標(biāo)記，加快藥用植物品種選育的進(jìn)程。檢測(cè)DNA

水平上的遺傳變異最精確的方法是直接測(cè)定DNA序列，因此可利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)測(cè)定的物種進(jìn)行分析比較，揭示生物體在單個(gè)核苷酸水平上的遺傳多態(tài)性，輔助系統(tǒng)選育。RADSeq技術(shù)是在二代測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)基于全基因組酶切位點(diǎn)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，技術(shù)流程簡(jiǎn)單，不受有無(wú)基因組的限制，即可獲得數(shù)以萬(wàn)計(jì)的多態(tài)性標(biāo)記，該方法快速鑒定高標(biāo)準(zhǔn)性的變異標(biāo)記（SNP），已廣泛應(yīng)用于分子育種，系統(tǒng)進(jìn)化，種質(zhì)資源鑒定等領(lǐng)域[19]。石璇等[20]以簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)獲得40 765個(gè)有效單核苷酸多態(tài)（SNP），并用這些SNP位點(diǎn)分析了8個(gè)種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。簡(jiǎn)化基因組測(cè)序能高效、低成本開(kāi)發(fā)出大量可用于群體遺傳分析的SNP標(biāo)記，為新品種的選育奠定基礎(chǔ)。本研究利用簡(jiǎn)化基因組技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，為三七分子輔助育種提供有效的分子標(biāo)記，并為無(wú)參考基因組中藥材分子輔助育種提供思路及策略。此外，前期工作中作者解析了三七塊莖的轉(zhuǎn)錄組，獲得30 852 單一序列，其中702% 的序列為注釋序列，篩選出11個(gè)參與三萜皂苷生物合成途徑的基因[21]；并依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆了三萜皂苷合成途徑中編碼關(guān)鍵酶的基因（PnSE1，PnSE2）[2223]。因此可依據(jù)三七轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜的研究，以參與或調(diào)控皂苷合成途徑的關(guān)鍵基因?yàn)槟繕?biāo)基因，輔助選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的三七新品種，進(jìn)而保障優(yōu)質(zhì)無(wú)公害的三七原料。

本研究首次對(duì)三七抗病品種進(jìn)行系統(tǒng)選育，利用連作5年地塊作為三七抗病品種篩選的病圃，選種明確并加快了選育的進(jìn)程。隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，連作障礙造成三七的損失巨大，已成為制約該地區(qū)三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[2425]。三七栽培中根腐病及銹腐病是其主要病害類(lèi)型，其中根腐病造成損失可達(dá)70%以上，甚至可導(dǎo)致毀園絕收[2627]。因此，抗根腐病三七新品種的選育是克服連作障礙的有效途徑之一。三七的單株根重、株高、莖粗等主要農(nóng)藝性狀與種苗質(zhì)量有明顯的相關(guān)性，表現(xiàn)出隨著種苗質(zhì)量等次的提高而增加的趨勢(shì)；且三七產(chǎn)量也隨著種苗等級(jí)的提高而提高[28]。本研究中抗病品種的一級(jí)及二級(jí)種苗總量高于常規(guī)栽培品種，抗病品種的種苗對(duì)根腐病及銹腐病表現(xiàn)較強(qiáng)的抗性，兩年生及三年生三七對(duì)根腐病表現(xiàn)顯著的抗性，該三七抗病新品種的大面積推廣將有效減少農(nóng)藥的使用量，減輕環(huán)境污染，降低農(nóng)殘對(duì)人體健康的危害，促進(jìn)并保障三七產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本文以三七為例系統(tǒng)闡述了藥用植物DNA標(biāo)記輔助育種，而抗病關(guān)聯(lián)DNA標(biāo)記的進(jìn)一步驗(yàn)證及潛在抗病群體篩選的研究將在后續(xù)文章中發(fā)表。

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2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1Januar