氫生理鹽水對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

王德仙，沈偉峰，栗玉龍，楊誠(chéng)，楊甲梅

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·論著 基礎(chǔ)研究·

氫生理鹽水對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

王德仙，沈偉峰，栗玉龍，楊誠(chéng)，楊甲梅

（第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院 特需治療科，上海 200433）

［摘 要］目的 觀察氫生理鹽水對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法 30只雄性BALB/C小鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、模型組和治療組，每組10只。治療組和模型組同時(shí)給予對(duì)乙酰氨基酚500 mg/kg腹腔內(nèi)注射誘發(fā)小鼠急性肝損傷，1 h后治療組每3 h腹腔注射氫生理鹽水6 mL/kg，模型組給予相同劑量的生理鹽水；對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)均腹腔注射相同劑量的生理鹽水。所有動(dòng)物在給予對(duì)乙酰氨基酚后24 h處死，測(cè)定血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）水平，以及肝組織勻漿丙二醛（MDA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量，TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡指數(shù)，觀察肝組織病理學(xué)改變和肝細(xì)胞壞死程度。結(jié)果 氫生理鹽水能顯著降低對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的血漿ALT［（816.3±300.2）U/L vs（3 933.0±1 112.0）U/L，P＜0.01］、AST［（403.8±83.6）U/L vs（2851.0±992.9）U/ L，P＜0.01］水平，顯著抑制炎癥因子TNF-α［（3.54±0.42）pg/mL vs（6.58±0.72）pg/mL，P＜0.01］、IL-6［（350.20±66.67）pg/mL vs （553.10±67.73）pg/mL，P＜0.05］的生成和MDA［（5.89±0.81）nmol/mL vs （8.26±0.60）nmol/mL，P＜0.05］的含量，并增加GSH［（362.8±37.9）μg/mL vs （230.8±53.1）μg/mL，P ＜0.05］儲(chǔ)備，明顯降低肝細(xì)胞凋亡指數(shù)［（5.67%±2.28%） vs （1.93%±0.82%），P＜0.01］，顯著改善肝組織病理學(xué)變化和降低肝細(xì)胞壞死的嚴(yán)重程度［（2.9±0.74） vs（1.7±0.82），P＜0.01］。結(jié)論 氫生理鹽水對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

［關(guān)鍵詞］氫生理鹽水；對(duì)乙酰氨基酚；肝損傷；保護(hù)作用；小鼠

對(duì)乙酰氨基酚是引起藥物性肝損傷最常見藥物，在美國(guó)、西歐，占成人急性肝損傷的病例的50%左右［1］；在我國(guó)，對(duì)乙酰氨基酚引起的肝損傷占所有藥物性肝損傷3.99%［2］。氫氣是世界上已知的密度最小的氣體，2007年Ohsawa等［3］證明吸入2%氫氣能明顯抑制大鼠腦部的局部缺血再灌注損傷或炎癥損傷，提示氫氣作為一種抗氧化劑在預(yù)防和治療的應(yīng)用潛力。我們將氫氣在高壓（0.4 MPa）下溶于生理鹽水中制成的濃度大于0.6 mmol/L氫生理鹽水（hydrogen-rich saline，HS），使用更加安全和方便。本研究通過檢測(cè)血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（asparate aminotransferase，AST）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）的水平，肝組織勻漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量，檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡指數(shù)，觀察肝組織病理學(xué)改變和肝細(xì)胞壞死程度，評(píng)估氫生理鹽水對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性BALB/C小鼠，體重在20～25 g，上海中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心培育，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)之前，所有動(dòng)物飼養(yǎng)在清潔，空氣新鮮的空調(diào)房間，定時(shí)打掃并通風(fēng)換氣，溫度在20 ℃左右，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜12 h∶12 h，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間自由攝取食物和水。

1.2 藥物和試劑

氫生理鹽水由第二軍醫(yī)大學(xué)海軍研究所提供，現(xiàn)用現(xiàn)配，其制備方法如文獻(xiàn)［4］所述；對(duì)乙酰氨基酚（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，純度≥98%，批號(hào)：DA9022-100 g）；MDA及GSH試劑盒（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為：ELS-4834、ELS-1745）；TNF-α及IL-6試劑盒（浙江聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：70-E-EK2822、70-EEK2062）。

1.3 儀器

電子天平（PL602-L，中國(guó)）；7600-020全自動(dòng)生化分析儀（HITACHI，日本）；酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）；勻漿器（PRO200，美國(guó)）；浸蠟包埋機(jī)（LEICA EG 1150E/C，德國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（LEICA CTR MIC，德國(guó)）。

1.4 動(dòng)物分組

將30只雄性BALB/C小鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、模型組和治療組，每組10只。模型組和治療組同時(shí)給予對(duì)乙酰氨基酚500 mg/kg腹腔內(nèi)注射誘發(fā)小鼠急性肝損傷，1 h后治療組每3 h腹腔注射氫生理鹽水6 mL/kg，模型組給予相同劑量的生理鹽水；對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)均腹腔注射相同劑量的生理鹽水。所有動(dòng)物均在腹腔內(nèi)注射對(duì)乙酰氨基酚24 h后，同時(shí)眼球取血用于測(cè)定血漿生化指標(biāo)，剖腹取出肝臟以制備肝組織勻漿用于相關(guān)檢查。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

俄羅斯北部地區(qū)是俄羅斯13個(gè)旅游區(qū)中面積最大的，人口最多的是伏爾加沿岸及中央旅游區(qū)，其中西部、北部、高加索、烏拉爾都是著名的旅游景區(qū)，開發(fā)最早的是亞速海-黑海之間的部分區(qū)域。俄羅斯南部主要是亞速海-黑海沿岸的主要旅游區(qū)，這里四季如春，屬于亞熱帶區(qū)域。俄羅斯人旅游易選擇海濱城市，每年來此度假旅游、療養(yǎng)過冬的游客達(dá)數(shù)百萬人。俄羅斯最大的海濱療養(yǎng)勝地索契，罪域俄羅斯黑海附近，有俄羅斯最大的溫泉，是俄羅斯旅游必去的地方。這里有豐富的海域資源，200公里的海岸線有50多價(jià)療養(yǎng)機(jī)構(gòu)，每天來這里療養(yǎng)的游客占總游客的80%。

1.5.1 血漿ALT、AST檢測(cè)：對(duì)乙酰氨基酚處理24 h后摘除小鼠眼球取血，靜置10 min，4 500 r/min離心10 min取血漿，立即用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血漿ALT和AST。

1.5.2 TNF-α和IL-6測(cè)定：檢測(cè)前取出貯存于-20 ℃冰箱中的血漿標(biāo)本，緩慢恢復(fù)至室溫，輕柔地混勻，常溫離心5 min取上清液50 μL，兩者均采用ELISA法，根據(jù)產(chǎn)品試劑盒提供的操作說明進(jìn)行操作，操作完成后30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處準(zhǔn)確讀取各孔的吸光值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對(duì)應(yīng)樣品的濃度。

1.5.3 MDA和GSH測(cè)定：檢測(cè)前準(zhǔn)確稱取肝組織重量，按重量體積比為1∶19加入生理鹽水制備成5%肝組織勻漿后，兩者均采用ELISA法，根據(jù)產(chǎn)品試劑盒提供的操作說明進(jìn)行操作，操作完成后立刻用標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處準(zhǔn)確讀取各孔的吸光值，再根據(jù)回歸方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)樣品的濃度。

1.5.4 肝組織TUNEL染色分析：制作的石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化后，根據(jù)制造商的提供的操作說明進(jìn)行操作，操作完成后在200倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)算肝細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.5.5 肝組織病理學(xué)檢查：取小鼠肝左外側(cè)葉，修剪后成大小約1 cm×1 cm（厚度不超過0.5 cm）置入4%福爾馬林溶液中，固定24 h，常規(guī)浸蠟包埋、切片、HE染色。光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化，肝細(xì)胞壞死程度分級(jí)參照文獻(xiàn)［5］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氫生理鹽水對(duì)各組小鼠實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血漿ALT、AST、TNF-α、IL-6水平均顯著升高（P＜0.01）；肝組織MDA水平明顯升高（P＜0.05）；肝組織GSH水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，治療組小鼠血漿ALT、AST、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）；血漿IL-6和肝組織MDA明顯降低（P＜0.05）；肝組織GSH水平明顯升高（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 氫生理鹽水對(duì)小鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

每個(gè)TUNEL染色切片在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察一個(gè)視野，并至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，棕色染色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞陽性率即為凋亡指數(shù)，如圖1所示。肝細(xì)胞凋亡指數(shù)在模型組和治療組分別為［（5.67%±2.28%）vs（1.93%±0.82%），P＜0.01］。

表1　各組實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較

2.3 氫生理鹽水對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)和肝細(xì)胞壞死程度的影響

2.3.1 氫生理鹽水顯著改善肝組織病理學(xué)變化：每個(gè)HE染色切片在100倍和400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。光鏡下顯示對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞索走向清晰，圍繞中央靜脈呈輻射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無病理學(xué)改變（圖2 NS）；而對(duì)乙酰氨基酚使小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡和灶性壞死，肝小葉竇間隙明顯擴(kuò)大，肝細(xì)胞索走向紊亂，圍繞肝中央靜脈周圍可見大片壞死，細(xì)胞核固縮、破碎、部分溶解（圖2 AP+NS）；氫生理鹽水治療后，小鼠肝細(xì)胞變性、壞死明顯減輕，肝組織病變改善明顯（圖2 AP+HS）。

2.3.2 氫生理鹽水顯著降低肝細(xì)胞壞死程度：根據(jù)肝細(xì)胞壞死面積，將肝細(xì)胞壞死程度被分為0～4級(jí)［5］，即：0級(jí)，沒肝細(xì)胞壞死面積小于5%；1級(jí)，鏡下肝細(xì)胞壞死面積達(dá)到5%～30%；2級(jí)，鏡下肝細(xì)胞壞死面積達(dá)到30%～50%；3級(jí)，鏡下肝細(xì)胞壞死面積達(dá)到50%～70%；4級(jí)，鏡下肝細(xì)胞壞死面積超過70%。每個(gè)切片用100倍下隨機(jī)觀察一個(gè)視野，模型組和治療組肝細(xì)胞壞死程度分別為［（2.9±0.74）vs（1.7± 0.82），P＜0.01］。

NS：對(duì)照組；AP+NS：模型組；AP+HS：治療組；黑箭頭所示凋亡細(xì)胞，CV示中央靜脈圖1 各組小鼠肝臟TUNEL染色結(jié)果

3 討論

對(duì)乙酰氨基酚是世界上使用最廣泛的非處方類解熱鎮(zhèn)痛藥，主要用于普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱，也可用于緩解輕至中度疼痛如頭痛、關(guān)節(jié)痛、肌肉痛等。對(duì)乙酰氨基酚是典型的劑量依賴性肝損傷藥物，在大劑量長(zhǎng)期應(yīng)用或某些特殊情況下（如過量飲酒、饑餓、免疫力低下等）過量服用則能引起肝細(xì)胞壞死，甚至引起急性肝功能衰竭。在治療劑量（10～15 mg/kg）時(shí)，對(duì)90%以上乙酰氨基酚與硫酸鹽和葡萄糖酸結(jié)合而排出，僅小部分通過單加氧酶系的氧化反應(yīng)而生成中間代謝產(chǎn)物N-乙酰-對(duì)-苯醌亞胺（NAPQI），NAPQI再與GSH結(jié)合生成無毒的硫醇尿酸而排出［6］；當(dāng)超過治療劑量時(shí)，硫酸鹽和葡萄糖醛酸途徑被完全飽和，氧化生成的NAPQI增加，致細(xì)胞內(nèi)的GSH儲(chǔ)備減少，使大量的NAPQI聚積［7］。生成過多的NAPQI可與細(xì)胞內(nèi)大分子如核酸、蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，干擾線粒體和細(xì)胞核的功能，生成大量的氧自由基，導(dǎo)致體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的死亡［8］。實(shí)驗(yàn)研究證明氫生理鹽水不僅在腦部缺血再灌注損傷有保護(hù)作用［9］，而且在心［10］、肝［11］、腎［12］等缺血再灌注損傷及炎癥損傷同樣具有治療作用。

ALT和AST是肝內(nèi)的主要功能酶，是從損傷或壞死的肝細(xì)胞漿或線粒體中釋放到血液中，是反映肝細(xì)胞損傷的靈敏指標(biāo)［13］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在模型組中血漿的ALT和AST的水平顯著升高，鏡下肝細(xì)胞壞死面積均在30%以上，證明了肝功能損害嚴(yán)重；用氫生理鹽水治療后，血漿的ALT和AST的水平顯著下降，鏡下肝細(xì)胞壞死面積顯著降低，證明了氫生理鹽水能降低對(duì)乙酰氨基酚造成的肝細(xì)胞壞死面積，能保護(hù)肝臟功能。

TNF-α主要由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌，它的濃度與機(jī)體的炎癥嚴(yán)重程度正相關(guān)，是炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵［14］；IL-6是人類最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的主要成分，在炎癥反應(yīng)中起重要作用［15］。我們檢測(cè)血清中的TNF-α、IL-6的含量達(dá)到判別病情嚴(yán)重程度和判斷藥物的治療效果。在模型組中，血漿的TNF-α、IL-6的水平顯著升高，證明對(duì)乙酰氨基酚可引起肝臟炎癥反應(yīng)；而治療組中，TNF-α、IL-6的水平顯著降低，證明了氫生理鹽水能抑制肝臟炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝組織免受對(duì)乙酰氨基酚的炎癥性損傷。

MDA來源于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，MDA含量可間接反映機(jī)體抗氧化能力及清除氧化產(chǎn)物的能力［16］。GSH是體內(nèi)的內(nèi)源性還原劑，能與多種外源性、內(nèi)源性有毒物質(zhì)結(jié)合生成減毒物質(zhì)，避免各種有害刺激，如氧化應(yīng)激、炎癥等對(duì)細(xì)胞造成的損害［17-18］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：氫生理鹽水不僅能顯著降低小鼠血漿肝組織MDA的含量，而且能減輕肝組織GSH的消耗并增加其儲(chǔ)備，證明了氫生理鹽水不僅能抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而且能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕對(duì)乙酰氨基酚對(duì)肝臟的氧化反應(yīng)性損傷。

總之，氫生理鹽水作為一種抗氧化劑，治療對(duì)所致小鼠的急性肝損傷，能明顯的改善肝功能、抑制肝臟炎癥反應(yīng)、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)程度、減輕肝組織GSH的消耗并增加其儲(chǔ)備、降低肝細(xì)胞凋亡指數(shù)、明顯改善肝組織病理學(xué)變化及減輕肝細(xì)胞壞死程度，對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致小鼠的急性肝損傷具有保護(hù)作用。

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（本文編輯：張海燕，魯翠濤）

［中圖分類號(hào)］R575.3

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

Doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.04.006

［收稿日期］2016-01-08

［第一作者簡(jiǎn)介］王德仙（1982-），男，安徽蕪湖人，住院醫(yī)師，碩士。

［通訊作者簡(jiǎn)介］楊甲梅，教授，E-mail：jmyang@smmu.edu.cn。μg/mL vs （230.8±53.1） μg/mL， P＜0.05］. In addition， HS could markedly decrease the hepatocellular apoptosis index ［（5.67±2.28）% vs （1.93±0.82）%， P＜0.01］， ameliorate the liver histopathology and diminish the degree of hepatocyte necrosis ［（2.9±0.74） vs （1.7±0.82）， P＜0.01］. Conclusion The hydrogen-rich saline has a protective role against acetaminophen-induced liver injury in mice.

Protective effect of hydrogen-rich saline against acetaminophen-induced liver injury in mice

WANG De-xian， SHEN Wei-feng， LI Yu-long， YANG Cheng， YANG Jia-mei. Department of Special Treatment，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200438， China

Abstractobjective To investigate the protective effect of hydrogen-rich saline （HS） against acetaminophen-induced liver injury in mice. Methods Thirty BALB/C male mice were randomly divided into three groups: control group， model group， and treatment group， each group contained 10 mice. In the treatment group and model group， liver injury was induced by acetaminophen （i.p. 500 mg/kg）. One hour after the administration of acetaminophen， HS （6 mL/kg） or an equivalent volume of NS was given intraperitoneally every 3 h. The control group was injected with the same dose of normal saline at the corresponding time point. All animals were killed at 24 h after the administration of acetaminophen， the levels of plasma alanine aminotransferase （ALT）， asparate aminotransferase （AST）， tumor necrosis factor alpha （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， the contents of malondialdehyde （MDA） and glutathione （GSH） in the liver tissue were measured； the hepatocellular apoptosis index was detected by TUNEL method； the pathological change of liver tissue and the necrosis area of hepatic cell were observed.

Results In the acetaminophen-induced liver injury in mice， HS could significantly reduce the levels of plasma ALT ［（816.3±300.2） U/L vs （3 933.0±1 112.0） U/L， P＜0.01］ and AST ［（403.8±83.6） U/L vs （2 851.0±992.9） U/ L， P＜0.01］， inhibit the generation of inflammatory factors TNF-α ［（3.54±0.42） pg/mL vs （6.58±0.72） pg/mL，P＜0.01］ and IL-6 ［（350.20±66.67） pg/mL vs （553.10±67.73） pg/mL， P＜0.05］， and decrease the content of the MDA ［（5.89±0.81） nmol/mL vs （8.26±0.60） nmol/mL， P＜0.05］ and increase the reservation of GSH ［（362.8±37.9）

Key wordshydrogen-rich saline； acetaminophen； liver injury； protective effect； mice