2014年福建省南平市登革病毒E基因序列分析

王金章，陳宏彬，張擁軍，翁育偉，吳春敏，鄭奎城，嚴(yán)延生

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2014年福建省南平市登革病毒E基因序列分析

王金章1，陳宏彬1，張擁軍1，翁育偉1，吳春敏2，鄭奎城1，嚴(yán)延生1

1.福建省疾病預(yù)防控制中心，福建省人獸共患病研究重點實驗室，福州350001；2.南平市疾病預(yù)防控制中心，南平353000

摘要：目的測定2014年南平市登革暴發(fā)相關(guān)登革病毒E基因序列，探討其輸入來源及基因型別。方法將患者急性期血清接種C6/36細(xì)胞，分離登革病毒，通過RT-PCR進行血清型鑒定，擴增全長E基因，測定序列并繪制系統(tǒng)進化樹。結(jié)果共分離到4株DENV-1，2株DENV-2，擴增并測序獲得E基因全長序列，4株南平地區(qū)DENV-1型分離株之間同源性為100%，與D13459(Donguang)分離株同源性也高達99.7%；2株DENV-2型分離株與DENV2/CN/GZ05/2014分離株的同源性均達100%。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，4株DENV-1病毒株與來自廣東及印度的毒株處于同一進化樹分支，均為基因Ⅴ型；2株DENV-2病毒株與來自廣東及新加坡的毒株處于同一進化樹分支，均為基因Ⅳ型。結(jié)論福建省南平市本次登革熱本地病例暴發(fā)可能是由廣東或者東南亞地區(qū)的登革熱輸入病例引起的。

關(guān)鍵詞：登革病毒；E基因；序列分析；系統(tǒng)進化樹

Supported by the National Mega-Project of Science & Technology for Infectious Diseases in China.(No.2012ZA10004-210) and the Innovative Projects of Medical Sciences in Fujian Province(No.2015-CXB-13)

登革病毒(dengue virus, DENV)是一種通過伊蚊傳播的蟲媒病毒, 主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，自然界存在4種血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)，可引起登革熱(dengue fever，DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome, DSS)等急性傳染病。近幾十年登革熱發(fā)病率大幅度上升，資料顯示，全世界約3.9億的人口面臨感染登革熱及登革出血熱的危險[1-2]，美洲、東南亞和非洲是登革熱重災(zāi)區(qū)。

DENV是單股正鏈RNA病毒，E基因編碼病毒的主要包膜蛋白，在病毒與宿主細(xì)胞相互作用過程中發(fā)揮著重要的功能，常用于病毒基因進化分析研究[3]。自2005年至2014年9月1日，南平市僅在2008和2009年各有1例輸入性登革熱病例報道，并無本地病例的出現(xiàn)，2014年9月及10月首次出現(xiàn)一起較大規(guī)模的登革熱本地病例暴發(fā)，共報告有本地病例122例。本文對2014年9月福建省南平市首次發(fā)現(xiàn)的本地暴發(fā)病例中分離獲得DENV1型4株、DENV2型2株病毒株，通過RT-PCR擴增毒株的E基因并測定其基因序列，與GenBank中已經(jīng)公布的序列進行比對和進化分析，以期了解其序列特征與可能的傳播來源。

1材料與方法

1.1試劑及標(biāo)本來源

1.1.1試劑QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自QIAGEN公司、一步法RT-PCR試劑盒購自TAKARA公司、RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.1.2標(biāo)本來源 2014年9月南平市建甌市東峰鎮(zhèn)、吉陽鎮(zhèn)本地登革熱患者急性期血清。

1.2引物設(shè)計與合成DENV病毒型別鑒定引物序列參照登革熱防治手冊[4]； DENV1、DENV2 完整E基因特異性擴增引物參照黃萌等[5]設(shè)計的序列合成，見表1,表2；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1　DENV1、DENV2分型RT-PCR擴增引物序列

表2　DENV1、DENV2E基因RT-PCR擴增引物序列

1.3病毒培養(yǎng)及RNA提取將血清標(biāo)本用Hank’s液按1∶10稀釋至0.5 mL備用。將稀釋好的標(biāo)本接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)好的單層C6/36白蚊伊蚊傳代細(xì)胞，28 ℃、5%CO2吸附1 h，補充維持液(含2%的小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基)至3 mL，28 ℃、5%CO2培養(yǎng)觀察至75%細(xì)胞出現(xiàn)病變。收獲感染細(xì)胞和培養(yǎng)液體，取140 μL培養(yǎng)液體按QIAamp Viral RNA Mini Kit提取試劑盒操作步驟提取病毒RNA，其余-70 ℃保存。

1.4RT-PCR擴增鑒定病毒型別一步法RT-PCR試劑盒操作說明配制50 μL體系RT-PCR反應(yīng)混合液，PCR擴增體系配置采用正向引物D1與反向引物TS1、TS2。反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，反應(yīng)30循環(huán)；72 ℃ 10 min。2.0%濃度瓊脂糖電泳分析，確定病毒型別。

1.5E基因片段擴增及產(chǎn)物的純化測序一步法RT-PCR試劑盒操作說明配制50 μL體系RT-PCR反應(yīng)混合液，引物分別使用DENV1E-F/DENV1E-R和DENV2E-F/DENV2E-R擴增相應(yīng)型別的E基因，反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 2 min，反應(yīng)40循環(huán)； 72 ℃ 10 min。采用凝膠回收試劑盒對擴增產(chǎn)物進行純化，參照試劑盒說明書進行。純化后送上海生工生物工程股份有限公司進行序列測定。

1.6病毒基因序列分析及構(gòu)建進化樹測序結(jié)果用DNAStar軟件中的SeqMan進行拼接， 獲得登革病毒E 基因全長序列。從GenBank下載具有代表性的登革病毒E 基因序列，通過BLAST分析了解其一致性最高的序列來源，并用DNAMAN進行同源性分析，通過MEGA6.0 構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)進化樹分析。

2結(jié)果

2.1病毒分離患者血清接種C6/36細(xì)胞后，在第5 d左右出現(xiàn)空泡樣病變，1周左右細(xì)胞均出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect, CPE)：細(xì)胞形態(tài)改變，折光性下降，出現(xiàn)腫大、蝕斑、空泡和融合等現(xiàn)象，部分細(xì)胞壞死脫落(圖1)。

1: Uninfected C6/36 cells; 2: Normal cells 7 days; 3: CPE 7 days after infected with dengue patient serum.

圖1接種登革熱患者標(biāo)本前后C6/36細(xì)胞形態(tài)

Fig.1Morphologic changes of C6/36 cells after infected with dengue patient serum

2.2RT- PCR鑒定病毒型別以病毒細(xì)胞培養(yǎng)液體中提取的病毒RNA 為模板，用(D1+TS1)、(D1+TS2) 兩對引物進行RT-PCR擴增， 經(jīng)2.0%瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。FJ/210/2014、FJ/211/2014、FJ/212/2014、FJ/213/2014的擴增片段與預(yù)期片段482 bp一致，證實為DENV-1型；FJ/269/2014、FJ/270/2014的擴增片段與預(yù)期片段119 bp一致，證實為DENV-2型(圖2)。6株病毒分離毒株標(biāo)本基本信息見表3。

M: 100 bp DNA marker; 1: FJ/210/2014; 2: FJ/211/2014; 3: FJ/212/2014; 4: FJ/213/2014; 5: DENV1 positive control; 6: FJ/269/2014; 7: FJ/270/2014; 8: DENV2 positive control; 9: DENV1 negative control; 10: DENV2 negative control.

圖2RT-PCR型別鑒定DENV1、DENV2結(jié)果

Fig.2Serotype identification of DENV1 and DENV2 by RT-PCR

2.3病毒E 基因全長擴增以細(xì)胞培養(yǎng)液提取的病毒RNA為模板，用DENV1E-F+ DENV1E-R 和DENV2E-F+ DENV2E-R兩對引物分別進行

表3　病毒分離毒株標(biāo)本基本信息

RT-PCR 擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳觀察，分別獲得了與預(yù)期片段一致的E基因擴增片段(DENV-1：1 609 bp, DENV-2：1 610 bp)(圖3)。

M: DL2000 DNA Marker; 1: FJ/210/2014; 2: FJ/211/2014; 3: FJ/212/2014; 4: FJ/213/2014; 5: FJ/269/2014; 6: FJ/270/2014.

圖3DENV1、DENV2 E基因全長RT-PCR擴增結(jié)果

Fig.3RT-PCR amplification of DENV1 and DENV2 E gene

2.4E基因BLAST及同源性分析通過BLAST分析，DENV-1型的4株分離株均與2013年廣東東莞的分離株D13459(Donguang)具有較高的一致性，DENV-2型的2株分離株均與2014年廣東廣州的分離株DENV2/CN/GZ05/2014具有較高一致性(表4)。經(jīng)DNAMAN 8.0比較其同源性，4株南

平DENV-1型分離株之間同源性為100%，與D13459(Donguang)分離株同源性也高達99.7%；2株DENV-2型分離株與DENV2/CN/GZ05/2014分離株的同源性均達100%。

2.5E基因系統(tǒng)進化樹分析4株DENV-1病毒E基因全長序列與GenBank中29株國內(nèi)外具有一定代表性的的登革病毒株E基因序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹并分析(圖3)，其結(jié)果顯示：E基因進化樹能將DENV-1的基因型較好的區(qū)分；4株DENV-1病毒株與來自廣東及印度的毒株處于同一進化樹分支，均在基因Ⅴ型的分支。2株DENV-2病毒E基因序列與GenBank中30株國內(nèi)外具有一定代表性病毒株E基因序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹并分析(圖4)，結(jié)果顯示：E基因能用以對DENV-2的基因型分型分析；2株DENV-2病毒株與來自廣東及新加坡的毒株處于同一進化樹分支，均歸屬于基因Ⅳ型的分支。

A: DENV1 phylogenetic tree; B: DENV2 phylogenetic tree.Strains are denoted by GenBank accession number, country of isolation, year of isolation.

IsolatenameStrainswiththehighestidentityStrainsLocationofisolateYearIDofGenBankMaxidentityD1/FJ/210/2014D13459(Donguang)Guangdong2013KJ54547999%D1/FJ/211/2014D13459(Donguang)Guangdong2013KJ54547999%D1/FJ/212/2014D13459(Donguang)Guangdong2013KJ54547999%D1/FJ/213/2014D13459(Donguang)Guangdong2013KJ54547999%D2/FJ/269/2014DENV2/CN/GZ05/2014Guangdong2014KP01254699%D2/FJ/270/2014DENV2/CN/GZ05/2014Guangdong2014KP01254699%

3討論

本次研究構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，DENV-1、DENV-2病毒E基因均能很好的進行病毒基因分型，4株DENV-1型毒株間同源性達100%，而2株DENV-2毒株間的同源性也達100%，因此我們認(rèn)為這是分別由同一DENV-1型病毒傳染源和同一DENV-2型病毒傳染源造成的兩起暴發(fā)疫情。DENV-1與來自廣東的毒株(登錄號：KJ545479)及印度的毒株(登錄號：JN415507)親緣關(guān)系最近，DENV-2也與廣東毒株(登錄號：KP012546)及新加坡毒株(KM279580)親緣關(guān)系最近，且當(dāng)時廣東及東南亞地區(qū)正處于登革熱暴發(fā)流行時期。流行病學(xué)調(diào)查顯示南平暴發(fā)所在地與廣東和東南亞地區(qū)存在一定的貿(mào)易人口流動。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查資料表明，兩個血清型的病毒株可能是來自廣東或者東南亞地區(qū)的輸入性登革熱病例。

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為我國登革熱的流行方式屬于輸入性病例引起的本地暴發(fā)流行[6]。關(guān)于我國是否存在登革熱的自然疫源地目前仍存在較大的爭議。由于登革熱主要傳播媒介之一的白蚊伊蚊在在我國南方省市普遍存在，在我省也分布廣泛[7]，且我省地處沿海地區(qū)，隨著對外開放的擴大，國際商旅活動、勞務(wù)輸出的日益頻繁，來往登革熱疫區(qū)的出入境人員數(shù)量眾多，極易發(fā)生輸入性病例引起本地暴發(fā)流行。因此，對境外輸入性登革熱病例的防控一直是我省的工作重點。然而隨著國內(nèi)近年來部分地區(qū)登革熱病例暴發(fā)疫情的發(fā)生，以及本次南平首次本地病例的暴發(fā)，提示著我省應(yīng)該加強國境內(nèi)輸入性病例的防控工作，提高我省非沿海地區(qū)登革熱防控意識，從而較好的防止輸入病例引起本地暴發(fā)流行的發(fā)生。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.014

通訊作者：嚴(yán)延生，Email:yysh@fjcdc.com.cn

中圖分類號：R373.3

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0281-05

Corresponding author:Yan Yan-sheng, Email: yysh@fjcdc.com.cn

收稿日期：2015-05-19；修回日期:2015-11-09

Sequence analysis for E genes of autochthonous dengue virus isolates from Nanping, Fujian Province, 2014

WANG Jin-zhang1,CHEN Hong-bin1,ZHANG Yong-jun1,WENG Yu-wei1,WU Chun-min2,ZHENG Kui-cheng1,YAN Yan-sheng1

(1.FujianProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,FujianPriorityLaboratoryforZoonoses,Fuzhou350001,China;2.NanpingCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanping353000,China)

Abstract:In September 2014, an autochthonous outbreak of dengue fever emerged in Nanping, Fujian Province. In order to identify serotypes of the outbreak-related dengue viruses and track probable transmission sources, serum samples of patients at acute phases were inoculated on C6/36 cell lines. Serotypes were initially tested by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), full-length fragments of E gene were amplified by RT-PCR, and were sequenced. A phylogenetic tree was drawn by neighbor-joining (NJ) method. Among the four DENV-1 strains and two DENV-2 strains isolated during the outbreak, it was indicated from BLAST analyses of sequence data that DENV-1 strains showed 99.7% sequence homology with strain D13459 (Donguang) from Guangdong in 2013, and that DENV-2 strains were identical to strain DENV2/CN/GZ05/2014 from Guangdong in 2014. Phylogenetic analysis also indicated that outbreak-associated DENV-1 strains were classified as genotype Ⅴ and DENV-2 strains were assigned to genotype Ⅳ. Therefore, it was suggested from epidemiologic and molecular evidence that DENV-1 viruses might originate from Guangdong or India, and that DENV-2 viruses might be introduced from Guangdong or Singapore.

Keywords:dengue virus; E gene; sequence analysis; phylogenetic tree