芝麻油對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

孫飛　賈宇峰　王振宇

【摘要】 目的：探討芝麻油對大腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其作用的機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)將雄性SD大鼠20只隨機(jī)分為兩組，對照組（C組，n=10），行大腦中動脈阻斷前5 d及術(shù)前1 h予生理鹽水4 mL/（kg·d）灌胃；芝麻油組（S組，n=10）于中動脈阻斷前5 d及術(shù)前1 h給予芝麻油

4 mL/（kg·d）灌胃。腦缺血90 min后恢復(fù)血流，于大腦中動脈阻斷后24 h處死大鼠，測各組腦組織中核轉(zhuǎn)錄因子 （Nuclear factor kappa B，NF-κB）P65表達(dá)陽性率（%）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的水平；同時檢測C組和S組的腦水腫指數(shù)、腦梗死的體積、神經(jīng)功能評分。結(jié)果：腦梗死S組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分明顯低于C組，S組大鼠缺血側(cè)的大腦水腫指數(shù)、腦梗死體積較C組明顯改善（P<0.01）：同時S組與C組比較，腦組織中核轉(zhuǎn)錄因子P65表達(dá)陽性率[（20.91±1.36）% vs （27.13±3.57）%]、MDA含量[（13.70±2.54）nmol/mg vs （3.96±0.68）nmoL/mg]均降低，SOD活性提高[（272.6±23.75）U/mg vs （189.5±16.53）U/mg]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：腦梗死期應(yīng)用芝麻油可減輕腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥因子釋放，從而對局灶性腦缺血后腦損傷具有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 芝麻油； 腦缺血； 再灌注損傷； 炎性反應(yīng)； 氧化應(yīng)激

Protective Effect of Sesame Oil Against Brain Ischemia Reperfusion Injury on Rats and Related Mechanism/SUN Fei，JIA Yu-feng，WANG Zhen-yu，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（02）：024-027

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of sesame oil on the focal brain ischemia reperfusion injury and the related mechanism.Method：Twenty Sprague Dawley male rats were randomly divided into two groups：the control group was given middle cerebral artery occlusion（MCAO） and saline pretreatment for 5 days as placebo（n=10）.Sesame oil group was given sesame oil via gastric gavage at a dose of 4 mL/（kg·d） for 7 days（n=10）.Middle cerebral artery was occluded by thread for 90 min，followed by reperfusion.The neurological outcomes including edema index，infarc size and neurological deficit scores were evaluated 24 h after MCAO.The levels of malonaldehyde（MDA），the expression change of NF-κB/P65 and activity of superoxide dismutase（SOD） in brain tissue were assessed according to the corresponding kits.Result：Compared with C group，sesame oil significantly reduced the edema index，infarc size and neurological deficit scores at 24 h after MCAO（P<0.01）.Also，sesame oil decreased the tissue levels of the expression change of NF-κB/P65 [（20.91±1.36）% vs （28.45±3.57）% ]， and MDA[（13.70±2.54）nmol/mg vs （3.96±0.68）nmol/mg，P<0.05]，and enhanced the activity of SOD[（272.6±23.75）U/mg vs （189.50±16.53）U/mg，P<0.05] compared to C group.Conclusion：Sesame oil can protect against focal brainischemia reperfusion injury partly through the mechanism of attenuating oxidative stress and inhibiting the proinflammatory response.

【Key words】 Sesame oil； Brain ischemia； Reperfusion injury； Inflammatory response； Oxidative stress

First-authors address：Xinhua Affiliated Hospital of Dalian University，Dalian 116021，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.007

缺血性腦卒中是老年人常見的腦血管病，腦卒中后致殘率高達(dá)78.4%，腦缺血后生成大量的自由基，并使膜脂質(zhì)過氧化使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)破壞和鈉泵功能障礙的結(jié)果，導(dǎo)致腦細(xì)胞膜及血腦屏障損害、腦組織水腫，大量自由基的生成是腦缺血損傷的重要因素[1]。從可行性和安全性考慮，目前正有很多研究去發(fā)現(xiàn)食物中的神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)[2-3]，芝麻油與其他食用油相比具有獨(dú)特的很強(qiáng)的抗氧化能力和抑制炎癥反應(yīng)性質(zhì)[4]，故筆者設(shè)想采用芝麻油預(yù)處理能否減輕腦組氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥因子合成及釋放，因而對局灶性腦缺血再灌注造成的腦損傷具有保護(hù)作用，并其作用機(jī)制進(jìn)行探討?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g（大連大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心）；焙煎的芝麻油（李錦記食品有限公司）；兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子-κB/p65抗體活性測試盒（提供商為美國Proteintech公司）、MDA測試盒、SOD測試盒（南京凱基生物工程有限公司）；氯化-2，3，4一三苯基四氮唑染色試劑（美國Sigma公司提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 健康雄陛SD大鼠20只，隨機(jī)分為兩組：（1）對照組（C組）10只，術(shù)前連續(xù)5 d及術(shù)前1 h予胃管注射生理鹽水，而后行大腦中動脈阻斷術(shù)；（2）芝麻油預(yù)處理組（S組）10只。大腦中動脈阻斷術(shù)前連續(xù)5 d及術(shù)前1 h予芝麻油4 mL/kg灌胃。兩組均予以同樣普通顆粒飼料飼養(yǎng)。

1.3 模型的制備 以戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，實(shí)驗(yàn)參照Zea-Longa線栓法來進(jìn)行制備大鼠大腦短暫性局灶的腦缺血再灌注動物模型，腦梗死對照組和芝麻油預(yù)處理組均采用線栓阻塞大腦中動脈2 h，模擬大鼠發(fā)生急性腦梗死。所以實(shí)驗(yàn)大鼠在手術(shù)中均采用白熾燈加熱，以保持體溫恒定，肛溫37 ℃左右。大鼠蘇醒后出現(xiàn)血管栓塞的同側(cè)Horner征，以及對側(cè)肢體運(yùn)動障礙即表明為模型成功，相反表明造模失敗，予以剔除。實(shí)驗(yàn)大鼠在造模成功缺血90 min后進(jìn)行再灌注，24 h后處死動物取相關(guān)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物處理 造模成功的大鼠缺血再灌24 h時對C組與S組大鼠行神經(jīng)功能評分，評分后處死，分別從兩個實(shí)驗(yàn)組中分別隨機(jī)取5只大鼠，麻醉后予以斷頭并取出取腦，去除低位腦干，去除嗅球和小腦，將大鼠腦組織自前向后連續(xù)切成約2 mm厚的冠狀切片，共5片。切片后置于2% 氯化-2，3，4一三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液中，于37 ℃ 避光染色30 min以后，再置4%多聚甲醛溶液中固定標(biāo)本并進(jìn)行攝片。標(biāo)本無病變部分被染成鮮亮的紅色，梗死區(qū)呈現(xiàn)出白色。

1.5 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 模型制作參照Longa等[5]大腦中動脈栓塞制造模型法對再灌注24 h后的大鼠進(jìn)行4分5級的神經(jīng)功能缺損評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：未觀察到大鼠的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；1分：大鼠手術(shù)對側(cè)前腿不能完全伸直；2分：大鼠爬行路徑中向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：爬行過程中向手術(shù)對側(cè)歪倒；4分：未觀察到大鼠有自發(fā)行走，伴或不伴意識障礙；5分：大鼠發(fā)生死亡。其中評分不足1分者或大于3分者均被剔除，并隨即補(bǔ)充；得分1～3分且未出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者為造模成功。

1.6 大鼠腦梗死檢測方法 造模成功的大鼠缺血再灌24 h后即刻從兩個實(shí)驗(yàn)組中分別隨機(jī)取5只大鼠，試驗(yàn)用鼠麻醉后快速斷頭后取出新鮮腦組織，將組織放入冰柜中凍10 min（-20 ℃），去掉嗅球、低位腦干和小腦，按順著冠狀方向?qū)⒋竽X從前至后的順序切成厚片（約2 mm厚），約5片，加入到濃度為2%TTC染色試劑中，在37 ℃避光恒溫箱里孵育并染色約20 min，使用4%多聚甲醛溶液將其固定，并在滿24 h后拍照。正常無病變的部分被染成鮮亮的紅色，梗死區(qū)呈現(xiàn)出白色。應(yīng)用Photoshop圖像分析軟件得到各個腦片梗死面積，用來計(jì)算梗死體積。大鼠腦梗死體積算法：測量每一腦片的梗死面積，乘以每片腦片厚度（約2 mm），近似得到腦梗死體積值，將此作為統(tǒng)計(jì)分析的參數(shù)。

1.7 ELISA檢測 缺血部位腦組織勻漿后，4 ℃離心（10 000 r/min）10 min，取上清液4 ℃超高速離心（10 000 r/min）2 h，NF-κB/P65 活性、MDA、SOD檢測具體操作參照各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠缺血側(cè)腦梗死體積及腦水腫指數(shù)比較 腦缺血再灌注24 h后，S組缺血側(cè)腦水腫指數(shù)（1.069±0.062），較C組的（1.361±0.091）顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.98，P<0.01）；S組缺血側(cè)腦梗死體積為（16.49±5.65）%，較C組的（28.17±8.17）%顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.67，P<0.01）。

2.2 大鼠神經(jīng)功能評分比較 腦缺血再灌注24 h后，S組神經(jīng)功能評分為（2.59±0.81）分，較C組的（4.18±0.69）分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.12，P<0.01）。

2.3 大鼠腦組織MDA、SOD、NF-κB/P65活性指標(biāo)比較 腦缺血再灌注24 h后，腦組織中NF-κB表達(dá)陽性率、MDA含量S組均明顯低于C組（P<0.05），S組SOD活性明顯高于C組（P<0.05），見表1。

3 討論

芝麻油富含抗氧化劑，它強(qiáng)大的抗氧化活性主要因?yàn)棣?生育酚和芝麻中木脂素類物質(zhì)（含量0.5%～1.0%）包括芝麻素、芝麻林素、芝麻酚所發(fā)揮的作用[5]，其中近來研究表明芝麻油中的芝麻酚對認(rèn)知功能障礙和抑郁癥的有益作用[6-7]，芝麻酚也可誘導(dǎo)抗氧化酶活性增加，并且自由基清除作用[8]。

腦梗死是一個復(fù)雜的缺血性級聯(lián)反應(yīng)過程，嚴(yán)重缺血造成腦組織能量很快耗竭，多種酶類被激活，引起磷脂分解和細(xì)胞骨架破壞，生成大量的氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷，還包括轉(zhuǎn)錄因子的合成及炎性反應(yīng)介質(zhì)的產(chǎn)生等參與[9-11]。有研究顯示，芝麻油中的芝麻素具有減弱紅藻氨酸導(dǎo)致癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠氧化應(yīng)激及降低死亡率[12]，以及通過多種機(jī)制而具有腦保護(hù)作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前5 d的芝麻油預(yù)處理可以改善圍術(shù)期腦缺血再灌注損傷后的腦梗死體積以及神經(jīng)功能。

本研究大鼠腦缺血再灌注腦梗死大鼠模型，急性腦缺血特別是再灌注時產(chǎn)生大量自由基、或者抗氧化能力不足、自由基清除酶功能降低，以及引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)損傷生物膜，氧自由基通過脂質(zhì)過氧化對細(xì)胞產(chǎn)生損害，是導(dǎo)致組織器官缺血再灌注腦組織細(xì)胞損害的關(guān)鍵因素之一[15-16]。MDA含量可以間接反映機(jī)體氧自由基的水平；SOD是細(xì)胞內(nèi)外最重要的調(diào)節(jié)機(jī)體氧自由基水平及脂質(zhì)過氧化的抗氧化酶，其活性代表了組織清除氧自由基的能力；目前普遍認(rèn)為，NF-κB在炎性反應(yīng)中具有最為廣泛而重要的作用，它幾乎涉及所有炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的調(diào)控， NF-κB 活化后可調(diào)控細(xì)胞因子和其他促炎介質(zhì)構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò) [17-18]。本研究結(jié)果提示采用芝麻油術(shù)前預(yù)處理可使大腦組織中的MDA含量明顯減少，SOD活性顯著升高，這說明其可有效降低腦組織缺血再灌注后的氧自由基水平。芝麻油術(shù)前預(yù)處理可使組織中NF-κB活性降低，提示其可以抑制了炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

很多研究實(shí)驗(yàn)表明改善局灶性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能缺損癥狀，產(chǎn)生一定的預(yù)防性保護(hù)作用[19-20]。本研究也顯示出通過芝麻油中的芝麻素、芝麻林素、芝麻酚的抗氧化能力和抑制炎癥反應(yīng)而對缺血再灌注大鼠大腦具有保護(hù)作用，這對臨床卒中治療或許是一種有用實(shí)踐，它或許是缺血卒中治療方案的一種有益補(bǔ)充，然而仍需更多的研究進(jìn)一步評估其臨床療效。

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（收稿日期：2016-09-08） （本文編輯：程旭然）