葛根素對大鼠酒精性肝纖維化的干預(yù)作用以及對肝星狀細(xì)胞增殖活化的影響*

郝原青，郭曉雪，丁雅珊，王任遠(yuǎn)，蘇劍清，常淼花，杜靜，蘇金玲

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津　300193）

·學(xué)生園地·

葛根素對大鼠酒精性肝纖維化的干預(yù)作用以及對肝星狀細(xì)胞增殖活化的影響*

郝原青，郭曉雪，丁雅珊，王任遠(yuǎn)，蘇劍清，常淼花，杜靜，蘇金玲

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津300193）

［目的］研究葛根素對大鼠酒精性肝纖維化的干預(yù)作用以及對肝星狀細(xì)胞增殖活化的影響。［方法］Wistar雄性大鼠85只被隨機(jī)分為正常對照、模型、葛根素低、中、高劑量和陽性藥（易善復(fù)）對照6組。除正常對照組之外，其余給予大鼠灌胃白酒輔以玉米油、吡唑的混合食料制備酒精性肝纖維化模型，12周后采用蘇木精-伊紅（HE）、Masson染色觀察大鼠肝臟組織纖維化狀況。采用免疫組化法檢測大鼠肝組織內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)，根據(jù)PCNA的表達(dá)，計算肝細(xì)胞的增殖指數(shù)。［結(jié)果］模型組和各給藥組肝纖維化程度顯著高于正常對照組，各給藥組肝纖維化程度要輕于模型組，但低劑量組肝纖維化程度重于其他各給藥組。模型組肝細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于其他各組，各給藥組肝細(xì)胞增殖指數(shù)高于正常組。模型組α-SMA的表達(dá)高于其他各組，葛根素中、高劑量組和陽性藥組α-SMA的表達(dá)低于模型組，葛根素低劑量組α-SMA的表達(dá)與模型組沒有顯著性差異，但從數(shù)據(jù)趨勢上看低于模型組。［結(jié)論］葛根素能通過抑制肝星狀細(xì)胞的增殖活化從而達(dá)到防治酒精性肝纖維化的功效，以中、高劑量效果更明顯。

葛根素；酒精性肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；增殖細(xì)胞核抗原；α-平滑肌肌動蛋白

近年來，隨著中國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式的轉(zhuǎn)變，酗酒導(dǎo)致的酒精性肝?。ˋLD）的發(fā)病率迅猛增長，已經(jīng)成為中國繼病毒性肝炎之后常見導(dǎo)致肝臟疾病的又一大原因［1］，嚴(yán)重危害人類健康，對ALD的發(fā)病機(jī)制也日益成為研究的熱點(diǎn)［2-4］。酒精性肝病初期通常表現(xiàn)為脂肪肝、酒精性肝炎，尤以脂肪肝最為突出［5］，后期可發(fā)展為肝纖維化甚至肝硬化［6］。

肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝內(nèi)的貯脂細(xì)胞，正常情況下表現(xiàn)為富含脂滴的靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)乙醇進(jìn)入體內(nèi)后，乙醛作為乙醇的直接代謝產(chǎn)物，是激活HSC并導(dǎo)致酒精性肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵分子［7］。肝臟受損，HSC被活化，它的激活又是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)［8-9］。其中酒精性肝纖維化（AHF）是肝硬化的必經(jīng)階段，由于此階段的可逆狀態(tài)，因此，預(yù)防和抑制其發(fā)生和發(fā)展引起廣大醫(yī)學(xué)者的重視。

葛根是傳統(tǒng)解酒中藥，而葛根素是主要活性成分，有研究表明，其有防治酒精性肝病的功效［10-11］。本文進(jìn)一步探討其防治酒精性肝纖維化的作用，并研究對HSC增殖活化的影響，從而深入探討其發(fā)揮作用的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用和藥物開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物Wistar雄性大鼠85只，體質(zhì)量200g左右，SPF級，購自于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，許可證號：SCXK-（軍）2009-0003。

1.2主要實驗試劑與器材葛根素片（廣州僑光制藥有限公司），易善復(fù)［賽諾菲安萬特（北京）制藥有限公司］，62°牛欄山二鍋頭：北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司，吡唑：上海晶純試劑有限公司，小鼠抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體、Sp-9002、DAB顯色試劑盒、Masson三色染液均購自天津碧生源生物技術(shù)有限公司。

1.3實驗分組與模型制備大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組10只、其他各組各15只。除正常對照組外，其他各組大鼠每日早晚2次予以62°二鍋頭酒10 mL/（kg·d）、玉米油2 mL/（kg·d）、吡唑25 mg/（kg·d）混合物灌胃［12］，正常對照組則每日早晚予以相應(yīng)劑量的生理鹽水灌胃。葛根素低、中、高劑量組和陽性藥對照組早晚灌胃之間分別給予葛根素片溶液6.25、13.5、27 mg/（kg·d）和易善復(fù)0.12 g/（kg·d）溶液灌胃，正常對照組和模型組給予相應(yīng)劑量生理鹽水灌胃。6組大鼠均飼以全價營養(yǎng)顆粒飼料，自由進(jìn)食飲水。模型的制備時間為12周［13］。

1.4取材造模12周后，處死大鼠迅速剖腹取出肝臟，取各組大鼠肝右葉中間相同部分組織以4%甲醛溶液固定。

1.5指標(biāo)觀察和檢測

1.5.1HE和Masson染色觀察觀察各組大鼠肝纖維化的情況，可見膠原纖維沿竇周隙延伸并伴有纖維結(jié)締組織增生［14］。Masson染色把肝組織中的纖維染成綠色，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行分析，計算纖維所占面積的百分比。

1.5.2肝細(xì)胞增殖指數(shù)的觀察采用免疫組化法（SP法）進(jìn)行PCNA染色。PCNA陽性定位在肝細(xì)胞核，增殖細(xì)胞核呈棕黃色［15］。觀察不少于5個高倍視野（400倍），記數(shù)至少500個細(xì)胞。以增殖指數(shù)反映肝細(xì)胞增殖程度。

計算公式：增殖指數(shù)=PCNA陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%

1.5.2SP法檢測大鼠肝組織α-SMA的表達(dá)采用SP法進(jìn)行染色。結(jié)果判定：陽性部位定位于胞漿，主要集中于肝臟組織匯管區(qū)，以纖維間隔中最為明顯。于光鏡高倍視野下，每張切片隨機(jī)選取5個互不重疊視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行分析，測定每個視野的陽性細(xì)胞面積，取其平均值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)比較采用方差分析方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠狀態(tài)和死亡情況正常對照組大鼠一般情況良好，毛色光澤，精神活潑，至造模結(jié)束無死亡，模型組大鼠精神萎靡，嗜睡，體質(zhì)量增長緩慢，體毛蓬亂，個別有脫毛現(xiàn)象。各給藥組大鼠情況好于模型組。模型組、葛根素低、中、高劑量和陽性藥對照組因灌胃乙醇嗆入氣管、慢性乙醇中毒等原因分別死亡7、8、7、8、8只大鼠。

2.2HE染色觀察各組大鼠肝組織一般形態(tài)正常對照組大鼠肝組織中肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，中央靜脈周圍未見纖維組織增生，門管區(qū)未見增寬。模型組大鼠肝組織中可見點(diǎn)狀壞死，個別肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。中央靜脈周圍可見少量纖維組織增生，門管區(qū)稍增寬，可見少量纖維穿插進(jìn)入肝小葉。其他各給藥組情況好于模型組。

2.3Masson染色觀察各組大鼠肝組織纖維化程度模型組和各給藥組大鼠肝組織纖維化面積均大于正常對照組，各給藥組大鼠肝組織纖維化面積均小于模型組，但葛根素低劑量組要大于其他各給藥組，葛根素中、高劑量和陽性藥對照組大鼠肝組織纖維化面積沒有顯著差異，見表1。

2.4葛根素對酒精性肝纖維化大鼠肝組織增殖指數(shù)的影響模型組和各給藥組大鼠肝組織增殖指數(shù)高于正常對照組，各給藥組增殖指數(shù)低于模型組，但是葛根素中、高劑量和陽性藥對照組增殖指數(shù)低于葛根素低劑量組，見表1。

2.5葛根素對酒精性肝纖維化大鼠肝組織α-SMA表達(dá)的影響模型組和各給藥組大鼠肝組織α-SMA的表達(dá)高于正常對照組，葛根素中、高劑量組和陽性藥對照組α-SMA的表達(dá)低于模型組，葛根素低劑量組α-SMA的表達(dá)和模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但從數(shù)據(jù)趨勢上看低于模型組。見表1。

表1　葛根素對酒精性肝纖維化大鼠肝組織纖維化程度和α-SMA表達(dá)以及增殖指數(shù)的影響（±s）

表1　葛根素對酒精性肝纖維化大鼠肝組織纖維化程度和α-SMA表達(dá)以及增殖指數(shù)的影響（±s）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05。

組別n纖維化程度（%）α-SMA（area）增殖指數(shù)（%）正常對照組101.89±0.4636 476.90±7 770.434.87±1.78模型組87.65±0.83#121 539.00±50 298.46#39.46±5.97#葛根素低劑量組75.29±0.66#*99 522.43±5 197.82#31.68±6.18#*葛根素中劑量組83.71±0.60#*63 310.38±10 342.03##*23.25±7.38#*葛根素高劑量組73.36±0.46#*61 823.86±8 782.41##*24.75±3.55#*陽性藥對照組73.27±0.53#*60 633.43±6 994.33##*25.32±4.20#*

3　討論

近年來，隨著大量飲酒人員數(shù)量的增長，ALD已經(jīng)成為高發(fā)的肝病之一。ALD中后期可逐漸出現(xiàn)肝纖維化，如果及時治療，肝纖維化程度還可以減輕甚至逆轉(zhuǎn)，但如果逐漸加重，就會發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化，給患者帶來極大痛苦甚至威脅生命，因此，如何減輕甚至逆轉(zhuǎn)AHF是目前學(xué)者研究的一個重點(diǎn)［16］。目前，學(xué)者發(fā)現(xiàn)乙醇可通過不同的機(jī)制可以造成肝損傷，致使肝細(xì)胞變性甚至死亡，肝細(xì)胞從再生能力講屬于穩(wěn)定性細(xì)胞，生理狀態(tài)下不進(jìn)行再生，但當(dāng)一部分肝細(xì)胞死亡后，其周圍存活的肝細(xì)胞會展現(xiàn)強(qiáng)大的增殖能力，通過再生進(jìn)行修復(fù)，彌補(bǔ)一部分肝細(xì)胞死亡給肝造成的損傷，因此可以通過檢測肝細(xì)胞的增殖情況，間接揭示肝細(xì)胞的損傷程度。PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)［17］。本研究通過檢測大鼠肝細(xì)胞PCNA的表達(dá)，進(jìn)而計算肝細(xì)胞增殖指數(shù)，來反映乙醇對大鼠肝組織的破壞程度。大量肝組織破壞，會通過不同機(jī)制促進(jìn)間質(zhì)纖維組織增生，但不管何種機(jī)制，最終殊途同歸均是通過使HSC增殖活化，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生纖維組織，從而發(fā)生肝纖維化［18］。而α-SMA是HSC增殖活化的主要標(biāo)志蛋白，與HSC活化的程度及數(shù)量呈正相關(guān)［19-20］。

中醫(yī)沒有AHF這個病名，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為酒精性肝纖維化的辨證應(yīng)屬于中醫(yī)“酒癖”的范疇，《諸病源候論》曰：“酒性有毒，而復(fù)大熱，飲之過多，故毒熱氣滲溢經(jīng)絡(luò)，浸溢腑臟，而生諸病也。”認(rèn)為大量飲酒能夠助生濕熱之邪，長時間大劑量飲酒則使?jié)駸峋贫緝?nèi)蘊(yùn)，這是其主要發(fā)病病機(jī)。葛根為豆科植物野葛的根，其味辛、甘，性涼，入胃、脾二經(jīng)，可以解酒醒脾，《本草正義》稱葛根“最能開發(fā)脾胃清陽之氣”［21］，自古以來，中醫(yī)把葛根作為解酒毒的主要藥物之一。葛根素為葛根的主要活性成分之一，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)其對ALD有防治功效［10］，但對AHF的功效研究較少，具體發(fā)揮作用的機(jī)制更是不甚清楚。因此本實驗進(jìn)一步驗證葛根素是否具有防治AHF化的功效，并以HSC活化為切入點(diǎn)，通過揭示葛根素對HSC增殖活化是否具有影響，進(jìn)一步揭示其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組和各給藥組的大鼠肝纖維化程度顯著高于正常對照組，而各給藥組大鼠肝臟纖維化程度輕于模型組，低劑量組肝纖維化程度重于其他各給藥組，而模型組增殖指數(shù)顯著高于其他各組，葛根素中、高劑量和陽性藥對照組增殖指數(shù)低于葛根素低劑量組，綜上可以得出結(jié)論葛根素有防治酒精肝纖維化的功效，中、高劑量的效果要好于低劑量。實驗結(jié)果進(jìn)一步揭示模型組和其他各給藥組α-SMA的表達(dá)均高于正常對照組，葛根素中、高劑量組α-SMA的表達(dá)低于模型組，葛根素低劑量組α-SMA的表達(dá)與模型組相比雖然沒有顯著性差異，但從數(shù)據(jù)趨勢上仍然低于模型組。因此，葛根素可能通過抑制α-SMA的表達(dá)，從而抑制HSC的增殖活化，有效地延緩了AHF的發(fā)展進(jìn)程，且以中、高劑量效果更加明顯。而葛根素中、高劑量和陽性藥對照組大鼠肝組織纖維化面積及α-SMA的表達(dá)沒有顯著差異，與陽性藥防治效果相近，但由于葛根素的價格較低，毒副作用較少，亦可以考慮其作為治療酒精性肝纖維化的常用藥物，但其防治酒精性肝纖維化的深入機(jī)制還有待后續(xù)實驗進(jìn)一步研究。

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Effects of puerarin on proliferation activation of hepatic stellate cell in rats with alcoholic liver fibrosis

HAO Yuan-qing，GUO Xiao-xue，DING Ya-shan，WANG Ren-yuan，SU Jian-qing，
CHANG Miao-hua，DU Ging，SU Jin-ling
（School of Combination of TCM and WM，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To research the intervention effect of puerarin on alcoholic liver fibrosis in rats and the effects on the proliferation activation of hepatic stellate cell.［Methods］Eight-five male wistar rats were randomly divided into normal group，model，low，medium and high puerarin-dose and effective medicine group，a total of 6 groups.Except the normal group，alcoholic hepatic fibrosis model was produced in rats by giving gavage with alcohol supplemented by corn oil，pyrazol.After 12 weeks，the status of hepatic fibrosis was observed by HE and Masson stain，The expression of PCNA，α-SMA in liver tissue was detected by immunehistochemical method.The proliferation index of liver cell was calculated by the expression of PCNA.［Results］The degree of liver fibrosis of the model group and each medication administration group were significantly higher than the normal group，and the degree of liver fibrosis of each medication administration group was lighter than the model group.But the degree of liver fibrosis of the low-dose group was more serious than any other medication administration group.The proliferation index in the model group was higher than any other groups，and the proliferation index in normal group was lower than the other groups.The expression of α-SMA in the model group was higher than any other.The expression of α-SMA in the medium puerarin-dose group，the high puerarin-dose group and the effective medicine group were lower than the model group.There was no significant difference between the expression of α-SMA in the low puerarin-dose group and the model group.［Conclusion］The efficacy of peurarin in the prevention and treatment of alcoholic hepatic fibrosis are implemented by inhibiting the proliferation and activation of hepatic stellate cell in rats，and the effects of the medium and the high dose group are more significant.

puerarin；alcoholic liver fibrosis；hepatic stellate cell（HSC）；proliferating cell nuclear antigen（PCNA）；Alpha-smooth muscle actin（α-SMA）

R285.5

A

1673-9043（2016）02-0132-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.16

天津中醫(yī)藥大學(xué)第四屆大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項目項目（CXJJ2013C05）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項科研基金項目（20121210120012）。

郝原青（1991-），女，2010級中醫(yī)七年制本科在讀學(xué)生。

蘇金玲，E-mail：iamcloud@qq.com。

（2015-11-17）