降解布洛芬克隆菌株轉(zhuǎn)座子插入突變體的構(gòu)建

衛(wèi)亞紅，段　敏，向照舉，曲　東，王　瑤

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，c 旱區(qū)生物質(zhì)能研究中心，d 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

?

降解布洛芬克隆菌株轉(zhuǎn)座子插入突變體的構(gòu)建

衛(wèi)亞紅1a,1b,1c，段敏1a，向照舉2，曲東1d，王瑤1a

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，c 旱區(qū)生物質(zhì)能研究中心，d 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

[摘要]【目的】 敲除布洛芬福斯質(zhì)粒文庫克隆菌株4F6中的鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶基因(C23O)，構(gòu)建其Tn5插入突變體，為布洛芬降解調(diào)節(jié)因子的深入研究奠定基礎(chǔ)。【方法】 以構(gòu)建好的3G7 Tn5突變體菌株為基礎(chǔ)，借助pKD46質(zhì)粒的λ-red同源重組酶，將轉(zhuǎn)座子Tn5從菌株3G7中電擊轉(zhuǎn)化至4F6，消除pKD46質(zhì)粒，敲除4F6菌株中的C23O基因，測(cè)定出發(fā)菌株3G7、4F6及Tn5插入突變體菌株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5間位苯環(huán)的裂解活性?！窘Y(jié)果】 42 ℃條件下消除了Tn5插入突變體受體菌4F6中的pKD46質(zhì)粒，構(gòu)建了4F6-G9和4F6-H5突變體。Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5的間位苯環(huán)裂解活性無顯著差異；菌株4F6的間位苯環(huán)裂解活性雖明顯高于菌株3G7，但也僅有1個(gè)C23O基因，其活性差異可能與布洛芬降解調(diào)控因子有關(guān)?！窘Y(jié)論】 提供了一種簡(jiǎn)便有效定位并敲除C23O基因的方法。

[關(guān)鍵詞]可降解布洛芬福斯質(zhì)粒；Tn5突變體；基因敲除

布洛芬是苯丙酸類非甾體抗炎藥物的典型代表，屬于重要的藥物及個(gè)人護(hù)理品(Pharmaceuticals and personal care products,PPCPs)類物質(zhì)。在降低和消除其對(duì)公眾健康及水生環(huán)境的危害和潛在風(fēng)險(xiǎn)的研究中，布洛芬的微生物降解備受關(guān)注。篩選布洛芬高效降解菌株，從中克隆布洛芬降解基因并從分子水平闡明布洛芬降解機(jī)理，可以為布洛芬降解菌劑研發(fā)、城市污水脫布洛芬的前期處理以及飲用水源保護(hù)區(qū)水體中的布洛芬去除提供菌種保障。

Murdoch等[1]首次從污水樣品中分離到以布洛芬(500 mg/L)為惟一碳源和能源的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)菌株Ibu-2，該菌株降解布洛芬的羧酸基側(cè)鏈先于苯環(huán)裂解。近期其又構(gòu)建了菌株Ibu-2的福斯質(zhì)粒文庫，從該文庫中篩選到的陽性克隆菌株pFOS 3G7(簡(jiǎn)寫為3G7)能夠降解布洛芬為異丁基鄰苯二酚[2]。筆者開展了基于Ibu-2菌株的高效降解布洛芬亞克隆菌株構(gòu)建以及降解調(diào)節(jié)因子基因定位研究，力求從分子水平鑒定2個(gè)可降解布洛芬的福斯質(zhì)粒菌株3G7和4F6的間位苯環(huán)裂解活性(Meta-cleavage activity)差異。研究結(jié)果表明，福斯質(zhì)粒菌株4F6間位苯環(huán)裂解活性顯著高于福斯質(zhì)粒菌株3G7[3]，因此推測(cè)菌株4F6有2個(gè)鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因(C23O)。為驗(yàn)證此推測(cè)，本研究基于菌株3G7的Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變株3G7-G9和3G7-H5，利用λ-red同源重組酶質(zhì)粒pKD46敲除4F6菌株中的C23O基因，構(gòu)建新的轉(zhuǎn)座子突變體4F6-G9和4F6-H5，分析2個(gè)原始出發(fā)菌株及各自突變體的間位苯環(huán)裂解活性差異，以期為從分子水平深入闡明布洛芬的微生物降解機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒布洛芬福斯質(zhì)粒文庫克隆菌株3G7[2]的Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變株3G7-G9和3G7-H5，由康奈爾大學(xué)微生物系Dr.Anthony G.Hay實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，這2株突變體中的Tn5插入位點(diǎn)在鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶基因內(nèi)。本研究所用菌株與質(zhì)粒見表1。

表 1　本研究所用菌株和質(zhì)粒

注：Cmr.氯霉素抗性(LB中終質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL)；Ampr.氨芐青霉素抗性(150 μg/mL)；Tetr.四環(huán)素抗性(5 μg/mL)。

Note:Cmr.Chloramphenicol resistance (final concentration in LB was 12.5 μg/mL);Ampr.Ampicillin resistance (150 μg/mL);Tetr.Tetracycline resistance (5 μg/mL).

1.1.2主要試劑和儀器布洛芬購自Acros Co. (N.J.,USA)，鄰苯二酚購自Sigma Chemical Co. (St. Louis,M.O.,USA)，1 000×拷貝數(shù)誘導(dǎo)溶液購自Epicentre Biotechnologies (Madison,W.I.,U.S.A.)，Start PCR Master Mix buffers購自Thermo Scientific Inc.(Waltham,M.A.,USA)，1 kb Marker購自Invitrogen (carisbad,CA)，瓊脂糖購自Fisher Scientific Co.(Fair Lawn,N.J.,USA)，ZymocleanTM膠回收試劑盒購自Zymo research公司(Irvine,CA)，其余試劑均來自Fisher Scientific Co.。

MilliQ 純水制備系統(tǒng)購自Millipore Co.(Bedford,M.A.,USA)，無菌濾膜購自Corning (N.Y.,USA)，Micropulser電擊轉(zhuǎn)化儀購自Bio-Rad公司(Hercules,CA)。Synergy HT TM型酶標(biāo)儀購自Bio-Tek instruments inC.(Winooski,V.T.,USA)。

1.1.3引物本研究設(shè)計(jì)的鄰苯二酚2, 3-雙加氧酶(C23O)基因克隆正反向引物(C23O F和C23O R)由Integrated DNA Technologies (IDT) Inc.(Coralville,I.A.,USA)合成。引物序列為C23O F:5′-ATA ATC GCA CGG AAC TCG ACA CCT-3′；C23O R:5′-TCG GTG CGA CCT TCA ATC ATG TCA-3′。使用DNAStar軟件搜尋鄰苯二酚2, 3-雙加氧酶引物的準(zhǔn)確位置，確認(rèn)C23O F位于布洛芬降解基因簇中的663-686 bp處；而C23O R位于1 848-1 871 bp處。

1.2福斯質(zhì)粒文庫克隆菌株3G7 Tn5突變體G9和H5的確認(rèn)

使用MilliQ 純水制備系統(tǒng)制備PCR反應(yīng)試驗(yàn)用純水，并經(jīng)0.2 μm無菌濾膜過濾備用。將上述無菌ddH2O分裝至離心管，UV燈下滅菌10 min，作為PCR反應(yīng)所需用水。PCR反應(yīng)體系為：Start PCR Master Mix buffers 10 μL，C23O F和C23O R引物各1 μL，補(bǔ)足ddH2O至20 μL。加入微量單菌落(分別為3G7 Tn5突變體G9和H5)于PCR反應(yīng)管中，設(shè)不加菌落的PCR反應(yīng)管為陰性對(duì)照，添加pFOS 3G7單菌落的PCR反應(yīng)管為陽性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件同文獻(xiàn)[4]。PCR反應(yīng)結(jié)束后，分別添加5 μL 1 kb Marker和10 μL PCR反應(yīng)液至1.0%瓊脂糖凝膠孔，168 V持續(xù)1 h，觀察電泳結(jié)果以確認(rèn)突變體中該轉(zhuǎn)座子的存在與否。

1.3重組質(zhì)粒pKD46的電擊轉(zhuǎn)化

首先制備4F6菌株的感受態(tài)細(xì)胞，具體操作為：轉(zhuǎn)移600 μL 4F6菌株的過夜培養(yǎng)液至5.4 mL LB(Cmr)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h。將上述培養(yǎng)液分裝至1.5 mL離心管，14 000 r/min離心1.5 min, 棄上清，收集細(xì)胞，重復(fù)離心2次。用1 mL 300 mmol/L的冰凍蔗糖洗滌上述細(xì)胞3次，再次懸浮至100 μL冰凍蔗糖中。

添加80 μL制備的4F6感受態(tài)細(xì)胞和1 μL pKD46質(zhì)粒至冰凍電擊轉(zhuǎn)化杯中，選擇1.8 kV電擊，迅速加入600 μL LB培養(yǎng)液，30 ℃恢復(fù)培養(yǎng)1 h。8 500 r/min離心1.0 min，移去500 μL培養(yǎng)液后將剩余細(xì)胞涂布于LB(CmrAmpr)雙抗平板上，30 ℃培養(yǎng)，所生長(zhǎng)菌株命名為4F6-pKD46。

1.43G7 Tn5突變體中線性DNA的電擊轉(zhuǎn)化

使用C23O F和R引物分別擴(kuò)增3G7 Tn5突變體G9和H5中的線性DNA，具體操作同1.2。切膠后用ZymocleanTM膠回收試劑盒純化回收樣品，1.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)所得純化線性DNA。

制備菌株4F6-pKD46的感受態(tài)細(xì)胞，制備過程中首先添加1 000×拷貝數(shù)誘導(dǎo)溶液于LB(CmrAmpr)培養(yǎng)液中培養(yǎng)1.5 h，其余操作同1.3中4F6菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備。電擊轉(zhuǎn)化方法同1.3，設(shè)置2個(gè)重復(fù)。細(xì)胞涂布于LB(CmrTetr)雙抗平板上，30 ℃培養(yǎng)，所生長(zhǎng)菌株分別命名為4F6-G9和4F6-H5。上述試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.5重組質(zhì)粒pKD46的消除

質(zhì)粒pKD46(Ampr)是溫敏型質(zhì)粒，溫度升高至42 ℃時(shí)可以較有效地消除該質(zhì)粒[5]。將出發(fā)菌株3G7和4F6轉(zhuǎn)接至LB平板(Ampr)以確認(rèn)其無氨芐青霉素抗性。之后將1.4所獲得的4F6-G9和4F6-H5突變株劃線至LB平板(CmrTetr)，42 ℃培養(yǎng)至平板上長(zhǎng)出菌落，所生長(zhǎng)菌落再次轉(zhuǎn)接至LB平板(Ampr)30 ℃培養(yǎng)。連續(xù)劃線2次，直到LB平板(Ampr)上無菌落形成。使用C23O F和C23O R引物，菌落PCR再次確認(rèn)4F6-G9和4F6-H5突變體，菌落PCR的具體操作同1.2。

1.6菌株間位苯環(huán)裂解活性的測(cè)定

鄰苯二酚2,3-雙加氧酶催化鄰苯二酚外開環(huán)即間位裂解，其裂解產(chǎn)物2-羥基粘糠酸半醛(2-HMS)是一種黃色物質(zhì)，最大吸收波長(zhǎng)為375 nm[6-8]，30 ℃下測(cè)定375 nm處吸光度增加值可以檢測(cè)C23O酶活，但此類方法操作繁瑣、耗時(shí)，操作過程中難以避免酶活損失。本研究在上述測(cè)量方法基礎(chǔ)上略作改進(jìn)，使用酶標(biāo)儀(Multi-detection microplate reader spectrophotometer)同時(shí)讀取各菌株的OD375和OD600值，連續(xù)檢測(cè)4 h，間隔0.5 h讀取數(shù)據(jù)，采用KC4 V3.4軟件分析記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

將原始出發(fā)菌株3G7和4F6及Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體出發(fā)菌株3G7-G9、3G7-H5和本試驗(yàn)構(gòu)建的4F6-G9、4F6-H5突變體進(jìn)行間位苯環(huán)裂解活性測(cè)定。具體測(cè)定方法為：分別接種上述菌株的單菌落至16 mL添加不同抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)；吸取3 mL新鮮培養(yǎng)液再次轉(zhuǎn)接至12 mL LB中，37 ℃培養(yǎng)4 h；9 000 r/min離心10 min，再次懸浮至5 mL LB中。準(zhǔn)備2種混合培養(yǎng)液：其一為在5 mL LB中添加5 μL拷貝數(shù)誘導(dǎo)溶液(1 000×)和5 μL布洛芬母液；其二為在5 mL LB中添加5 μL拷貝數(shù)誘導(dǎo)溶液(1 000×)和5 μL甲醇。將200 μL各細(xì)胞懸浮液分別接種至裝有2種(500 μL)混合培養(yǎng)液的EP離心管中，每菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37 ℃過夜培養(yǎng)，8 500 r/min離心2 min；用1 mL磷酸鹽緩沖液重新懸浮細(xì)胞，8 500 r/min再次離心2 min，細(xì)胞重新懸浮于200 μL磷酸鹽緩沖液中；將上述200 μL細(xì)胞懸浮液添加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用磷酸鹽緩沖液作1∶10稀釋2次，即吸取20 μL原始細(xì)胞懸浮液至另一孔中，添加180 μL磷酸鹽緩沖液充分混勻，并在各反應(yīng)孔中添加2 μL底物鄰苯二酚(10 mg/mL)；以不添加細(xì)胞懸浮液，僅包含180 μL磷酸鹽緩沖液和2 μL鄰苯二酚的細(xì)胞培養(yǎng)板作為空白對(duì)照。測(cè)定各菌株的間位苯環(huán)裂解活性(簡(jiǎn)寫為MC活性)，同時(shí)用OD375/OD600和mean V2/OD600表征MC活性，其中mean V2=ΔOD375/ΔT。式中，T為時(shí)間。

2結(jié)果與分析

2.13G7 Tn5突變體G9和H5的確認(rèn)

對(duì)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變株3G7-G9、3G7-H5的突變體進(jìn)行Tn5插入片段檢測(cè)，以確認(rèn)突變體中該轉(zhuǎn)座子的存在與否。使用C23O F和C23O R引物PCR擴(kuò)增存在于Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變株3G7-G9和3G7-H5中的C23O基因，據(jù)此確認(rèn)所構(gòu)建菌株3G7-G9和3G7-H5中確實(shí)存在Tn5插入片段，結(jié)果見圖1。

圖 1　3G7 Tn5突變體G9和H5的確認(rèn)

圖1顯示，3G7菌株擴(kuò)增出的C23O基因大約1.0 kb(泳道6)，從突變體3G7-G9和3G7-H5中擴(kuò)增出的C23O基因在2.0～3.0 kb(泳道1-4)，陰性對(duì)照(泳道5)無擴(kuò)增條帶。對(duì)比福斯質(zhì)粒文庫克隆菌株3G7中的C23O基因，Tn5轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致突變體菌株中擴(kuò)增出的C23O基因增加了1.0 kb多，證明Tn5確實(shí)存在于出發(fā)突變體菌株中。另外，已經(jīng)確認(rèn)3G7菌株中C23O基因在布洛芬降解基因簇中位于844-1 718 bp，Tn5插入位點(diǎn)在1 500 bp處，且Tn5的片段長(zhǎng)度約為1 100～1 200 bp(研究結(jié)果未發(fā)表)，這與圖1檢測(cè)結(jié)果相符。

2.24F6-G9和4F6-H5菌株的構(gòu)建

制備福斯質(zhì)粒克隆菌株4F6的感受態(tài)細(xì)胞后，將λ-red同源重組酶質(zhì)粒pKD46高壓電擊轉(zhuǎn)化至福斯質(zhì)?？寺【?F6的感受態(tài)細(xì)胞中，于LB(CmrAmpr)雙抗平板篩選到陽性轉(zhuǎn)化子4F6-pKD46若干，挑選8株單克隆4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增出的3G7 Tn5突變體G9和H5中的線性DNA條帶大小均在2.0～3.0 kb。分別合并3G7 Tn5突變體G9和H5 樣品，再用ZymocleanTM膠回收試劑盒濃縮提純?cè)摼€性DNA。將PCR獲得的3G7-G9和3G7-H5線性DNA，高壓電擊轉(zhuǎn)化至感受態(tài)受體細(xì)胞4F6-pKD46，篩選新的陽性轉(zhuǎn)化子4F6-G9和4F6-H5菌株，2批試驗(yàn)分別均得到了陽性轉(zhuǎn)化子4F6-G9和4F6-H5菌株(表2)，第1批試驗(yàn)30 ℃培養(yǎng)56 h，突變體4F6-G9克隆數(shù)較多；第2批試驗(yàn)30 ℃培養(yǎng)38 h，陽性轉(zhuǎn)化子4F6-H5克隆數(shù)居多。

表 2　LB CmrTetr雙抗平板上4F6的Tn5突變體克隆數(shù)

注：克隆數(shù)分別為2個(gè)平板上的數(shù)據(jù),2次試驗(yàn)所挑選的4F6突變體在42 ℃培養(yǎng)。

Note:Colony numbers are the numbers in the two plates.All selected 4F6 mutants from two tests were incubated at 42 ℃.

2.34F6-G9和4F6-H5突變體的確認(rèn)

突變體4F6-G9和4F6-H5消除pKD46質(zhì)粒1次后，用C23O F和C23O R引物進(jìn)行菌落PCR確認(rèn)4F6-G9和4F6-H5突變體，結(jié)果見圖2。圖2顯示，質(zhì)粒消除1次后，4F6-G9和4F6-H5中擴(kuò)增所得C23O基因大小為1～1.6 kb(lane 2-4)，陽性對(duì)照4F6菌株中約為1.0 kb。借助來自pKD46質(zhì)粒的λ-red同源重組酶，Tn5片段同源重組(敲除)取代了部分C23O基因，但是重組結(jié)合于4F6受體菌中的該Tn5片段可能小于位于C23O基因內(nèi)的被取代片段，因此該條帶并未出現(xiàn)在2.0～3.0 kb內(nèi)。42 ℃下pKD46質(zhì)粒被消除2次后，Ampr平板上無菌落形成。初步表明已經(jīng)成功消除了4F6 Tn5突變體內(nèi)的質(zhì)粒pKD46。

以4F6-G9和4F6-H5為模板的PCR檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明，擴(kuò)增出的C23O基因與陽性對(duì)照3G7-G9和3G7-H5均在2.0～3.0 kb，結(jié)合LB抗性平板試驗(yàn)，可以推斷借助pKD46質(zhì)粒的λ-red同源重組酶，將轉(zhuǎn)座子Tn5從福斯質(zhì)粒文庫陽性克隆菌株3G7電擊轉(zhuǎn)化至另一克隆菌株4F6，并且消除了pKD46質(zhì)粒，敲除了4F6菌株中的C23O基因，構(gòu)建獲得了4F6-G9和4F6-H5突變體。

圖 2　pKD46質(zhì)粒消除1次后4F6 Tn5突變體的PCR確認(rèn)

2.4突變體菌株間位苯環(huán)的裂解活性

將原始出發(fā)菌株3G7和4F6及Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體出發(fā)菌株3G7-G9、3G7-H5和本試驗(yàn)構(gòu)建的4F6-G9、4F6-H5突變體進(jìn)行間位苯環(huán)裂解活性測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見圖4。

圖 4　供試菌株的間位苯環(huán)裂解活性分析

福斯質(zhì)粒文庫克隆菌株4F6的MC活性高于菌株3G7，添加布洛芬誘導(dǎo)后，4F6的MC活性明顯高于3G7。4株突變株的MC活性均比出發(fā)菌株3G7和4F6低，添加布洛芬誘導(dǎo)后結(jié)果相同(圖4)。4株突變株OD375/OD600值幾乎與3G7出發(fā)菌株相同(圖4B)。上述數(shù)據(jù)表明，從原始出發(fā)菌株4F6敲除C23O基因后所構(gòu)建的4F6突變株幾乎具有與3G7 突變株相同的MC活性。盡管4F6-G9菌株比3G7-G9菌株MeanV2/OD600值略高(圖4A)，但仍低于出發(fā)菌株3G7的MeanV2/OD600值。

結(jié)合PCR檢測(cè)結(jié)果(圖3)可以推斷，4F6菌株中僅有1個(gè)C23O基因。之前提出的4F6可能有2個(gè)C23O基因的假設(shè)[3]不成立。這意味著需將研究重點(diǎn)集中于尋求3G7和4F6菌株中可能存在的不同正或者負(fù)調(diào)控因子。

3討論

基因敲除是20世紀(jì)80年代后期基于DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)，微生物基因敲除的傳統(tǒng)方法是利用其自身的RecA重組系統(tǒng)。RecA重組系統(tǒng)是由RecA和RecBCD組成的E.coli內(nèi)源性同源重組機(jī)構(gòu)[9]。Murphy[10]首先利用噬菌體λ的重組功能，采用線性dsDNA構(gòu)建了重組分子，此結(jié)果拉開了用噬菌體λ的Red重組系統(tǒng)在E.coli中快速敲除原核基因研究工作的序幕。Red重組需要2個(gè)基因：redα與redβ?；颚廉a(chǎn)物是作用于線性雙鏈DNA的5′-3′外切酶；基因β產(chǎn)物結(jié)合于單鏈 DNA上，激發(fā)互補(bǔ)鏈退火，但不能促進(jìn)DNA鏈的插入和自身交換[11-12]。噬菌體λ編碼的Gam蛋白抑制了宿主細(xì)胞中RecBCD的活性，從而輔助redα與redβ產(chǎn)物的重組功能[13]。Murphy等[10,14]研究表明，λ-Red介導(dǎo)的重組率比RecA重組系統(tǒng)高10～100倍，因?yàn)楸灰胧荏w的噬菌體編碼的蛋白質(zhì)促進(jìn)了同源重組，Red同源重組操作在E.coli以及其他細(xì)菌菌株中均是可行的。

目前，許多研究者廣泛使用Red同源重組系統(tǒng)[15-20]，在微生物代謝工程領(lǐng)域，應(yīng)用Red同源重組技術(shù)敲除生物代謝途徑中的關(guān)鍵基因，構(gòu)建突變體菌株，改變其代謝流分布，從而構(gòu)建新的代謝途徑。研究者們利用Red同源重組技術(shù)敲除了大腸桿菌的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因ptsG，分別構(gòu)建了ptsG基因缺陷株DH5aP、JM109P[15]以及SZ470P[16]。薛可等[18]利用該系統(tǒng)成功敲除了CSN2質(zhì)粒上的β酪蛋白基因的編碼區(qū)，為制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及乳腺生物反應(yīng)器的研究提供了可能。曲璟秋等[20]利用大腸桿菌BW25113單基因缺失體Keio文庫，將經(jīng)典的Red同源重組技術(shù)與P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)E.coliMG1655脂肪酸代謝基因進(jìn)行快速敲除，獲得了大腸桿菌缺失菌株，簡(jiǎn)化了構(gòu)建大腸桿菌單基因和多重突變體的方法。Fu等[21]報(bào)道了一種基于RecET的直接克隆技術(shù)結(jié)合高通量DNA測(cè)序技術(shù)的研究方法，發(fā)現(xiàn)Red體系和RecET體系有著本質(zhì)區(qū)別：即Red體系對(duì)于催化線性分子和環(huán)狀分子之間的重組更為有效，而RecET體系能高效地催化兩個(gè)線性DNA分子的同源重組。

應(yīng)用Red系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除可直接利用線性打靶DNA，兩側(cè)同源臂長(zhǎng)度為35～60 bp時(shí)即可發(fā)生同源重組且重組效率高。本試驗(yàn)以3G7的Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變株為出發(fā)菌株，借助Red同源重組系統(tǒng)，使得菌株4F6的C23O基因插入失活，成功構(gòu)建了4F6-G9和4F6-H5突變體。本研究盡管是利用傳統(tǒng)的DNA同源重組系統(tǒng)，但是仍然準(zhǔn)確便捷地敲除了菌株4F6的鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因，構(gòu)建了其Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體。該結(jié)果再次印證了“Red體系對(duì)于催化線性分子和環(huán)狀分子之間的重組更為有效[21]”的觀點(diǎn)。由于同源重組發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，大腸桿菌的復(fù)制、修復(fù)系統(tǒng)保證了克隆分子完全忠實(shí)于親代分子，因此該技術(shù)是傳統(tǒng)基因工程與PCR技術(shù)的一種很好的補(bǔ)充[18]。本研究為布洛芬降解基因克隆、降解調(diào)節(jié)因子的基因定位提供了可供選擇的簡(jiǎn)便方法，亦為從分子水平闡明布洛芬的微生物降解機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

志謝：感謝國(guó)家留學(xué)基金委資助開展本研究的部分試驗(yàn)內(nèi)容，感謝康奈爾大學(xué)微生物系副教授Dr.Anthony G.Hay提供菌株和質(zhì)粒等研究材料。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Murdoch R W,Hay A G.Formation of catechols via removal of acid side chains from ibuprofen and related aromatic acids [J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(10):6121-6125.

[2]Murdoch R W,Hay A G.Genetic and chemical characterization of ibuprofen degradation bySphingomonasIbu-2 [J].Microbiology,2013,159(3):621-632.

[3]衛(wèi)亞紅,劉杰,曲東.布洛芬微生物降解研究進(jìn)展 [J].微生物學(xué)報(bào),2011,51(5):586-594.

Wei Y H,Liu J,Qu D.Recent advances in microbial degradation of ibuprofen：A review [J].Acta Microbiologica Sinica,2011,51(5):586-594.(in Chinese)

[4]周敏,代玉梅,鐘莉,等.鏈霉菌小質(zhì)粒 pDYM4.3k的復(fù)制與接合轉(zhuǎn)移 [J].微生物學(xué)報(bào),2012,52(7):916-920.

Zhou M,Dai Y M,Zhong L,et al.Replication and conjugation of streptomyces small plasmid pDYM4.3k [J].Acta Microbiologica Sinica,2012,52(7):916-920.(in Chinese)

[5]Datsenko K A,Wanner B L.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products [J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,2000,97(12):6640-6645.

[6]Nozaki M.Metapyrocatechase [J].Aromatic Amino Acids,1970,65:522-525.

[7]Sala-Trepat J M,Evans W C.The meta cleavage of catechol byAzotobacterspecies [J].European Journal of Biochemistry,1971,20(3):400-413.

[8]楊軒,張威,李師翁,等.多環(huán)芳烴降解菌的分離鑒定及其生理特性研究 [J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(5):1033-1040.

Yang X,Zhang W,Li S W,et al.Study on isolation,identification and physiological characteristics of PAHs degrading bacteria [J].Acta Scientiae Circumstantiae,2012,32(5):1033-1040.(in Chinese)

[9]胡堃,史兆興,賽道建,等.Red重組系統(tǒng)及在微生物基因敲除中的應(yīng)用 [J].遺傳,2003,25(5):628-632.

Hu K,Shi Z X,Sai D J,et al.The Red recombination system and its application to gene knock-out in microorganism [J].Hereditas,2003,25(5):628-632.(in Chinese)

[10]Murphy K C.Use of bacteriophage λ recombination functions to promote gene replacement inEscherichiacoli[J].Journal of Bacteriology,1998,180:2063-2071.

[11]Muniyappa K,Shaner S L,Tsang S S,et al.Mechanism of the concerted action of recA protein and helix-destabilizing proteins in homologous recombination [J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1984,81:2757-2761.

[12]Takahashi N,Kobayashi I.Evidence for the double-strand bre-ak repair model of bacteriophage λ recombination [J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1990,87:2790-2794.

[13]Murphy K C.λ Gam protein inhibits the helicase and chi-stimulated recombination activities ofEscherichiacoliRecBCD enzyme [J].Journal of Bacteriology,1991,173:5808-5821.

[14]Murphy K C,Campellone K G,Poteete A R.PCR-mediated gene replacement inEscherichiacoli[J].Gene,2000,246:321-330.

[15]韓聰,張惟材,游松,等.大腸桿菌ptsG基因敲除及其缺陷株生長(zhǎng)特性研究 [J].生物工程學(xué)報(bào),2004,20(1):16-20.

Han C,Zhang W C,You S,et al.Knockout of the ptsG gene inEscherichiacoliand cultural characterization of the mutants [J].Chinese Journal of Biotechnology,2004,20(1):16-20.(in Chinese)

[16]嚴(yán)濤,趙錦芳,高文慧,等.大腸桿菌工程菌ptsG基因敲除及其缺陷株混合糖同型乙醇發(fā)酵 [J].生物工程學(xué)報(bào),2013,29(7):937-945.

Yan T,Zhao J F,Gao W H,et al.Knockout of the ptsG gene in engineeredEscherichiacolifor homoethanol fermentation from sugar mixture [J].Chinese Journal of Biotechnology,2013,29(7):937-945.(in Chinese)

[17]汪莉,王玉民.用Red 重組系統(tǒng)快速敲除大腸桿菌aroL和aroK基因 [J].軍事醫(yī)學(xué)院院刊,2007,31(4):308-311.

Wang L,Wang Y M.Quick knockout of aroK and aroL genes from the chromosome ofE.coliBW25113 by using Red system [J].Bulletin of the Academy of Military Medical Science,2007,31(4):308-311.(in Chinese)

[18]薛可,李峰,羅光彬,等.利用Red同源重組系統(tǒng)進(jìn)行牛β酪蛋白基因敲除 [J].遺傳,2007,29(5):570-574.

Xue K,Li F,Luo G B,et al.Knock out of bovine beta casein gene by homologous recombination [J].Hereditas,2007,29(5):570-574.(in Chinese)

[19]黃靜,史建明,劉倩,等.pta基因敲除對(duì)L-色氨酸發(fā)酵的影響 [J].微生物學(xué)報(bào),2011,51(4):480-487.

Huang J,Shi J M,Liu Q,et al.Effects of gene pta disruption on L-tryptophan fermentation [J].Acta Microbiologica Sinica,2011,51(4):480-487.(in Chinese)

[20]曲璟秋,劉翠花,劉偉豐,等.應(yīng)用基因敲除快速構(gòu)建大腸桿菌突變體改造脂肪酸代謝途徑 [J].微生物學(xué)報(bào),2013,53(6):608-614.

Qu J Q,Liu C H,Liu W F,et al.Construction ofEscherichiacoligene knock-out mutants for engineering of fatty acid metabolism [J].Acta Microbiologica Sinica,2013,53(6):608-614.(in Chinese)

[21]Fu J,Bian X Y,Hu S B,et al.Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning and bioprospecting [J].Nature Biotechnology,2012,30:440-446.

Construction of transposon insertion mutants for ibuprofen degradable cloning strains from Fosmid Library

WEI Ya-hong1a,1b,1c,DUAN Min1a,XIANG Zhao-ju2,QU Dong1d,WANG Yao1a

(1 aCollegeofLifeSciences,bStateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,cBiomassEnergyCenterforAridandSemi-AridLands,dCollegeofNaturalResourcesandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2CollegeofLifeSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710062,China)

Abstract:【objective】 The C23O gene was knocked out from ibuprofen clone strain 4F6 and its Tn5 transposon insertion mutants were constructed to provide basis for understanding factors affecting ibuprofen degradation.【Method】 Tn5 transposon was transferred from clone 3G7 to 4F6 through electroporation mediated with λ-red homologous recombinase of pKD46 plasmid.After curing pKD46 plasmid and knocking out C23O gene from 4F6,the meta-cleavage activities of Tn5 mutants of 3G7-G9,3G7-H5,4F6-G9 and 4F6-H5 were measured and compared. 【Result】 The Tn5 mutants of 4F6-G9 and 4F6-H5 were constructed after curing pKD46 plasmid at 42 ℃.No significant differences among Tn5 mutants (3G7-G9,3G7-H5,4F6-G9,and 4F6-H5) were observed from meta-cleavage activity assays.4F6 had higher meta-cleavage activity than 3G7 during the ibuprofen and non-ibuprofen treatments.Since there was only one C23O gene,the meta-cleavage activity differences between strains 3G7 and 4F6 may due to ibuprofen degradation regulators.【Conclusion】 This research provides a simple and efficient method to target and knockout C23O gene.

Key words:ibuprofen degradable fosmid;Tn5 mutants;gene knockout

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.019

[收稿日期]2014-08-21

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31070453)；陜西省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2013KW-29)；西北農(nóng)林科技大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)(QN2011113)；西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)際科技合作項(xiàng)目(A213021311)

[作者簡(jiǎn)介]衛(wèi)亞紅(1973-)，女，陜西扶風(fēng)人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。

[中圖分類號(hào)]Q933

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)04-0135-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.038.html

E-mail:yahongwei@nwsuaf.edu.cn