5株P(guān)CV2四川株全基因組的克隆與遺傳進化分析

楊澤曉,馬玉峰,汪開毓,王　印,趙希侖,姚學(xué)萍,任冉陽,陳　平,胡　凌

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,四川 溫江 611130；2 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室,四川 溫江 611130;3 金宇保靈生物藥品有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

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5株P(guān)CV2四川株全基因組的克隆與遺傳進化分析

楊澤曉1,2,馬玉峰1,3,汪開毓1,王印1,2,趙希侖1,姚學(xué)萍1,任冉陽1,陳平1,胡凌1

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,四川 溫江 611130；2 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室,四川 溫江 611130;3 金宇保靈生物藥品有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

[摘要]【目的】 了解目前四川省豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的分子流行病學(xué)特征和遺傳變異情況，探討PCV2感染的控制對策?！痉椒ā?根據(jù)GenBank中發(fā)表的PCV2基因組序列設(shè)計2對特異性引物，對2012-2014年臨床送檢的PCV2感染病例材料中的5株P(guān)CV2全基因組序列進行擴增測序，并利用DNAStar等生物信息分析軟件對獲得的PCV2基因組序列進行分子特性與遺傳演變分析?！窘Y(jié)果】 5株P(guān)CV2四川株全基因組序列長度都為1 767 bp，均具有滾環(huán)復(fù)制起點(ORC)典型結(jié)構(gòu)。序列比對和進化分析顯示，5株P(guān)CV2四川株的基因序列同源性很高，基因組核苷酸序列及ORF1、ORF2和ORF3基因序列同源性分別為98.4%～99.9%，97.5%～99.6%，99.4%～100%和96.2%～100%，ORF1、ORF2和ORF3基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為98.4%～99%，99.6%和91.5%～100%；與47條參比PCV2毒株核苷酸序列的同源性比較發(fā)現(xiàn)，5株P(guān)CV2與國內(nèi)一些新出現(xiàn)的PCV2毒株親緣關(guān)系較近，且均屬于PCV2d基因型毒株?！窘Y(jié)論】 5株P(guān)CV2四川株之間盡管存在著不同程度的基因變異，但遺傳進化相對較穩(wěn)定。

[關(guān)鍵詞]PCV2；基因克??；遺傳進化分析

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是一種單股環(huán)狀DNA病毒，病毒子呈球形，無囊膜，直徑17～20 nm，屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)成員[1]。目前常見的PCV包括PCV1和PCV2 2種血清型，其基因組長度分別為 1 759 和1 768 bp(或1 767 bp)[2]，其中PCV1發(fā)現(xiàn)于傳代細胞PK-15中，可能廣泛存在于豬體內(nèi)以及豬的原代和傳代細胞系中，幾乎無致病性，也被稱為非致病PCV(npPCV)[3]；而PCV2具有致病性，被認為是導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原[1]，此外PCV2還與懷孕母豬繁殖障礙(SAMS)[4]、幼齡仔豬A2型先天性震顫(CT-A2)[5]、斷奶豬和育肥豬的呼吸道疾病(PRDS)、豬皮炎和腎炎綜合征(PDNS)[6]、產(chǎn)房仔豬拉稀[7]、間質(zhì)性肺炎(IP)、增生性壞死性肺炎(PNP)等疾病密切相關(guān)，因此又將PCV2感染稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus-associated disease，PCVAD)或者豬圓環(huán)病毒病(PCVD)[7-8]。由于PCV2致病機理尚不清楚，這增加了其控制難度，但一般認為豬只感染PCV2后免疫功能會受到損害，機體抵抗力降低，更易遭受其他病原的并發(fā)、繼發(fā)感染或者在應(yīng)激條件下發(fā)病甚至加重病情[7]。20世紀90年代，PCV2感染作為PMWS病因在加拿大被報道后，世界很多國家證實有PCV2的存在和流行[2]，成為目前全球養(yǎng)豬生產(chǎn)中被廣泛關(guān)注的一種病原。我國自2000年發(fā)現(xiàn)豬群中存在PCV2感染以來，由PCV2感染所致疾病不斷見諸報道，已經(jīng)給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[7]。近些年來隨著PCV2滅活疫苗的使用，其流行情況得到了一定程度的控制，但是在臨床檢測診斷中仍有PCV2感染病例不斷出現(xiàn)[9]，加之與其他疾病的混合感染，PCV2感染控制的形勢仍然十分嚴峻。研究表明，PCV2基因序列的遺傳變異和演變可能與PCV2毒力變化、致病機理及PCVAD發(fā)生等相關(guān)，2004年de Boisséson等[10]研究發(fā)現(xiàn)，來源于PMWS豬群與無PMWS豬群的PCV2序列同源性為94.6%～99.9%，且非PMWS豬群來源的PCV2序列比PMWS豬群來源的PCV2序列變異大；還有研究分析認為，PCV2的變異演化與時間有一定的相關(guān)性，其變異周期約為3年[11]；且2009年郭龍軍等[12]報道在我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2株基因組大小為1 766 bp的PCV2毒株。因此，研究PCV2近年來在我國的遺傳變異情況和演變規(guī)律，對目前PCVAD等疾病發(fā)生和控制的相關(guān)研究具有重要意義。為了解目前四川省PCV2流行株的遺傳變異情況，本研究設(shè)計并合成了2對特異性引物，克隆了2012-2104年臨床送檢的5株P(guān)CV2病毒全基因組，并進行序列分析，以期為進一步控制PCV2感染發(fā)生的相關(guān)研究提供科學(xué)材料和依據(jù)。

1材料與方法

1.1毒株、菌種及試劑

DL2000 DNA Marker和pMD19-T載體購自成都飛克(天泰)科技有限公司；蛋白酶K、2×Taq PCR Mastermix、E.coliDH5α感受態(tài)細胞、瓊脂粉、TIANpre Mini Plasmid Kit(DP103)和TIANgel Midi Purification Kit(DP209)等購自成都安雅生物試劑有限公司；PCV2感染病料樣品5份(對應(yīng)毒株分別標(biāo)記為SCh201201、SCh201202、SCh201301、SCh201401和SCh201402)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢疫研究室收集保存。

1.2引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中發(fā)表的PCV2基因組序列，用DNAStar和Premier5.0軟件分析后將PCV2基因組分為分別包含ORF1和ORF2基因的2個大片段(命名為Fa、Fb片段)設(shè)計2對特異性引物，同時合成pMD19-T 載體測序通用引物MR13-47和RV-M，3對引物的信息見表1。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，按照合成說明書將其稀釋至10 μmol/L，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表 1　PCV2基因組PCR擴增相關(guān)引物

1.3PCV2四川株基因的提取

取5份受檢PCV2感染陽性樣品并標(biāo)記，以正常組織樣品作陰性對照，按照參考文獻[2]的方法抽提病毒基因組DNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCV2四川株基因組片段的PCR擴增

分別以1.3節(jié)抽提的5份受檢PCV2病料總DNA和正常組織樣品DNA作為檢測和陰性對照模板，以P1/P2、P3/P4為引物對，按下面反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行PCR擴增。反應(yīng)體系為：2×PCR PreMixture 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5目的基因的克隆鑒定

按TIANgel Midi Purification Kit(DP209)說明書純化回收5株P(guān)CV2的PCR產(chǎn)物；按照pMD19-T Vector kit 說明書進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，接種含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，挑取陽性克隆擴增培養(yǎng)；按TIANpre Mini Plasmid Kit(DP103)說明書抽提重組質(zhì)粒，分別用特異性引物(P1/P2、P3/P4)和pMD19-T載體通用引物MR13-47/RV-M(表1)進行抽提質(zhì)粒的PCR鑒定，反應(yīng)體系和程序同1.4節(jié)。將2種PCR鑒定均為陽性的克隆送往上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進行序列測定。

1.6PCV2四川株基因組的序列分析

用DNAStar等軟件對克隆的5株P(guān)CV2基因組序列進行分析后，收集GenBank中已經(jīng)發(fā)表的國內(nèi)外47條不同基因型的PCV2毒株序列[12-13]和2條PCV1毒株全序列(表2)，進行PCV2基因組及其主要基因(ORF1、ORF2和ORF3)的核苷酸和氨基酸同源性分析；并使用MEGA4.1軟件繪制PCV2四川株基因組序列和47條參考毒株基因組序列的系統(tǒng)進化樹，進行遺傳變異分析。

表 2　PCV2 全基因組序列分析的參考序列

續(xù)表 2　Continued table 2

注：*為PCV1毒株。

Note：* means PCV1 isolate.

2結(jié)果與分析

2.1PCV2四川株基因組的PCR擴增

分別以P1/P2、P3/P4為引物，按照1.4節(jié)中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，對1.3節(jié)抽提的受檢PCV2陽性病料中5株P(guān)CV2的基因組進行PCR擴增，結(jié)果每株P(guān)CV2都擴增出約1 027 bp和774 bp與預(yù)期長度一致的2條特異性DNA條帶(圖1)， 即Fa片段和Fb片段，陰性對照樣品擴增結(jié)果為陰性。

圖 1　5株P(guān)CV2四川株基因組的PCR擴增

2.2PCV2四川株基因組片段的克隆鑒定

按照1.5節(jié)操作分別純化回收5株P(guān)CV2基因組擴增的10個預(yù)期大小DNA片段，連接轉(zhuǎn)化和抽提重組質(zhì)粒，然后分別用相應(yīng)特異性引物和pMD19-T 載體通用引物進行PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，5株P(guān)CV2基因Fb片段重組質(zhì)粒均擴增出約774 bp的特異性片段，而用pMD19-T載體通用引物(RV-M/MR13-47)PCR均擴增出約930 bp的特異性片段；Fa片段重組質(zhì)粒均擴增出約1 027 bp的特異性片段，而用pMD19-T載體通用引物PCR則均擴增出約1 183 bp的DNA片段，都與預(yù)期長度相一致。故將2種PCR鑒定均為陽性的重組質(zhì)粒分別命名為SCh201201-Fa、SCh201201-Fb、SCh201202-Fa、SCh201202-Fb、SCh201301-Fa、SCh201301-Fb、SCh201401-Fa、SCh201401-Fb、SCh201402-Fa和SCh201402-Fb，并進行測序。測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站Blast分析顯示，重組質(zhì)粒連接基因片段與GenBank中提交的PCV2序列(GU325763.1、FJ644929.1、HQ113117.1等)的同源性均高達99%，表明成功克隆了5株P(guān)CV2基因組序列并構(gòu)建了其重組質(zhì)粒。5株P(guān)CV2的基因組測序結(jié)果經(jīng)拼接后已提交GenBank，PCV2毒株SCh201201、SCh201202、SCh201301、SCh201401和SCh201402的登錄號分別為KF530836、KF530837、KJ596438、KM272211和KM272212。

圖 2　PCV2四川株基因組重組質(zhì)粒的PCR鑒定

2.3PCV2四川株基因組的序列特征

采用DNAStar軟件的MegAlign程序?qū)?株P(guān)CV2基因組序列進行拼接和特征分析，結(jié)果表明，受檢5株P(guān)CV2四川株的基因組序列全長均為 1 767 bp，其滾環(huán)復(fù)制起點(ORC)都屬于典型的結(jié)構(gòu)序列：包括環(huán)內(nèi)9堿基保守序列(-AAGTATTAC-)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)下游4個(H1、H2、H3和H4)6堿基保守區(qū)(-CG/AGCAG-)，H1與H2無間隔，H2、H3、H4相隔5個核苷酸(CACCT)，僅H4堿基序列為-CAGCAG-。5株P(guān)CV2基因組的2個最大開放閱讀框(ORFs)ORF1(Rep蛋白編碼基因)和ORF2(Cap蛋白編碼基因)長度不變，ORF1長945 bp，編碼314個氨基酸殘基；ORF2長705 bp，編碼234個氨基酸殘基；除SCh201402株(KM272212)ORF3基因(在ORF1的大閱讀框內(nèi))第103位密碼子點突變?yōu)榻K止密碼子外，其他4株P(guān)CV2的ORF3基因長度均為315 bp，編碼104個氨基酸殘基。 5株受試PCV2基因組與基因組大小為1 768 bp的PCV2毒株(Canada 1998、Japan 2001等)相比，均在第1 042位置處缺失1個堿基T，與我國新出現(xiàn)的基因組大小為1 766 bp的PCV2毒株相比，Jilin 2010(CC1)株則在1 054位置處多缺失1個C堿基，而Heilongjiang 2008(MDJ)株是在39位置處多缺失1個C堿基。

2.4PCV2四川株全基因組同源性比較與遺傳進化分析

采用DNAStar軟件對供試的5株P(guān)CV2四川株基因組序列與GenBank中發(fā)表的國內(nèi)外49條毒株參考序列(表2)進行核苷酸同源性分析，結(jié)果表明，5株供試PCV2四川株的核苷酸同源性為98.4%～99.9%，其中SCh201401(KM272211)與SCh201301(KJ596438)同源性最低，為98.4%，5株供試PCV2四川株的核苷酸同源性處于參比的47株P(guān)CV2毒株序列的核苷酸同源性93%( Denmark 2007與Sweden 2008)～99.9%(Australia 2003與Australia 2003)內(nèi)；與2株P(guān)CV1全序列(Jiangsu 2008、USA 2001)的同源性為69.1%～69.6%，也在參比PCV2毒株與PCV1的序列同源性68.7%(Australia 2003與USA 2001)～70.5%(Denmark 2007與Jiangsu 2008)范圍內(nèi)，表明供試5株P(guān)CV2四川株基因組核苷酸序列遺傳演化相對穩(wěn)定。

使用MEGA4.1軟件Boot-strapped Neighbor-Joining方法，對PCV2四川株基因序列和49條國內(nèi)外PCV的毒株序列繪制系統(tǒng)發(fā)生進化樹并進行遺傳演化分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，PCV1和PCV2形成PCV的2個大分支。PCV2毒株又可分為較獨立的4個分支(PCV2a，PCV2b，PCV2c，PCV2d)，其中參比的12株基因組大小為1 768 bp的不同年份PCV2毒株形成PCV2a分支；參比的4株國內(nèi)PCV2毒株(Heilongjiang 2008、Heilongjiang 2008(MDJ)、Hubei 2003、Jiangsu 2008)和1株P(guān)CV2新加坡株(Singapore 2007)形成PCV2d分支，另外本試驗的5株P(guān)CV2四川株全都處于PCV2d基因型分支；2株P(guān)CV2丹麥株構(gòu)成PCV2c分支；其他參比的28株年份不同的國內(nèi)外PCV2毒株構(gòu)成了數(shù)量龐大的PCV2b基因型分支，該分支包括了大多數(shù)國內(nèi)毒株并呈現(xiàn)復(fù)雜的遺傳變異趨勢；基因型PCV2c和PCV2d毒株的出現(xiàn)時間相對較晚。

圖 3　PCV2四川株基因組核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5PCV2四川株重要蛋白基因及其推導(dǎo)氨基酸的序列分析

通過DNAStar軟件，對5株P(guān)CV2四川株與國內(nèi)外47條PCV2毒株參考序列的ORF1、ORF2和ORF3進行核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性比較發(fā)現(xiàn)，PCV2四川株間ORF1的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為97.5%～99.6%和98.4%～99%，與參比毒株ORF1核苷酸和氨基酸序列的最低同源性分別是96.4%和97.1%(SCh201402與Taiwan 2002)，而47條參考毒株ORF1間核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為96.3%(Taiwan 2002與Heilongjiang 2008(MDJ)等)～100%(France 1998與Germany 1999等)和97.1%(Fuzhou 2007與HenanLY 2008等)～99.7%(Canada 1998與Korea 2013等)。PCV2四川株ORF2間核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為99.4%～100%和99.6%，與參比毒株ORF2核苷酸與氨基酸序列的最低同源性分別是88.1%和87.2%(SCh201301與Denmark 2007)，而47條參考毒株ORF2間核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為84.3%(Taiwan 2002與Denmark 2007等)～100%(2株Denmark 2007間)和84.2%(Denmark 2007與Japan 2001、Australia 2003等)～99.6%(2株Denmark 2007間)。PCV2四川株ORF3間核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為96.2%～100%和91.5%～100%，與參比毒株ORF3核苷酸與氨基酸序列的最低同源性分別是96.2%和91.5%(SCh201401與Denmark 2007等)，而47條參考毒株ORF3核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為95.9%(Jiangsu 2005與Denmark 2007)～100%(Hebei 2007與Hebei 2008等)和 92.5%(Hubei 2003與Denmark 2007)～100%(Hebei 2007與Hebei 2008等)。由同源性分析結(jié)果可知，參比PCV2毒株的3個主要ORFs中，其核苷酸和氨基酸序列的遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)為ORF1>ORF3>ORF2； PCV2四川株ORF1和ORF2核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列與參比毒株最低同源性高于參比序列間的最低同源性，僅ORF3氨基酸序列與參比毒株最低同源性(91.5%)低于參比序列間的最低同源性(92.5%)，但PCV2四川株間的ORF1、ORF2和ORF3基因序列同源性都在參比毒株間的序列同源性范圍內(nèi)，這表明PCV2四川株基因遺傳仍相對穩(wěn)定。

選取PCV2四川株與4種PCV2基因型參比株(每基因型選2株)的ORF2基因推導(dǎo)的氨基酸序列，通過DNAStar軟件對其在5個抗原表位區(qū)A(57-91)、B(121-137)、C(183-191)、D(206-215)、E(230-233)[14]和核內(nèi)定位信號區(qū)(N端的41個氨基酸)[15]的變異情況進行比對，結(jié)果見圖4。

圖 4PCV2 ORF2推導(dǎo)的氨基酸序列框內(nèi)為參比的5個抗原表位區(qū)

Fig.4Induced amino acid sequences based on PCV2 ORF2 Antigentic epitope region of 5 reference in box

由圖4可知，5株P(guān)CV2四川株ORF2編碼的Cap蛋白都包括234個核苷酸殘基，它們在5個抗原表位區(qū)和核內(nèi)定位信號區(qū)的氨基酸高度一致，與其他2株d型PCV2相比，第8位氨基酸由R變?yōu)镕，第59位氨基酸由A變?yōu)镵，第151位氨基酸由P變?yōu)門；與其他基因型PCV2相比，在第8、21、30、47、52、53、54、57等74處氨基酸殘基存在差異，其中第8、53、59、63、68、134和215位等7處氨基酸殘基與其他基因型參比毒株均不同，包括A區(qū)3處、B區(qū)1處、D區(qū)1處和抗原表位以外區(qū)域2處。

3討論

隨著對PCV2感染控制研究和臨床生產(chǎn)實踐的深入，人們已經(jīng)逐步認識到PCV2雖不像豬瘟病毒、高致病性藍耳病毒和偽狂犬病毒那樣毒力強大，但由于PCVAD對養(yǎng)豬生產(chǎn)危害的多系統(tǒng)性、多階段性、多方位性、廣泛性及其病程的長久性等特點，其對養(yǎng)豬業(yè)的危害可能比其他重要疫病的危害還要大[7]。因此控制和消滅PCVAD將具有重要而特殊的意義。本研究對最近3年分離的5株P(guān)CV2的基因組進行了克隆與分析，結(jié)果顯示，受檢5株P(guān)CV2四川株基因組全長1 767 bp，基因組核苷酸同源性在98.4%～99.9%，與參比的基因組大小為1 767 bp的PCV2毒株序列一樣都有ORC典型的莖環(huán)保守結(jié)構(gòu)，均在第1 042位比基因組大小為 1 768 bp的PCV2毒株缺失1個堿基T。對PCV2 的ORF1、ORF2和ORF3核苷酸和氨基酸序列同源性的比較發(fā)現(xiàn)，PCV2四川株3個主要開放閱讀框的核苷酸和氨基酸的序列同源性(除SCh201402株ORF3蛋白氨基酸序列同源性僅為91.5%外)都分布在47個PCV2參比毒株間序列同源性范圍內(nèi)，表明5株P(guān)CV2四川株遺傳變異相對穩(wěn)定?？紤]到ORF3蛋白參與PCV2感染細胞的凋亡，與PCV2致病性有關(guān)[14,16]，加之SCh201402株ORF3蛋白氨基酸序列同源性低于參比毒株序列同源性，筆者對其ORF3基因序列進行了分析，結(jié)果顯示，其ORF3基因第103個密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，由于ORF3基因與Rep蛋白第103-207位氨基酸序列基因(ORF1)是反向互補序列，因此導(dǎo)致 Rep蛋白第105位氨基酸出現(xiàn)了非極性氨基酸錯義突變，由異亮氨酸(I)突變?yōu)榱涟彼?L)。PCV2 SCh201402株ORF3在103位密碼子的無意義突變能否被宿主內(nèi)校正tRNA校正讀譯及其對Rep蛋白功能、病毒毒力的影響有待進一步研究。

對54株P(guān)CV的進化分析顯示，PCV2a、PCV2b 2種基因型的毒株數(shù)量較多，且與一些歐洲分離株親緣關(guān)系較近，包括不同年份的PCV2毒株，如早期出現(xiàn)的USA 1998株和France 1998株，出現(xiàn)較晚的HenanLY 2008株、Korea 2013株以及2013年盧權(quán)威等[13]分離于河南的2株P(guān)CV2；PCV2c基因型僅出現(xiàn)在國外，由2007年丹麥出現(xiàn)的2株P(guān)CV2毒株組成；PCV2d基因型主要由出現(xiàn)較晚的毒株組成，包括供試的5株P(guān)CV2四川株、國內(nèi)的4株P(guān)CV2毒株與1株新加坡PCV2株。由此不難看出，雖然供試的5株P(guān)CV2四川株親緣關(guān)系較近，同屬于PCV2d基因型，但世界上PCV2的演變是多基因型化的，而不是基因型間的簡單演替。此外，通過與2株基因組大小為1 766 bp的PCV2毒株[12](Jilin 2010(CC1)和Heilongjiang 2008(MDJ)株)比較分析發(fā)現(xiàn)，它們并沒有像PCV2a基因型(1 768 bp)毒株一樣單獨形成一個新的基因亞型，而是分別處于PCV2b和PCV2d兩個基因型分支上，序列比對顯示它們分別在1 054處和39處不同位置出現(xiàn)核苷酸缺失，推測是來自于不同基因亞型PCV2毒株的突變，這也提示不同基因亞型PCV2毒株都存在缺失突變的潛力。總體來看，近年來的研究雖然顯示目前PCV2遺傳演變?nèi)匀幌鄬Ψ€(wěn)定，但是PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d 4個基因型以及基因組大小為1 766 bp毒株的出現(xiàn)也暗示PCV2的遺傳演變不斷加劇且趨勢復(fù)雜， PCV2毒株間的遺傳距離不斷擴大，變異方式不斷復(fù)雜化——堿基轉(zhuǎn)換、顛換和缺失等。目前人們在PCV2起源方面的研究認為： PCV1和PCV2基因組結(jié)構(gòu)組成相似，同源性在68%以上，推測PCV1和PCV2間存在一定的親緣關(guān)系，二者之間的差異可能是發(fā)生較大突變而形成的[17]。因此有理由相信PCV2在今后發(fā)生較大突變的可能性是存在的，國內(nèi)外PCV2流行的復(fù)雜化趨勢應(yīng)該引起足夠的重視。

PCV2 ORF2編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白(Cap) 具有良好的免疫原性，一般由233～234個氨基酸殘基組成。本研究表明，5株P(guān)CV2四川株ORF2長度都為705 bp，氨基酸序列同源性為99.6%，在參比毒株間最低氨基酸序列同源性(87.2%)以上，表明PCV2四川株雖然屬于新的PCV2d基因型，免疫原性蛋白仍然比較保守，現(xiàn)用的PCV2滅活疫苗應(yīng)該可以針對PCV2四川流行株產(chǎn)生保護性抗體。然而不同基因型PCV2 毒株ORF2蛋白氨基酸序列比較結(jié)果顯示，與其他參比PCV2相比，PCV2四川株Cap蛋白的氨基酸殘基有74處發(fā)生了突變，其中有3處(第8、21和30位)發(fā)生在N端41個氨基酸以內(nèi)，由于這些突變均不在核內(nèi)對蛋白定位起重要作用的12-18和34-41兩個區(qū)域[16]中，對PCV2蛋白的細胞核內(nèi)定位不會產(chǎn)生顯著影響，但是PCV2四川株有7處氨基酸殘基與其他基因型參比毒株相比都發(fā)生了突變，并且5處發(fā)生在抗原表位區(qū)(A、B、D區(qū))，其毒株抗原性是否改變還有待血清學(xué)試驗來證實。賈懷杰等[18]曾對PCV2-GSLZ株Cap蛋白的氨基酸同源性進行了比較，發(fā)現(xiàn)其同源性有的不超過15%；還有研究發(fā)現(xiàn)多個PCV2d型毒株不能被mAb 1D2識別[19]。由此可見，PCV2的ORF2變異相對不穩(wěn)定，并且可能會影響到PCV2抗原表位的變化，因此隨著PCV2的遺傳演變，其血清型和致病力是否會受到影響還有待今后的研究證實。

本研究通過PCR等常規(guī)方法對2012-2014年P(guān)CV2四川株全基因組進行了克隆測序和遺傳演變分析，結(jié)果顯示，受檢5株P(guān)CV2四川株間基因序列和氨基酸序列都具有很高的同源性，屬于由我國一些新出現(xiàn)毒株組成的PCV2d基因型，與參比毒株相比出現(xiàn)了一定變異但遺傳演化相對穩(wěn)定。本研究補充和明確了近期四川省PCV2流行株的分子流行性病學(xué)特征，為PCV2感染的防控研究提供了新的科學(xué)材料和參考依據(jù)。

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Cloning and phylogenetic analysis of complete genome of five PCV2 strains from Sichuan

YANG Ze-xiao1,2,MA Yu-feng1，3,WANG Kai-yu1,WANG Yin1，2,ZHAO Xi-lun1,YAO Xue-ping1,REN Ran-yang1,CHEN Ping1,HU Ling1

(1CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang,Sichuan611130,China;2KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,Wenjiang,Sichuan611130,China；3TheJinyubaolingBiologicalPhamceuticalCo.,Ltd,Hohhot,InnerMongolia010030,China)

Abstract:【Objective】 This study investigated the molecular epidemiology characteristics and genetic heterogeneity of PCV2 in Sichuan to provide reference for control and prevention of PCV2 infection.【Method】 Two pairs of special primers were designed and synthesized according to the full genome sequences of PCV2 published in GenBank.Then they were used to amplify and sequence the full genome sequences of 5 PCV2 strains in clinical samples of PCV2 infection cases collected from Sichuan during 2012 to 2014 using PCR.Molecular epidemiology characteristics and genetic heterogeneity of 5 PCV2 were also analyzed using DNAStar and MEGA 4.1.【Result】 The genomic sequences of 5 PCV2 strains were all 1 767 bp in the length and had the classic ORC structure in sequence.Phylogenetic analysis showed that the genomes of 5 PCV2 Sichuan strains were closely related to each other.The nucleotide homology of PCV2 full length genome,ORF1,ORF2 and ORF3 were 98.4%-99.9%,97.5%-99.6%,99.4%-100% and 96.2%-100%,respectively.The amino acid sequence homologies of ORF1,ORF2 and ORF3 were 98.4%-99%,99.6% and 91.5%-100%,respectively.Phylogenetic analysis also showed that the 5 PCV2 Sichuan strains were close to some recent PCV2 isolates in China and belonged to genotype PCV2d. 【Conclusion】 The evolution of PCV2 was stable although there were nucleotide mutations at different degree among the 5 strains in Sichuan.

Key words:PCV2;gene clone;phylogenetic analysis

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.001

[收稿日期]2014-08-16

[基金項目]“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAD12B04);四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計劃項目(00270401)

[作者簡介]楊澤曉(1980-)，男，河南南陽人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物疫病防治與獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究。

[中圖分類號]S852.65+9.2

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)04-0001-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.002.html

E-mail：yzxyang2003@126.com