山葡萄DFR基因全長cDNA的克隆與序列分析

曹芳芳　李娟　劉海峰

摘要：應(yīng)用RT-PCR和 SMART RACE等技術(shù)克隆山葡萄二氫黃酮醇4-還原酶基因的全長cDNA序列，結(jié)果表明，該基因全長1 362 bp，包括1 014 bp的完整開放閱讀框，推測其編碼337個氨基酸。該基因表達產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為37.50 ku，等電點為5.95，是穩(wěn)定蛋白，不包含信號肽。蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果表明，DFR疏水性最大值為2.511，最小值為-2.267，平均值為-0.146，整體表現(xiàn)為親水性。二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，DFR的二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋（35.31%）和不規(guī)則卷曲（46.29%）為蛋白最大量的結(jié)構(gòu)元件。對不同植物DFR氨基酸序列進行多重比對發(fā)現(xiàn)，同源性較高，DFR與NADPH結(jié)合區(qū)域和底物結(jié)合區(qū)域都表現(xiàn)出高度保守。用推導(dǎo)的氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，其氨基酸序列與歐亞種葡萄、大豆、矮牽牛等植物的DFR氨基酸序列兩兩比對的相似性系數(shù)分別為98%、76%、74%。

關(guān)鍵詞：山葡萄；二氫黃酮醇4-還原酶；克隆；序列分析

中圖分類號： S663.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0034-05

山葡萄（Vitis amurensis）為葡萄科葡萄屬多年生藤本植物，植株似葡萄而細小。山葡萄是葡萄屬中最抗寒的一個種，是葡萄屬植物抗性育種的珍貴資源，已被多個國家和地區(qū)所重視。山葡萄是一種經(jīng)濟價值很高的野生經(jīng)濟植物，成熟后的果實味甜酸，富含果汁，可生食，用山葡萄漿果釀造的葡萄酒品質(zhì)優(yōu)良，是我國東北地區(qū)葡萄酒工業(yè)的主要原料。葡萄酒具有預(yù)防心腦血管疾病的作用，原花青素[1]是其中最主要的作用成分。研究表明，原花青素存在較強的抗氧化活性和抗癌活性，對降低毛細血管的滲透性有重要的藥理作用。葡萄酒的品質(zhì)與葡萄中原花青素的含量有直接關(guān)系[2]。花青素類化合物也是植物中可溶性天然色素的主要來源，因此研究花色苷植物資源有重要意義?；ㄇ嗨刂苯踊蜷g接影響果實的外觀顏色形成，在合成花青素過程中[3]，DFR（dihydrofla-vonol 4-reductase，二氫黃酮醇-4-還原酶） 起決定性作用。DFR反應(yīng)需要NADPH（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）的參與。DFR依賴DHM（dihydromyricetin，二氫楊梅黃酮）、DHK（dihydrokaempferol，二氫堪非醇）、DHQ（dihydroquercetin，二氫櫟皮黃酮）3種底物，它們結(jié)構(gòu)相似，只在B苯環(huán)上的羥基數(shù)目上不同，DFR將DHM、DHK、DHQ底物還原，分別生成相應(yīng)的無色花翠素、無色花葵素、無色花青素[4]，通過后續(xù)途徑最終將無色的二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化合成有色花色素[5]。不同物種DFR對3種底物具有選擇特異性[6]，所以能合成不同的花色素[7]，導(dǎo)致植物呈現(xiàn)出不同的花色、果色。DFR基因最早由OReilly等于1985年從金魚草（Antirrhinum majus）和玉米（Zea mays）中分離得到[8]。目前，研究人員已經(jīng)從許多不同的植物中成功分離出DFR及其他基因[9]，但對山葡萄中的DFR研究尚未見報道。本研究以山葡萄為試驗材料，利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）等方法[10]克隆DFR全長基因，成功得到山葡萄DFR基因的cDNA全長序列，并進行生物信息學(xué)分析以及序列比對，旨在為分析及調(diào)控山葡萄中花色苷的合成提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試材山葡萄雙豐（V.amurensis ‘Shuang Feng）采自國家山葡萄種質(zhì)資源圃，采摘無病蟲害、飽滿的成熟期果粒，立即置于液氮中冷凍，-80 ℃冰箱中保存，取其果皮作為供試材料。

1.1.2 試劑材料 Tris-HCl、CTAB、EDTA、LiCl、β-巰基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal為AITiresco分裝試劑；大腸桿菌（Escherichia coli） DH5-α、pMD19-T載體、Taq酶、Marker DL2000購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購于Omega公司；反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript Ⅱ購自Invitrogen公司；SMARTTM RACE試劑盒購于Clonteeh公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物由英俊生物技術(shù)有限公司合成，DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 登錄NCBI網(wǎng)站，根據(jù)GenBank中已登陸的DFR基因的核苷酸序列和氨基酸序列，通過多序列比對確定其共有的保守區(qū)，利用Primer 6.0設(shè)計1對特異引物（用來擴增目的片段）：VAmDFRs，5′-TCATCGGTTCATGGCTGGTC-3′；VAmDFRa，5′-CAGTTATGAGGCTTGGAGGC-3′。

1.2.2 山葡萄果皮總RNA的提取及cDNA的合成 采用改良的CTAB法[11]提取山葡萄果皮中的總RNA。用紫外分光光度計測定其D230 nm、D260 nm、D280 nm及總RNA濃度，用1% TAE檢測RNA的完整性。按照Invitrogen公司的SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書，以O(shè)ligo（dT）20為引物，總RNA為模版，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第1條鏈。

1.2.3 PCR擴增目的基因片段 PCR擴增反應(yīng)體系如表1所示。

擴增反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 退火1 min，72 ℃退火2 min，72 ℃ 延伸7 min，35個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，回收純化目的片段。

1.2.4 5′-RACE和3′-RACE片段的獲得 用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit方法進行RACE cDNA擴增。根據(jù)保守區(qū)測序結(jié)果，克隆中間片段的引物可以繼續(xù)用于RACE，其中VAmDFRs用作3′-RACE引物，VAmDFRa用作5′-RACE引物。繼續(xù)擴增所得到的程序，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物確定條帶。

1.2.5 目的片段的回收和連接 按照膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物的DNA片段進行回收、連接與轉(zhuǎn)化。將回收的DNA片段與pMD-19載體連接，16 ℃連接3 h。反應(yīng)體系為pMD-19載體 0.5 μL DNA片段4.5 μL、SolutionⅠ5 μL。

1.2.6 轉(zhuǎn)化 將DH5-α感受態(tài)細胞解凍后，取50 μL加入10 μL連接產(chǎn)物，冰浴30 min；取出后熱激90 s，置于冰上2～3 min；加入預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基300 μL，37 ℃ 190 r/min培養(yǎng)1 h；取適量菌液，涂布于含有AMP、X-Gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑白色單克隆置于37 ℃培養(yǎng)箱中，200 r/min培養(yǎng)12 h。隨后進行菌液PCR檢測，將成功克隆的菌樣測序。

1.3 VamDFR基因序列及推測蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

用DNAstar軟件查找VamDFR基因的開放閱讀框（ORF）并推導(dǎo)其氨基酸序列；利用 NCBI的BLAST程序檢索數(shù)據(jù)庫，對VamDFR基因全長cDNA序列及其氨基酸序列進行比對分析。利用在線軟件（表2）進行生物信息學(xué)分析，采用GeneDoc軟件進行多序列比對，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 山葡萄VamDFR基因cDNA全長的克隆及序列分析

采用改良的CTAB法提取成熟期葡萄果皮中的總RNA，總RNA質(zhì)量合格，無降解。將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，用DFR基因引物VAmDFRs、VAmDFRa進行PCR擴增，獲得目的特異條帶，約580 bp，與預(yù)期片段大小相近。產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，篩選測序后獲得保守序列片段，用NCBI/BLAST程序進行同源搜索，結(jié)果與Vitis vinifera基因的相似性為98%。參照RACE試劑盒說明，以逆轉(zhuǎn)錄分別合成的5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA為模板，GSP與UPM為引物，分別進行5′-RACE和3′-RACE擴增，結(jié)果如圖1所示。以3′-RACE-Ready-cDNA為模板，DFRs與UPM為引物擴增得到1 241 bp條帶。以5′-RACE-Ready-cDNA為模板，DFRa與UPM為引物擴增得到約702 bp 條帶。陽性對照反應(yīng)用GSP1、GSP2為引物進行擴增，得到與預(yù)期大小相同（約580 bp）的條帶。陰性對照單引物擴增，沒有條帶產(chǎn)生。

將5′-RACE和3′-RACE測序結(jié)果應(yīng)用Vector NTI Ssuire 9.0軟件去除載體序列后拼接獲得cDNA全長。應(yīng)用DNAStar軟件對獲得的山葡萄DFR進行開放閱讀框分析，并將其推導(dǎo)為相應(yīng)的氨基酸序列，結(jié)果顯示，該基因全長 1 362 bp，包括1 014 bp完整開放閱讀框、76 bp 5′-非轉(zhuǎn)譯區(qū)、272 bp 3′-非轉(zhuǎn)譯區(qū)，推測其編碼337個氨基酸，GenBank登錄號為FJ645768，將其命名為VamDFR。

2.2 VamDFR基因編碼蛋白質(zhì)理化性狀分析

利用ProParam工具在線預(yù)測分析VamDFR基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白由337個氨基酸組成，分子量（MV）為37.50 ku，等電點值為5.95。 正電荷殘基（精氨酸+賴氨酸）37個，負電荷殘基（天冬氨酸+谷氨酸）42個，不穩(wěn)定指數(shù)34.68，脂肪指數(shù)81.31，表明VamDFR基因蛋白屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 VamDFR蛋白保守區(qū)預(yù)測

利用NCBI的BlastP，在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫對山葡萄VamDFR基因進行蛋白保守區(qū)預(yù)測，VamDFR有多個保守域，如cd05193（AR_like_SDR_e）、PLN02583（PLN02583）、pfam01073（3Beta_HSD）等，該基因應(yīng)屬于DFR超基因家族[12]（圖2）。

2.4 VamDFR蛋白的親水性分析

利用ProtScale程序分析了山葡萄VamDFR蛋白氨基酸序列的親水性/疏水性（圖3）。圖中縱坐標為氨基酸標度值，橫坐標為氨基酸序列位置。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強的規(guī)律，結(jié)果顯示，VAmDFR疏水性最大值為2.511，最小值為-2.267，疏水性平均值為

-0.146；可明顯看出疏水性最大值在第168位點，值為 1.900；最小值在第145位點，值為-2.722；總平均親水性指數(shù)為-0.146，整體表現(xiàn)為親水性。

2.5 VamDFR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)TMHMM和TMpred Server網(wǎng)站分析，超過500分的才被認為顯著。從分析結(jié)果中可以得出，VamDFR蛋白無跨膜螺旋，所以可推測VamDFR不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.6 VamDFR蛋白的信號肽預(yù)測及二級結(jié)構(gòu)分析

利用SignalP4.1 Server對山葡萄VamDFR基因蛋白進行信號肽預(yù)測，結(jié)果表明，VamDFR基因編碼的蛋白不具有信號

肽。利用網(wǎng)上資源HNN在線預(yù)測VamDFR二級結(jié)構(gòu) （圖4），結(jié)果顯示，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由35.31%的α-螺旋、46.29%的不規(guī)則卷曲和18.40%的延伸鏈組成。

2.7 山葡萄VamDFR編碼蛋白質(zhì)的同源性及進化分析

用推導(dǎo)的氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，其氨基酸序列與歐亞種葡萄（V. vinifera，X75964）、圓葉葡萄（V. rotundifolia，KC460268）、蘋果（Malus domestica，XM_008379159）、大豆（Glycine max，NM_001251683）、飛燕草（Delphinium grandiflorum，LC029441）和矮牽牛（Petunia hybrida，X15537）等植物的DFR氨基酸序列兩兩比對的相似性系數(shù)分別為98%、98%、81%、76%、77%、74%，多序列比對結(jié)

果見圖5。

山葡萄（V. amurensis，F(xiàn)J645768）、歐亞種葡萄（V. vinifera，X75964）、圓葉葡萄（V. rotundifolia，KC460268）蘋果（M. domestica，XM_008379159）大豆（G. max，NM_001251683）、飛燕草（D. grandiflorum，LC029441）和矮牽牛（P. hybrida，X15537）VAmDFR中含有與NADPH結(jié)合的保守基序（V8-Y30）[13]和26個氨基酸組成的底物特異結(jié)合的保守基序（T131-K156），其中N132和E144直接影響DFR的底物特異性，不同物種存在一定差異，Q138、Y142、D149、F152非常保守[7]。這些位點在結(jié)構(gòu)和功能上均與已知的葡萄VvDFR（CAA72420）及其他DFR蛋白相似，而且都在相同或相近的位置，從而可推斷VAmDFR屬于NADPH依賴的還原酶家族中的二氫黃酮醇4-還原酶。

用MEGA 4軟件對該基因及其他植物的DFR氨基酸序列進行多序列比對，繪制分子進化樹，結(jié)果（圖6）表明，山葡萄VAmDFR氨基酸序列與歐亞種葡萄（V.vinifera，X75964）、圓葉葡萄（V.rotundifolia，KC460268）、美國蔓藤（A.grossedentata，KC753780）、棉花（G.hirsutum，EF187441）、臍橙（C.sinensis，NM_001288931）可歸為一類，親緣關(guān)系較近；與水稻（O.sativa，AF134807）、玉米（Z.mays，NM_001158995）、小麥（T.aestivum，AY209183）、薺菜（B.juncea，GU230159）、擬南芥（A.thaliana，M86359）、飛燕草（D.grandiflorum，LC029441）等親緣關(guān)系較遠。

3 結(jié)論與討論

植物的花色和果色主要受花色素直接或間接控制，DFR是合成花色素苷的關(guān)鍵酶，因此研究DFR意義重大，DFR是單基因編碼的NADPH依賴性短鏈還原酶家族[14]。對不同物種的DFR基因編碼的氨基酸序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)有2個保守區(qū)域，其中底物特異性選擇結(jié)構(gòu)域是由26個氨基酸組成[15]。DFR分子中底物結(jié)合區(qū)的氨基酸序列決定它對不同

底物的結(jié)合，此序列在不同物種中也是高度保守的[16]。研究表明，保守區(qū)域中存在的132、141位氨基酸對酶的底物特異性有很大影響，大部分的物種在132位是D（天冬氨酸）或N（天冬酞胺）。當132位氨基酸為D時是ASP型DFR，為N時是ASN型DFR，也存在少數(shù)既不是D也不是N的，被稱作非ASP/ASN型DFR[7]。Johnson等在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)，它的132位氨基酸為天冬氨酸，它的DFR主要催化DHM，其次是DHQ，而對DHK則無作用[7]，不能利用DHK為底物生成天竺葵素，但許多132位是天冬酞胺的植物能利用DHK作為底物[17]。本試驗克隆得到的山葡萄DFR基因編碼的氨基酸在132位是N，為ASN型，推測它能夠催化DHK生成無色花葵素，也有報道在山葡萄果皮中檢測到花葵素[18]，更加確定了筆者這一觀點。有關(guān)山葡萄花色素組成成分的報道中也有花青素、花翠素的存在，由此推測DFR基因可能不是單拷貝，而是多基因拷貝。

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