正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化番瀉葉的提取工藝*

金施施，牛換云，丁輝，武婕，余河水，李薇，曹滿，宋新波，

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津　300193；2.天津中一制藥有限公司，天津　300193）

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化番瀉葉的提取工藝*

金施施1，牛換云1，丁輝1，武婕1，余河水1，李薇1，曹滿2，宋新波1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2.天津中一制藥有限公司，天津300193）

［目的］優(yōu)選番瀉葉中番瀉苷的最佳提取工藝。［方法］建立同時(shí)測定番瀉葉中番瀉苷A和番瀉苷B含量的方法，以番瀉苷A、B的含量為指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝。［結(jié)果］番瀉葉中番瀉苷的最佳提取工藝為10倍量0.5%的碳酸氫鈉60℃攪拌提取1 h。［結(jié)論］優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可靠，可為番瀉苷相關(guān)研究和實(shí)際生產(chǎn)提供依據(jù)。

番瀉葉；番瀉苷；番瀉苷A；番瀉苷B；提取工藝

番瀉葉是豆科植物狹葉番瀉（Cassia angustifolia Vahl）或尖葉番瀉（Cassia acutifolia Lelile）的干燥小葉。其性甘、苦、寒，歸大腸經(jīng)，具有瀉熱行滯、通便、利水之效。用于治療熱結(jié)積滯、便秘腹痛、水腫脹滿［1］。近年來，其被廣泛用于直腸檢查、術(shù)前清潔腸道以及各種便秘，是全世界應(yīng)用廣泛的導(dǎo)瀉劑。狹葉番瀉葉含番瀉苷A、B、C、D、蘆薈大黃素雙蒽醌苷、大黃酸葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷、大黃酸、蘆薈大黃素［2］。尖葉番瀉葉含番瀉苷A、B、C、蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷、大黃酸-1-葡萄糖苷、大黃酸-8-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸［3］。此外，番瀉葉中尚含有大黃酸-8-雙葡萄糖苷、大黃酸蒽醌-8-葡萄糖苷、初級苷［4］。藥理研究表明，番瀉葉致瀉的有效成分為蒽苷，其主要瀉下成分為番瀉苷A、B，番瀉苷A、B在腸道多種細(xì)菌的作用下，通過不同的代謝途徑，降解為大黃酸蒽酮，產(chǎn)生緩瀉作用。此外番瀉葉還具有止血、肌肉松馳與解痙以及抗胃黏膜損傷等作用［5］。番瀉葉可刺激盆腔神經(jīng)，并使盆腔器官充血，故月經(jīng)期及妊娠婦女慎用或忌用。長期、大劑量服用番瀉葉及其制劑能引起腸黏膜損傷及腸道神經(jīng)組織的損傷，有一定成癮性［6］及肝毒性［7］。傳統(tǒng)對番瀉葉的提取方法主要有：沸水煎煮、沸水浸泡、醇回流及超聲提取等，在番瀉葉提取過程中，溫度對番瀉苷有影響，可導(dǎo)致番瀉苷降解。Lainonen等［8］和張陽等［9］研究發(fā)現(xiàn)，番瀉苷在高溫下長時(shí)間加熱含量大量下降。陳丹丹等［10］研究番瀉苷B的穩(wěn)定性結(jié)果顯示，溫度對番瀉苷B的含量亦有影響。本實(shí)驗(yàn)選取碳酸氫鈉溶液作為提取溶劑，采用攪拌提取法，以番瀉苷A、B的含量為指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝，旨在篩選出簡單、高效、穩(wěn)定、可行的番瀉苷提取方法。

1　儀器與材料

LC-2010 AHT高效液相色譜儀（日本島津公司），色譜柱Megres C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司），磁力攪拌器（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司），分析天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司），JD-A-10L超純水儀（北京凈道科技有限公司）。

番瀉葉，購自安國藥材市場，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)張麗娟教授鑒定為豆科植物狹葉番瀉（Cassia angustifolia Vahl）的干燥小葉，番瀉苷A標(biāo)準(zhǔn)品（天津一方科技有限公司，批號20121096，純度大于98%）、番瀉苷B標(biāo)準(zhǔn)品（天津一方科技有限公司，批號20121100，純度大于98%），乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1番瀉苷A和番瀉苷B分析方法的建立

2.1.1色譜條件色譜柱：Megrace C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：乙腈（A）與0.7%磷酸-水（B）梯度洗脫，洗脫程序：0～30 min，A 15.5%。30～48 min，A15.5%～30%；48～68min，A30%～58%。流速：1mL/min。檢測波長：254 nm。柱溫：30℃。進(jìn)樣量：10 μL。在該色譜條件下，基線漂移較小，對照品番瀉苷A和番瀉苷B分離效果較好，色譜峰峰形好，供試樣品色譜峰分布均勻，且保留時(shí)間穩(wěn)定，見圖1。

圖1　混合對照品和供試品色譜圖

2.1.2對照品溶液的制備精密稱取番瀉苷A、番瀉苷B對照品適量，分別置于5mL容量瓶中，加0.1%碳酸氫鈉溶液至溶解完全，定容至刻度，搖勻，分別配制成濃度為223、209 mg/L的對照品溶液，備用。

2.1.3供試品溶液的制備精密稱取番瀉葉中粉2.00 g，置具塞錐形瓶中，精密加入0.1%碳酸氫鈉200 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系考察分別取番瀉苷A 223 mg/L、番瀉苷B 209 mg/L的對照品儲(chǔ)備液適量，加0.1%碳酸氫鈉稀釋成番瀉苷A：223～13.94 mg/L，番瀉苷B：209～13.1 mg/L的一系列對照品溶液。按2.1色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為：番瀉苷A為Y=1 186 373.32X-612.96（r=0.999 9），番瀉苷B為Y=1 148 336.11X-891.45（r=0.999 9）。表明番瀉苷A和番瀉苷B分別在13.9～223 mg/L、13.1～209 mg/L范圍內(nèi)線性良好。

2.2.2精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取番瀉苷A和番瀉苷B混合對照品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算得峰面積的RSD分別為0.199%、0.26%，表明儀器穩(wěn)定性良好。

2.2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取番瀉葉提取物6份，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備樣品，在2.1色譜條件下，測定6份樣品中番瀉苷A、B的含量，計(jì)算峰面積的RSD值分別為0.245%、0.267%。

2.2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液，分別于制備后2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣檢測，按2.1色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算峰面積的RSD分別為1.57%、1.66%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱定同一批番瀉葉樣品6份，每份0.5 g，分別精密加入番瀉苷A標(biāo)準(zhǔn)品36.3 μg，番瀉苷B標(biāo)品41.5 μg，按供試品溶液制備方法制備樣品，進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。所得平均回收率番瀉苷A為97.9%，RSD=1.08%；番瀉苷B為99.4%，RSD=1.73%，表明回收率符合要求。

2.3工藝優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇綜合文獻(xiàn)參考及適合生產(chǎn)應(yīng)用，選取乙醇、水、碳酸氫鈉3種溶劑進(jìn)行篩選，取3份番瀉葉中粉各1 g，精密稱定，分別加入50%乙醇、水、碳酸氫鈉各100 mL，稱定質(zhì)量，分別在相同條件用磁力攪器攪拌提取1 h，放冷，補(bǔ)加溶劑至原質(zhì)量，取上清液，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，進(jìn)樣，檢測。并計(jì)算番瀉苷A和番瀉苷B的含量。結(jié)果表明碳酸氫鈉提取效果最好，見表1。

表1　不同提取溶劑下的番瀉苷A+番瀉苷B提取量

2.3.2碳酸氫鈉最佳濃度的選擇精密稱取5份番瀉葉中粉各2 g，放入錐形瓶內(nèi)，分別加入濃度為0.05%、0.1%、0.5%、1%、3%的碳酸氫鈉各200 mL，稱定質(zhì)量，錐形瓶加蓋密封，相同條件下用磁力攪拌器攪拌提取1 h，放冷，補(bǔ)足質(zhì)量，取上清液，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，進(jìn)樣。測定總番瀉苷A、番瀉苷B的含量。結(jié)果表明0.5%碳酸氫鈉提取效果最好，見表2。

表2　不同碳酸氫鈉濃度下的番瀉苷A+番瀉苷B的提取量

2.3.3正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在確定了提取溶劑、碳酸氫鈉濃度的基礎(chǔ)上，對影響提取的其他主要因素：提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溶劑用量（C）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選，每次實(shí)驗(yàn)用番瀉葉中粉2 g，采用L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)［11-14］。因素水平設(shè)計(jì)見表3，結(jié)果見表4、表5。

表3　因素水平

表4　直觀分析表

表5　方差分析表

2.3.4結(jié)果由直觀分析表可以看出，各因素對番瀉苷A+番瀉苷B提取量的影響大小依次為：B＞A= C，提取時(shí)間對提取量影響最明顯，其次是提取溫度和提取溶劑用量，由于番瀉苷在高溫條件下不穩(wěn)定，所以提取溫度選為60℃，最后優(yōu)化提取工藝為10倍量0.5%的碳酸氫鈉60℃攪拌提取1 h，該提取工藝與傳統(tǒng)工藝相比，明顯提高了番瀉苷提取率。

2.3.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按照上述確定的工藝，精密稱取番瀉葉中粉200 g，放入燒杯中，加入10倍量的濃度為0.5%的碳酸氫鈉溶液，稱質(zhì)量，于60℃攪拌提取1 h，放冷，補(bǔ)足質(zhì)量，過濾，續(xù)濾液稀釋5倍，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，進(jìn)樣10 μL，計(jì)算番瀉苷A、番瀉苷B總含量為2.56 g。

3　討論

番瀉葉的主要瀉下成分為番瀉苷A、B、C、D［15］，番瀉苷A、B互為同分異構(gòu)體，番瀉苷C、D也互為同分異構(gòu)體。番瀉苷C經(jīng)口服后在腸內(nèi)細(xì)菌的作用下，降解產(chǎn)物有蘆薈大黃素蒽酮，蘆薈大黃素蒽酮在多種細(xì)胞株的AMES試驗(yàn)中有遺傳毒性作用［16］。因此本實(shí)驗(yàn)以番瀉苷A、B來計(jì)有效成分的含量，較以番瀉苷A或總番瀉苷計(jì)有效成分更為合理。

本實(shí)驗(yàn)嘗試了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-三氟乙酸-水、乙腈-三氟乙酸-水、甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水系統(tǒng)［17-18］，最終確定了利用乙腈-0.7%磷酸-水作為流動(dòng)相，此外，還嘗試了不同流速和不同的線性梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果顯示，乙腈-0.7%磷酸-水作為流動(dòng)相，進(jìn)行線性梯度洗脫，基線漂移較小，分離效果較好，色譜峰峰形好，分布均勻，且保留時(shí)間穩(wěn)定。

番瀉苷類化合物具有酚羥基和羧基，具有一定酸性，在堿水中成鹽而溶解，因此本實(shí)驗(yàn)選取碳酸氫鈉作為一種提取溶劑，有利于充分提取番瀉苷，且經(jīng)濟(jì)環(huán)保。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，在室溫條件下，pH 5.5～8.0時(shí)，番瀉苷較為穩(wěn)定，在pH 6.5時(shí)，番瀉苷最穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)利用0.5%的碳酸氫鈉60℃攪拌提取番瀉苷后，將溶液調(diào)回中性，50℃減壓濃縮，冰凍干燥成固體，有利于番瀉苷的保存。

溫度是影響番瀉苷A和番瀉苷B穩(wěn)定性的主要因素，在高溫受熱過程中，特別是在高濃度乙醇作為溶劑的條件下，番瀉苷A和番瀉苷B易發(fā)生降解，且番瀉苷B降解速率更大，番瀉苷A和番瀉苷B 60℃時(shí)在水中比較穩(wěn)定，所以損失率較?。?9］，文獻(xiàn)也多有提到番瀉苷類成分不穩(wěn)定［20］。因此本實(shí)驗(yàn)選取60℃作為提取的最高溫度。隨著中藥的現(xiàn)代化發(fā)展，各種番瀉葉制劑或者含其活性成分番瀉苷的制劑越來越多［21］。在制劑制備過程中，提取、分離、濃縮、干燥等步驟均應(yīng)注意穩(wěn)定性問題。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝后，進(jìn)行了3批放大提取，番瀉苷A和番瀉苷B的總提取率均達(dá)到預(yù)期，提取工藝穩(wěn)定可靠，可為番瀉苷相關(guān)研究和實(shí)際生產(chǎn)提供依據(jù)。

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The orthogonal experiment method to optimize the extraction process of senna

JIN Shi-shi1，NIU Huan-yun1，DING Hui1，WU Jie1，YU He-shui1，LI Wei1，CAO Man2，SONG Xin-bo1，2
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin Zhongyi Pharmaceutical Co.Ltd，Tianjin 300193，China）

［Objective］To select the best extraction process of sennoside from senna.［Methods］To establish the method for simultaneous determination of Sennoside A and Sennoside B，the method utilizes the content of Sennoside A and Sennoside B as a quality control.Based on the single factor，the best extraction process is selected by orthogonal test.［Results］The best process for extraction was 10 fold 0.5%sodium bicarbonate was used to extract Sennoside under 60℃for an hour.［Conclusion］The developed process is stable and reliable，and can be readily utilized for related research and actual production.

senna；sennoside；sennoside A；sennoside B；extraction process

R284.2

A

1673-9043（2016）02-0122-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.13

天津市組分中藥創(chuàng)制與分析服務(wù)平臺(tái)建設(shè)（12TX GCCX03800）。

金施施（1989-），女，碩士研究生，主要從事中藥化學(xué)成分分離與分析。

宋新波，E-mial：songxinbo@tjutcm.edu.cn。

（2015-11-14）