EPAS1基因SNPrs13419896多態(tài)性與HiHiLo低氧訓(xùn)練適應(yīng)效果關(guān)聯(lián)性研究

汪洪波　劉海平　毛穎穎

摘要：目的：選取EPAS1基因序列第1內(nèi)含子序列上rs13419896 G/A單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism， SNP）位點(diǎn)，研究其與HiHiLo低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)關(guān)聯(lián)性，探尋預(yù)測低氧訓(xùn)練效果的遺傳學(xué)標(biāo)記。方法：選取35名北方漢族健康受試者（平均年齡19.54±2.55歲，平均身高177.94±4.27 cm，平均體重68.07±5.579 kg）在模擬海拔2 500 m高度（低氧環(huán)境O2濃度為15.4%）進(jìn)行4 周高住-高練-低訓(xùn)（living high-exercise high-training low， HiHiLo）。采用關(guān)聯(lián)研究方法（Association-Study），運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)和基因測序?qū)嶒?yàn)技術(shù)分析EPAS1基因SNP rs13419896位點(diǎn)，研究該位點(diǎn) 與4周HiHiLo低氧訓(xùn)練后最大攝氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）、血紅蛋白（hemoglobin， Hb）、紅細(xì)胞數(shù)（red blood cell， RBC）等生理表型指標(biāo)變化的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果：1）EPAS1基因SNP rs13419896位點(diǎn)中GG、GA、AA基因型頻率分別為40%、51.43%和8.57%，符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律（x2=0.70，P=0.40）。2）4周低氧訓(xùn)練后，EPAS1基因SNPrs13419896基因型組間ΔVO2max、ΔrVO2max、ΔRBC及ΔHb均無顯著性差異。合并AA（AA基因型只有3例）與GA基因型統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，GA基因型受試者經(jīng)4周低氧訓(xùn)練后，VO2max絕對值、相對值增長幅度有好于GG基因型趨勢（76.17±245.31 ml/min vs -5.29±276.42 ml/min，P=0.09；1.22±3.37 ml/min·kg vs 0.13±4.18 ml/min·kg，P=0.09）。結(jié)論：平原人群4周 HiHiLo低氧訓(xùn)練后，EPAS1基因第1內(nèi)含子序列上SNP rs13419896多態(tài)位點(diǎn)與VO2max指標(biāo)變化可能存在著一定關(guān)聯(lián)性。

關(guān)鍵詞：內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)；域蛋白1；高住-高練-低訓(xùn)；單核苷酸多態(tài)性

中圖分類號：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：1006-2076（2015）01-0075-05

Abstract：Objective： This paper researched association between a single nucleotide polymorphisms rs13419896 （SNP rs13419896） in EPAS1 gene and physiological phenotype parameters response to hypoxia training. Methods： 35 healthy subjects completed 4 weeks living high-exercise high

低氧訓(xùn)練作為提高耐力項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力的手段一直是體育界的研究熱點(diǎn)。近十幾年來，低氧訓(xùn)練的有效性已被國內(nèi)外學(xué)者所認(rèn)同。但由于個(gè)體對低氧環(huán)境適應(yīng)的生理反應(yīng)差異性，會(huì)產(chǎn)生不同的低氧訓(xùn)練適應(yīng)效果[1]。Friedmann B等的研究證實(shí)，低氧訓(xùn)練后運(yùn)動(dòng)員紅細(xì)胞生成增多存在顯著的個(gè)體間差異[2]。大量研究表明，由于低氧訓(xùn)練適應(yīng)的生理反應(yīng)差異性，會(huì)導(dǎo)致個(gè)體低氧訓(xùn)練效果的差異性，且產(chǎn)生不同低氧訓(xùn)練效果差異性與遺傳學(xué)因素有著密切關(guān)聯(lián)[3-5]。SCIENCE雜志2010年報(bào)道，人類對低氧環(huán)境適應(yīng)與遺傳因素有著高度緊密關(guān)聯(lián)[6]。

內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1（endothelial PAS domain protein 1， EPAS1） 又稱低氧誘導(dǎo)因子-2α（hypoxia inducible factor-2α， HIF2α）。EPAS1在哺乳動(dòng)物各種組織的內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，是慢性缺氧過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[7-8]。低氧環(huán)境下，機(jī)體內(nèi)EPAS1蛋白的穩(wěn)定性、表達(dá)量明顯增加[9]，并通過識(shí)別靶基因，如促紅細(xì)胞生成素基因（erythropoietin， EPO）、血管內(nèi)皮生長因子基因（vascular endothelial growth factor， VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子受體基因（vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR）、乳酸脫氫酶基因-A（lactate dehydrogenase-A， LDHA）的核心序列5`-TACGTGCT-3`與低氧反應(yīng)元件（hypoxia reaction element， HRE）結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)細(xì)胞對缺氧應(yīng)答，在蛋白水平發(fā)揮其低氧適應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[10]。Yi 等在研究影響藏族與漢族人群低氧適應(yīng)遺傳因素差異中發(fā)現(xiàn)，眾多低氧反應(yīng)基因頻率都有差異，其中EPAS1 差別最大，并提示EPAS1 參與了藏族的高原低氧適應(yīng)過程[11]。同時(shí)，Beall 等采用Illumina Veracode 平臺(tái)以及610-Quad SNP 分型芯片分析藏族基因組SNP 變化情況發(fā)現(xiàn)，與藏族低氧適應(yīng)相關(guān)聯(lián)的EPAS1基因多態(tài)位點(diǎn)大多位于該基因的內(nèi)含子序列上，最遠(yuǎn)的SNP 位點(diǎn)位于基因下游235kb 處[12]。

鑒于此，本研究選取EPAS1基因第1內(nèi)含子序列上一重要單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（single nucleotide polymorphism， SNP）rs13419896[13]，研究其與4周高住-高訓(xùn)-低氧（Living high-exercise high-training low， HiHiLo）低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)變化的關(guān)聯(lián)性，探究影響低氧訓(xùn)練期間生理表型指標(biāo)敏感變化的遺傳學(xué)標(biāo)記。

1 研究方法

1.1 受試對象

本研究選取35名健康受試者（男性23名，女性12名），平均年齡19.54±2.55歲，平均身高177.94±4.27 cm，平均體重68.07±5.579 kg，均系中國北方漢族健康人群，無低氧暴露經(jīng)歷。

1.2 研究方案

所有受試者進(jìn)行4周高住-高訓(xùn)-低氧（Living high-exercise high-training low， HiHiLo）方案。具體包括：每天在氧濃度為15.4%常壓低氧環(huán)境（相當(dāng)于海拔2 500 m高度，低氧制造設(shè)備：Hypoxic Tent System TM”和“CAT Hatch TM”，美國）休息和睡眠，低氧暴露時(shí)間≥10 h/天（pm 8：00-am 6：00），白天在海拔50 m的常氧環(huán)境下生活、訓(xùn)練，并且在低氧實(shí)驗(yàn)期間，每周進(jìn)行3次、每次30分鐘的低氧環(huán)境下蹬功率自行車定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)（以基礎(chǔ)70%VO.2max強(qiáng)度為運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，功率自行車轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)/分）。

生理表型指標(biāo)測試：低氧實(shí)驗(yàn)前后分別進(jìn)行1次最大攝氧量（maximal oxygen uptake，VO.2max）、血象指標(biāo)（hematological parameters）、低氧定量負(fù)荷實(shí)驗(yàn)下血氧飽和度（oxygen saturation， SpO.2）的測試。VO.2max測試采用遞增負(fù)荷實(shí)驗(yàn)進(jìn)行（MedGraphicsVO.2000便攜式氣體代謝分析儀，美國），起始負(fù)荷60 W，功率車轉(zhuǎn)速為60 RPM，每3分鐘遞增30 W，直至力竭，VO.2max判定標(biāo)準(zhǔn)以心率超過180 b/min，呼吸商超過1.1，VO.2不再增加，受試者不能保持蹬車頻率等因素綜合確定；血象指標(biāo)測試要求受試者晨起后，空腹取靜脈血0.5 ml，采用BECKMAN STKS型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（日本）進(jìn)行測試分析，主要包括紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（Hb）等。

基因多態(tài)性分析：取靜脈血2 ml，2% EDTA抗凝，用promega公司全血總DNA提取專用試劑盒提取受試者DNA。EPAS1基因內(nèi)含子序列上SNP rs13419896多態(tài)性分析，依據(jù)人類EPAS1基因序列，用Primer 5. 0設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，上引物：5CTTCAGAGCAAATCAGAGGT 3，下引物：5CTCGCACCCAGATGACA 3。該位點(diǎn)應(yīng)用LifePro Thermal Cycler PCR儀（中國）進(jìn)行擴(kuò)增（20μLPCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，包括：10×PCR 2μL， 25 mM MgCl2 1.2 μL，dNTP各10 mM 1μL，上、下引物各10 pmol 0.5 μL，Taq酶2U，模板100 ng。各種藥品均為上海生工產(chǎn)品。擴(kuò)增方案是：（1）94℃預(yù)變性5 min；（2）94 °C變性40 s，50°C退火40 s，72°C延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；（3）72°C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物為460 bp 片段。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物由上海生工公司測序，進(jìn)行基因分型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計(jì)包（SPSS software for Windows 11.5 package）完成，所有數(shù)據(jù)以[AKX-]±SD表示。采用卡方檢驗(yàn)（chi-square test）驗(yàn)證受試者人群的基因型頻率是否符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律；低氧訓(xùn)練前后生理指標(biāo)數(shù)據(jù)先用K-S檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布，如符合進(jìn)行下面統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：低氧訓(xùn)練前基因型之間的生理指標(biāo)差異，采用單因素方差分析處理，基因型之間生理指標(biāo)的變化量采用協(xié)方差處理，以低氧訓(xùn)練前的初始值作為協(xié)變量進(jìn)行分析。顯著水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 EPAS1基因SNPrs13419896分析

EPAS1基因內(nèi)含子序列上SNPrs13419896位點(diǎn)分析結(jié)果見表1、圖1。SNPrs13419896位點(diǎn)中GG、GA、AA基因型頻率分別為40%、51.43%和8.57%，其中G、A等位基因頻率分別為65.71%、34.29%； SNPrs13419896經(jīng)卡方檢驗(yàn)（x2=0.70，P=0.40），符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律，表明所選人群具有群體代表性。

2.2 EPAS1基因SNPrs13419896與VO2max和血象指標(biāo)關(guān)聯(lián)結(jié)果

低氧訓(xùn)練前，EPAS1基因SNPrs13419896多態(tài)位點(diǎn)各基因型組間的生理表型指標(biāo)VO.2max、rVO.2max、RBC及Hb 經(jīng)單因素方差分析顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（表2）。

4周低氧訓(xùn)練后，EPAS1基因SNPrs13419896的各基因型組間與生理表型指標(biāo)變化量分析結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，SNPrs13419896基因型組間ΔVO.2max、ΔrVO.2max、ΔRBC及ΔHb均無顯著性差異。鑒于AA基因型只有3例，故將此基因型與其性質(zhì)相近GA基因型合并后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（見圖2），GA基因型受試者經(jīng)4周低氧訓(xùn)練后，VO2max絕對值、相對值增長幅度有好于GG基因型趨勢（76.17±245.31 ml/min vs -5.29±276.42 ml/min，P=0.09；1.22±3.37 ml/min·kg vs 0.13±4.18 ml/min·kg，P=0.09）。

3 討論

EPAS1是HIF家族一重要成員，對哺乳動(dòng)物低氧適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。人類EPAS1基因全長約120 kb，位于第2號染色體（2p16-21），包含15 個(gè)外顯子和14 個(gè)內(nèi)含子，cDNA 開放閱讀框2607 bp，編碼869個(gè)氨基酸，約為96.5 kD。本研究選取該基因序列第1內(nèi)含子上SNPrs13419896位點(diǎn)研究其與低氧訓(xùn)練過程中生理適應(yīng)效果關(guān)聯(lián)性。

從本研究對SNPrs13419896位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，GG、GA、AA基因型頻率分別為40%、51.43%和8.57%，即AA基因型較少（僅為3例），這與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中漢族人群基因型分布頻率基本一致。EPAS1基因SNPrs13419896的研究對于揭示人類適應(yīng)低氧環(huán)境的遺傳因素是非常重要的。已有研究證實(shí)，低氧適應(yīng)良好的夏爾巴和中國藏族人群，通過長期進(jìn)化，其EPAS1基因SNPrs13419896中A等位基因頻率分別為77.2%和79%，明顯高于歐洲人群（0.009%）、日本人（33.6%）和中國北方漢族人群（30.3%）[13]，柯金坤等研究顯示，對低氧環(huán)境適應(yīng)能力越好的藏族人群，SNPrs13419896位點(diǎn)中AA基因型、A等位基因頻率越高[14]。提示我們，是否具有SNPrs13419896位點(diǎn)A等位基因的平原人群進(jìn)行低氧訓(xùn)練后會(huì)產(chǎn)生較好的生理適應(yīng)效果呢，值得研究。

本研究通過平原人群4周低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)變化與EPAS1基因SNPrs13419896關(guān)聯(lián)研究并未發(fā)現(xiàn)SNPrs13419896各基因型試者低氧訓(xùn)練后VO.2max、RBC及Hb變化差異性，但通過合并性質(zhì)相近的AA基因型（AA基因型例數(shù)僅為3例）和GA基因型進(jìn)一步分析低氧訓(xùn)練后基因型組間生理表型指標(biāo)變化發(fā)現(xiàn)，GA基因型受試者低氧訓(xùn)練后，VO.2max絕對值、相對值與訓(xùn)練前相比分別提高2.2%和2.4%，而GG基因型受試者低氧訓(xùn)練后，VO.2max絕對值降低0.2%，相對值僅提高0.3%，GA基因型受試者低氧訓(xùn)練后，在VO.2max改善程度表現(xiàn)出優(yōu)于GG基因型的趨勢，但在Hb和RBC指標(biāo)變化上未發(fā)現(xiàn)基因型組間差異性。從EPAS1生物學(xué)功能分析，低氧環(huán)境下，EPAS1蛋白結(jié)構(gòu)上的氧依賴降解區(qū)（oxygen dependent degradation， ODD）不能被脯氨酸羥化酶識(shí)別并羥化，使其不能與VHL泛素2蛋白酶復(fù)合體結(jié)合，導(dǎo)致EPAS1經(jīng)蛋白水解酶而降解的途徑被抑制，從而使EPAS1蛋白穩(wěn)定增強(qiáng)、含量增加，充分發(fā)揮其誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)及其生物學(xué)功能[15]。EPAS1通過識(shí)別靶基因核心序列5-TACGTGCT-3與其HRE結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在EPAS1眾多靶基因中，其對VEGF及血管內(nèi)皮生長因子受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)尤為明顯。研究發(fā)現(xiàn)，與HIF-1α相比，EPAS1（HIF-2α）與VEGF的結(jié)合更容易，同時(shí)在表達(dá)豐富的血管內(nèi)皮中，與VEGF 的表達(dá)非常一致[16]，同時(shí)，通過誘導(dǎo)表達(dá)其他一系列與血管生成相關(guān)的基因，如VEGF受體（Flk-1 ）以及Dll4 和Notch 信號途徑，誘導(dǎo)血管生成，并發(fā)揮著對血管的穩(wěn)定和正常功能的作用[17]。當(dāng)平原人群進(jìn)入低氧環(huán)境中，EPAS1在骨骼肌中的表達(dá)量同樣明顯提高[18]。由此推測平原人進(jìn)行低氧訓(xùn)練過程中，SNPrs13419896位點(diǎn)的GA基因型或攜帶A等位基因受試者骨骼肌中EPAS1表達(dá)量較多，從而促進(jìn)骨骼肌毛細(xì)血管增生，增加了骨骼肌細(xì)胞氧的運(yùn)輸量，導(dǎo)致VO2max明顯改善。

此外，從EPAS1基因SNPrs13419896位點(diǎn)與紅細(xì)胞生成關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)[19]，高原紅細(xì)胞增多癥人群和高原健康人群間SNPrs13419896位點(diǎn)基因型、等位基因頻率無顯著性差異，提示，該位點(diǎn)可能與低氧環(huán)境適應(yīng)過程中血象指標(biāo)改善無明顯關(guān)聯(lián)，這與本研究結(jié)果是一致的。

4 結(jié)論

平原人群4周 HiHiLo低氧訓(xùn)練后，EPAS1基因第1內(nèi)含子序列上SNPrs13419896多態(tài)位點(diǎn)與VO.2max指標(biāo)變化可能存在著一定關(guān)聯(lián)性，表現(xiàn)為A等位基因攜帶者具有一定優(yōu)勢；該位點(diǎn)與血象指標(biāo)變化無關(guān)聯(lián)。

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