靶向端粒G-四鏈體手性釕配合物的抗腫瘤活性研究*

黃竹娟，蘇寧，吳紹鋒，林銳珊，郭建超，張小年

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州　510006）

靶向端粒G-四鏈體手性釕配合物的抗腫瘤活性研究*

黃竹娟，蘇寧，吳紹鋒，林銳珊，郭建超，張小年

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510006）

［目的］研究手性釕配合物Λ-［Ru（bpy）2（pyip）］2+（Λ-OMe）、Δ-［Ru（bpy）2（pyip）］2+（Δ-OMe）及其外消旋化合物［Ru（phen）2p-MOPIP］2+（dl-OMe）在體外實(shí)驗(yàn)中的抗腫瘤活性。［方法］3種配合物分別作用于人胃癌細(xì)胞株（MGC-803），人結(jié)腸癌細(xì)胞株（Colo205），人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7），人肺腺癌上皮細(xì)胞株（A549），人肝癌細(xì)胞株（HepG2），人舌鱗狀細(xì)胞癌株（SCC-9）48 h，以人胃黏膜上皮細(xì)胞株（GES-1）為正常對(duì)照細(xì)胞株，順鉑為陽(yáng)性對(duì)照藥物，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法篩選出其中半抑制濃度（IC50）最小的藥物和藥敏作用最好的腫瘤細(xì)胞。篩選出藥物和腫瘤細(xì)胞后，再用MTT法測(cè)定24、48、72 h相應(yīng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用；Hoechest33342染色法測(cè)定其對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。［結(jié)果］MTT法篩選出Λ-OMe對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖抑制作用最好，即（IC50）最小，在作用48 h的半數(shù)抑制濃度為：7.4 mg/L，且呈現(xiàn)很好的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。Hoechest33342染色顯示，在藥物處理48 h后，隨著藥物濃度增加，藥物促凋亡作用越明顯。［結(jié)論］手性釕配合物具有良好的抗腫瘤活性，其中以Λ-OMe抗腫瘤活性最好。

手性釕配合物Λ-OMe；人胃癌細(xì)胞株（MGC-803）；抗腫瘤活性

近年來(lái)腫瘤的發(fā)病率越來(lái)越高，中醫(yī)藥常以配合放化療以增效減毒、提高機(jī)體免疫力以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，或者用于治療缺乏有效治療手段的中晚期腫瘤等的輔助治療方式出現(xiàn)，而中醫(yī)藥單用治療腫瘤的規(guī)律還處在摸索與總結(jié)階段。自從1969年順鉑被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性以來(lái)，金屬配合物研究引發(fā)了人們的廣泛關(guān)注。目前國(guó)際上大多數(shù)研究報(bào)告認(rèn)為非鉑類(lèi)配合物中的釕配合物具有低毒性、易吸收并可很快被排泄，且具有易于被腫瘤組織吸收的特點(diǎn)［1-3］。因此，釕配合物已被公認(rèn)為是一類(lèi)活性強(qiáng)的新型抗腫瘤藥物，釕配合物的合成及其生物活性已經(jīng)成了國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)［4-7］。手性釕配合物與DNA相互作用的研究始于美國(guó)科學(xué)家Barton和瑞典科學(xué)家Norden［8-9］。Mei等［10］的研究進(jìn)一步證實(shí)手性釕（Ⅱ）金屬配合物與DNA的作用存在手性選擇性，并且Λ-異構(gòu)體與DNA的結(jié)合速率更快，在腫瘤的化學(xué)治療、DNA的結(jié)構(gòu)探針等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景［11］。而劉亞楠、Shi等［12-13］研究證實(shí)手性釕（Ⅱ）金屬配合物對(duì)端粒末端形成G-四鏈體具有高選擇性。這種在端粒末端形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)能夠抑制端粒的復(fù)制，阻斷端粒延伸，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖或促進(jìn)其凋亡的目的。Sun等［14］在化學(xué)分子水平的研究表明，甲氧基的手性釕配合物Δ/ Λ-［Ru（phen）2p-MOPIP］2+（Δ/Λ-OMe）能選擇性誘導(dǎo)人體端粒形成G4-DNA結(jié)構(gòu)并穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)，說(shuō)明了其在抗腫瘤活性中的潛在價(jià)值。且進(jìn)一步研究表明其與G-四鏈體的作用存在明顯的選擇性，左旋異構(gòu)體穩(wěn)定G-四鏈體能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于右旋異構(gòu)體，但此項(xiàng)研究未進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)?；谝陨涎芯?，本文從體外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證Δ/Λ-OMe及其消旋體dl-OMe的抗腫瘤活性以及凋亡誘導(dǎo)作用。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1腫瘤細(xì)胞、藥物來(lái)源，實(shí)驗(yàn)菌株人胃癌細(xì)胞株（MGC-803），人結(jié)腸癌細(xì)胞株（Colo205），人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7），人肺腺癌上皮細(xì)胞株（A549），人肝癌細(xì)胞株（HepG2），人舌鱗狀細(xì)胞癌株（SCC-9），人胃黏膜上皮細(xì)胞株（GES-1）均來(lái)源于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，順鉑（CDDP）（美國(guó)Sigma公司），手性釕配合物（Λ-OMe、Δ-OMe）及其消旋體dl-OMe來(lái)源于暨南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉杰教授。

圖1　手性釕配合物的結(jié)構(gòu)圖

1.2試劑和儀器RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司）；二甲基基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司）；Hoechst33342染色液（南京凱基生物技術(shù)有限公司）；680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BNA-3210型二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（日本Espec公司）；IX71-F22FL/PH型熒光倒置顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)（人胃癌細(xì)胞株（MGC-803），人結(jié)腸癌細(xì)胞株（Colo205），人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7），人肺腺癌上皮細(xì)胞株（A549），人肝癌細(xì)胞株（HepG2），人舌鱗狀細(xì)胞癌株（SCC-9））培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，人胃黏膜上皮細(xì)胞株（GES-1）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞在相對(duì)濕度為95%、37℃、5%CO2的環(huán)境中單層生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1MTT篩選敏感細(xì)胞株及藥物按MTT法［15］，即取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，取每孔3 000～5 000鋪于96孔板中，每孔100 μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待貼壁后，再分別加入不同濃度Λ-OMe，Δ-OMe，dl-OMe 100 μL（使培養(yǎng)液的藥物終濃度為2.5、5、10、20、40、80 mg/L），陰性對(duì)照為等體積培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照為順鉑，加樣組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)。在藥物處理48h后每孔加入20μL MTT（5 g/L），在37℃、5%CO2的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，加入DMSO每孔150 μL，振蕩10 min左右，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值A(chǔ)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，通過(guò)軟件計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.3.2.2MTT檢測(cè)Λ-OMe對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用按四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法，即取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，取3 000～5 000/孔鋪于96孔板中，每孔100 μl，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待貼壁后，再分別加入不同濃度受試樣品100 μL（使培養(yǎng)液的藥物終濃度為5、10、20 μg/mL），陰性對(duì)照為等體積培養(yǎng)液，加樣組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)。在藥物處理24、48、72h后收集細(xì)胞，每孔加入20μLMTT（5mg/mL），在37℃、5%CO2的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，加入DMSO每孔150 μL，振蕩10 min左右，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。腫瘤細(xì)胞抑制率（%）=（1-加藥組細(xì)胞A值/對(duì)照組細(xì)胞A值）×100%。

1.3.2.3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5 min或更長(zhǎng)時(shí)間，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌1遍。將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，使約為50%～80%。各濃度藥物處理細(xì)胞48 h，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL含4%多聚甲醛或70%乙醇的固定液，固定10 min或更長(zhǎng)時(shí)間（可4℃過(guò)夜）。去固定液，用PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體。洗滌時(shí)用搖床徹底清洗。加入1 mL 10 mg/L的Hoechst33342染色液，37℃染色15 min。去染色液，用PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，將貼有細(xì)胞的蓋玻片小心蓋在載玻片上，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)，可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核，根據(jù)細(xì)胞核形態(tài)是否聚縮高亮度來(lái)判斷細(xì)胞凋亡情況。

2　結(jié)果

2.1手性釕配合物的抗腫瘤活性

2.1.1MTT篩選結(jié)果采用MTT法評(píng)價(jià)手性釕配合物Λ-OMe、Δ-OMe、dl-OMe及CDDP的體外抗腫瘤活性，配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常人胃黏膜上皮細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50（mg/L）見(jiàn)表1所示，如最高測(cè)試濃度下抑制率仍小于50%的，IC50以＞100表示。從表1可以看出，兩個(gè)異構(gòu)體及外消旋體對(duì)所測(cè)試的腫瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，且兩個(gè)異構(gòu)體相比其外消旋體表現(xiàn)出了更為優(yōu)異的抗腫瘤活性，其中配合物Λ-OMe對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用明顯高于Δ-OMe、dl-OMe。這些結(jié)果顯示釕配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的選擇性，其中ΛOMe對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞的化學(xué)預(yù)防作用最佳。

表1　釕配合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用（±s）

表1　釕配合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用（±s）

IC50（mg/L）MGC-803 Colo205MCF-7A549HepG2SCC-9GES-1 Λ-OMe（1）7.4±1.8 35.3±4.3 21.8±3.1 33.4±3.6 42.3±3.9 33.2±2.7＞100 dl-OMe（2）47.1±4.8 74.2±8.3＞100＞100＞100＞100＞100 Δ-OMe（3）21.3±3.4 20.6±3.7 32.2±4.2 16.4±2.3＞10022.7±3.2 78.0±9.1 CDDP6.8±1.5 18.6±2.1 12.4±1.7 13.6±1.8 19.8±3.6 15.9±2.6 20.3±1.9化合物

2.1.2MTT檢測(cè)Λ-OMe對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用的結(jié)果進(jìn)一步用MTT檢測(cè)Λ-OMe對(duì)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其增殖抑制作用具有良好的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。其結(jié)果見(jiàn)表2和圖2，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在相同時(shí)間內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，抑制率增加；而同一藥物濃度，抑制率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

表2　釕配合物（Λ-OMe）對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用

圖2　不同濃度的Λ-OMe處理細(xì)胞24、48、72 h后的細(xì)胞抑制率

2.2Λ-OMe對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞形態(tài)的影響MGC803細(xì)胞經(jīng)不同濃度的配合物Λ處理48 h后，用倒置顯微鏡拍得形態(tài)學(xué)特點(diǎn)如圖3所示，其中A：0 μg/mL；B：5 μg/mL；C：10 μg/mL；D：20 μg/mL。根據(jù)藥物的不同濃度變化，MGC-803細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)都發(fā)生了顯著的變化。隨著濃度增加，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間間隙增寬，漂浮細(xì)胞增多，形態(tài)從圓形變長(zhǎng)梭形、三角形等不規(guī)則形狀。

圖3　光鏡下觀察Λ-OMe誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡

2.3Λ-OMe對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響Hoechest33342對(duì)于細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變也是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要方法。為了驗(yàn)證配合物Λ對(duì)胃癌MGC-803的凋亡誘導(dǎo)作用，采用Hoechest33342染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變，觀察結(jié)果表明，對(duì)照組胃癌MGC-803其細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散、均勻的熒光。加入配合物Λ后，胃癌MGC-803細(xì)胞的核染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，核內(nèi)的熒光亮度增加，并且有不規(guī)則的核裂解現(xiàn)象，這種現(xiàn)象隨著濃度的增加越來(lái)越明顯，見(jiàn)圖4。

3　討論

中醫(yī)藥對(duì)消化道腫瘤的治療，主要以扶正固本、清熱解毒、活血化瘀、消痰散結(jié)等方式，但現(xiàn)代臨床治療多配合以放化療或介入，且均有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)證明［16］，這些治療方法能提高機(jī)體免疫力，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在化療藥物的使用中，相對(duì)于其他金屬配合物而言，手性釕配合物還具有豐富的光譜性質(zhì)以及優(yōu)異的抗菌、抗腫瘤等生物活性［17-20］。在腫瘤的治療過(guò)程中，使用化療藥物無(wú)可避免要關(guān)注其毒副作用，手性釕配合物Λ/Δ-OMe與端粒DNA的相互作用并誘導(dǎo)其形成G-四鏈體使得該類(lèi)配合物在抗腫瘤方面具有了靶向性的潛在優(yōu)勢(shì)。筆者實(shí)驗(yàn)研究表明Λ-OMe具有良好的抗腫瘤活性，其對(duì)MGC-803細(xì)胞的增殖抑制能力在一定程度上強(qiáng)于順鉑，且對(duì)正常人胃黏膜上皮細(xì)胞的毒性很低，進(jìn)一步研究表明其對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖抑制作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)。鑒于手性釕配合物獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，為手性釕配合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化和生物活性的作用機(jī)制以及臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但是其具體的抗腫瘤機(jī)制還待進(jìn)一步研究。而且此類(lèi)手性釕配合物是否能與中醫(yī)藥配合使用也待進(jìn)一步研究。

圖4　熒光顯微鏡下觀察Λ-OMe誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡

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Anti-tumor activities research of chiral ruthenium to targeted telomeres G-quadruplex

HUANG Zhu-Juan，SU Ning，WU Shao-feng，LIN Rui-shan，GUO Jian-chao，ZHANG Xiao-nian（Guangzhou University of Traditional Chinese Medcine，Guangzhou 510006）

［Objective］Study on anti-tumor activities research of a paire of chiral ruthenium complexes Λ-［Ru（bpy）2（pyip）］2+（Λ-OMe）、Δ-［Ru（bpy）2（pyip）］2+（Δ-OMe）and their racemic mixture［Ru（phen）2p-MOPIP］2+（dl-OMe）in vitro experiments.［Methods］Three complexes were acting 48 hours on human gastric cancer cell line（MGC-803），human colon cancer cell lines（Colo205），human breast cancer cell line（MCF-7），human lung adenocarcinoma epithelial cell line（A549），human hepatocellular carcinoma cell line（HepG2），human tongue squamous cell carcinoma lines（SCC-9），human gastric epithelial cell line（GES-1）and cisplatin（CDDP）is a positive control.And then find the drug and tumor cells which half inhibitory concentration（IC50）was the smallest by MTT assay.Second，Detect the drug’s inhibitory effect on tumor cells after drug treatment 24、48、72 hours.Third，induced apoptosis of gastric cancer cells with Hoechest33342 staining.［Results］The best anti-tumor effects drug and cell is chiral ruthenium complexes Λ-［Ru（phen）2p-MOPIP］2+（Λ-OMe）and MGC-803 with MTT assay.The IC50is：7.4 μg/mL at 48 hours.The tested compound induces cell death in a dose and time dependent manner on MGC-803 cells；Hoechest33342 staining showed that with the increase of drug concentration，more obvious of apoptosis after 48 hours drug treatment.［Conclusion］Chiral ruthenium complexes have good anti-tumor activity and the Λ-OMe have significant anti-tumor activities.

chiral ruthenium complexes Λ-［Ru（phen）2p-MOPIP］2+（Λ-OMe）；Human gastric cancer cell lineMGC-803；anti-tumor activity

R730.7

A

1673-9043（2016）02-0109-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.10

廣州中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年學(xué)者科研基金項(xiàng)目。作者簡(jiǎn)介：黃竹娟（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治免疫相關(guān)性疾病。

張小年，E-mail：shezxn84@gzucm.edu.cn。

（2015-11-21）