象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶新基因Me—pel2的鑒定及發(fā)育表達(dá)分析

龍海波　孫燕芳　曾凡云　彭軍　白成

摘 要 利用EST結(jié)合RACE方法從象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）中克隆一個(gè)新的果膠酸裂解酶基因Me-pel2（GenBank登錄號(hào)KP987180）。Me-pel2 cDNA開放閱讀框全長(zhǎng)834 bp，推導(dǎo)編碼277個(gè)氨基酸殘基的蛋白，屬于多糖裂解酶第III家族新成員。Me-PEL2與南方根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶Mi-PEL3氨基酸具有較高的一致性，為54%。發(fā)育表達(dá)結(jié)果顯示，Me-pel2在2齡幼蟲和雄蟲期高豐度表達(dá)，而在固著期寄生階段轉(zhuǎn)錄水平急劇下降，推測(cè)Me-pel2主要在象耳豆根結(jié)線蟲遷移性階段起重要作用，通過降解寄主細(xì)胞壁果膠質(zhì)成分，協(xié)助幼蟲侵入寄主以及在寄主體內(nèi)遷移。

關(guān)鍵詞 象耳豆根結(jié)線蟲；果膠酸裂解酶；基因克隆；發(fā)育表達(dá)類型

中圖分類號(hào) S436.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Cloning and identifying parasitism genes are the keys to understand the molecular basis on nematode parasitism of plants. In this study， a new pectate lyase gene Me-pel2（GenBank accession no. KP987180）was cloned from the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii by EST analysis and RACE technology. The open reading frame of Me-pel2 cDNA was 834 bp long and encoded a deduced 277 amino acid sequnce belonging to polysaccharide lyases famlily III. The deduced protein Me-PEL2 shared high identity（54%）with pectate lyase Mi-PEL3 from M. incognita. Semiquantitive RT-PCR analysis confirmed that Me-pel2 transcripts were strongly detected in motile stages（second stage juveniles and adult males）and were weak in sedentary stages. These results indicated that Me-PEL2 may play a role in plant cell wall-degrading during the penetration and migration of M. enterolobii in plant tissues.

Key words Meloidogyne enterolobii； Pectate lyase； Gene clone； Developmental expression pattern

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.017

象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）屬于熱帶根結(jié)線蟲種類，在亞洲、非洲和歐美等地區(qū)均有發(fā)生分布，具有寄主范圍廣、毒性強(qiáng)和危害大的特點(diǎn)，并且能在攜帶Mi抗原基因的辣椒和番茄上寄生繁殖[1-5]。象耳豆根結(jié)線蟲是中國(guó)華南地區(qū)最為重要的根結(jié)線蟲種類之一，在廣東和海南為害多種蔬菜和熱帶水果作物并造成重大損失，然而目前依然缺乏有效的防治措施[6-10]。分離和鑒定象耳豆根結(jié)線蟲致病因子是了解其分子寄生致病機(jī)制和提出新防治策略的重要基礎(chǔ)。植物線蟲在寄生過程中，一方面利用其特有的口針猛烈穿刺破壞細(xì)胞壁物理結(jié)構(gòu)，另一方面通過分泌一系列的細(xì)胞壁降解酶，打斷或消除細(xì)胞壁化學(xué)作用力達(dá)到松弛和降解細(xì)胞壁成分的目的，從而協(xié)助線蟲侵入寄主以及在寄主體內(nèi)遷移[11]。果膠酸裂解酶（Pectate Lyase，PEL）是細(xì)胞壁降解酶的一種，通過β-消除法裂解脫甲基或低甲酯的同型聚半乳糖醛羧（果膠酸）之間的α-1，4糖苷鍵，起降解細(xì)胞壁主要成分果膠質(zhì)的作用[12]。果膠酸裂解酶可由細(xì)菌、真菌、線蟲和植物等有機(jī)體產(chǎn)生，分布在多糖裂解酶家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅸ和Ⅹ等5個(gè)家族，目前已鑒定的植物線蟲源果膠酸裂解酶均屬于多糖裂解酶第Ⅲ家族成員。2000年P(guān)opeijus等[13]從馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensis）中分離克隆了第一個(gè)植物寄生線蟲果膠酸裂解酶基因Gr-pel1，其編碼的蛋白具有酶活性功能，這也是首個(gè)動(dòng)物非共生降解果膠質(zhì)的實(shí)例。Doyle等[14]利用免疫定位證實(shí)了爪哇根結(jié)線蟲（Meloidoyne javanica）中克隆的果膠酸裂解酶Mj-pel1的編碼產(chǎn)物能夠被分泌到體外起作用。近10年來，國(guó)內(nèi)外又先后從大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines）、南方根結(jié)線蟲（M. incognita）、松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）、甜菜孢囊線蟲（H. Schachtii）和象耳豆根結(jié)線蟲（M. enterolobii）等一些重要植物線蟲中分離克隆了多個(gè)果膠酸裂解酶基因[15-20]。Vanholme等[18]利用RNA干擾技術(shù)（RNA interference， RNAi）將甜菜孢囊線蟲Hs-pel2沉默后，導(dǎo)致線蟲的侵染率下降了50%以上。Bakhetia等[21]和Sukno等[22]先后對(duì)大豆孢囊線蟲果膠酸裂解酶基因Hg-pel1利用RNAi沉默，結(jié)果顯示，大豆孢囊線蟲雌蟲數(shù)量大幅度減少，而雄蟲數(shù)量增多。卓侃等[20]用RNAi使象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解基因Me-pel1沉默下調(diào)表達(dá)，引起侵染性2齡幼蟲對(duì)攜帶Mi抗性基因和不攜帶Mi的番茄栽培品種的侵染率顯著下降。一系列研究結(jié)果表明，果膠酸裂解酶是植物線蟲侵染寄生過程中分泌的一類重要致病因子。

本研究通過克隆果膠酸裂解酶Me-pel2基因全長(zhǎng)并分析其發(fā)育表達(dá)類型，了解Me-pel2在象耳豆根結(jié)線蟲寄生過程中的作用特點(diǎn)和功能地位，為闡明線蟲-寄主互作提供新的分子數(shù)據(jù)，同時(shí)為防治象耳豆根結(jié)線蟲提供候選靶標(biāo)基因。

1 材料與方法

1.1 材料

供試象耳豆根結(jié)線蟲種群源于海南樂東佛羅鎮(zhèn)的辣椒病根，并經(jīng)溫室內(nèi)單卵囊純化培養(yǎng)，接種寄主為番茄（cv. 特級(jí)大明星）。

1.2 方法

1.2.1 線蟲分離與收集 取象耳豆根結(jié)線蟲單卵囊接種90 d左右的番茄病根，經(jīng)1%的食用色素亮藍(lán)染色后于解剖鏡下挑取根表面的卵囊，并在室溫25 ℃條件下孵化獲得，2齡幼蟲。取接種2齡幼蟲（約100 000頭）第2天、第7天和第13天的番茄病根，參照Ding等[23]描述的方法分離收集根內(nèi)不同發(fā)育階段的幼蟲蟲體。取接種2齡幼蟲35 d的番茄病根，解剖鏡下用挑針直接從根內(nèi)分離獲得雌成蟲。獲得的各蟲體經(jīng)無菌的PBS緩沖液清洗，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或保存于液氮中備用。

1.2.2 核酸提取與合成 采用TRIzol法提取象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲及各蟲態(tài)的總RNA，具體操作步驟按照說明書進(jìn)行（Invitrogen）。利用FastQuant RT（with gDNase）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，操作步驟按照說明書進(jìn)行（TIANGEN）。利用GeneRacerTM RACE 試劑盒（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄合成含5′及3′末端接頭的RACE模板，具體步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.3 Me-pel2 cDNA全長(zhǎng)克隆 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已獲得的象耳豆根結(jié)線蟲cDNA文庫序列信息，設(shè)計(jì)Me-pel2基因末端擴(kuò)增特異引物Me-E1（AGCGCCT

CCTCCATCTACGATATATG）和Me-E2（TCAACACAA

TATACATATATCGTAG）。利用RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得Me-pel2基因5′及3′末端序列，其中5′RACE-PCR所用引物為Me-E1和GeneRacerTM 5′primer（CGACTGGAGCACGAGGACACTGA），反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Mg2+ 4 μL，上下游引物各2 μL，Ex taq酶0.5 μL， RACE模板1 μL，滅菌雙蒸水31.5 μL。褪火溫度為56 ℃，共35個(gè)循環(huán)。3′RACE-PCR所用引物為Me-E2和GeneRacerTM 3′primer（GCTGTCAACGATACGCTACG

TAACG），反應(yīng)體系與5′RACE-PCR一致。褪火溫度為58 ℃，35個(gè)循環(huán)。根據(jù)所獲的末端序列，設(shè)計(jì)Me-pel2 cDNA全長(zhǎng)特異引物MeP2-F（ATGCTTA

ATATATTAATTTTAATTATTT）和MeP2-R（TCAATT

GACCACTTTAAAT），擴(kuò)增Me-pel2 cDNA全長(zhǎng)。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Mg2+ 4 μL，上下游引物各2 μL，Ex taq酶0.5 μL，cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水31.5 μL。褪火溫度為55 ℃，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，純化連接至pGM-T載體（TIANGEN），送華大基因公司測(cè)序。

1.2.4 半定量RT-PCR 應(yīng)用Oligotex mRNA Mini（QIAGEN）試劑盒，參照說明書對(duì)提取的象耳豆根結(jié)線蟲各蟲態(tài)總RNA進(jìn)行純化，獲得mRNA。取各蟲態(tài)等量mRNA（200 ng）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以第一鏈為模板，結(jié)合Me-pel2特異引物RT-F（GGTTCAGTCATTAGTGGCTACAA）和RT-R（AACA

ATCGTTAAATCTCGTTGAT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)利用引物ActinF（AACCTCTGCCCCTTCTTGTGCTG）和ActinR（AACGTTCAACGCCCAATGAAAGT）擴(kuò)增β-actin基因作為陽性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系參照3′RACE-PCR，褪火溫度為58 ℃，設(shè)置28和35兩個(gè)循環(huán)數(shù)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 序列分析 序列比對(duì)和同源性搜索在NCBI網(wǎng)上進(jìn)行（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。應(yīng)用Signal P v 4.0進(jìn)行信號(hào)肽及切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)。蛋白分子量和等電點(diǎn)由在線軟件PROTEIN MACHINE預(yù)測(cè)（http：//us.expasy.org/tools/）。利用MEGA 6.0 軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹步長(zhǎng)重復(fù)數(shù)為1 000次[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Me-pel2 cDNA克隆與序列分析

通過5′和3′RACE-PCR反應(yīng)分別獲得了長(zhǎng)度為463 bp的5′末端及長(zhǎng)度為525 bp的3′末端序列，而根據(jù)末端序列所設(shè)計(jì)的Me-pel2基因全長(zhǎng)特異引物擴(kuò)增獲得了一個(gè)長(zhǎng)度為800 bp左右的條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果證實(shí)該序列實(shí)際長(zhǎng)度為834 bp，為一個(gè)完整的開放閱讀框，起始密碼子ATG，終止密碼子為TGA，推導(dǎo)編碼長(zhǎng)度為277個(gè)氨基酸的蛋白序列。相似性搜索比對(duì)（Blastx）顯示，該cDNA與NCBI數(shù)據(jù)庫中根結(jié)線蟲、孢囊線蟲等植物寄生線蟲以及一些真菌和細(xì)菌的果膠酸裂解酶基因同源，一致性在16%～54%之間。同時(shí)，該cDNA編碼的氨基酸序列含有一個(gè)果膠酸裂解酶保守結(jié)構(gòu)域，位于亮氨酸Leu73至纈氨酸Val244之間。因此，從象耳豆根結(jié)線蟲中克隆獲得的cDNA全長(zhǎng)序列為一個(gè)新的果膠酸裂解酶基因，筆者將其命名為Me-pel2，并在NCBI GenBank提交注冊(cè)，登錄號(hào)為KP987180。

2.2 Me-PEL2蛋白特征及系統(tǒng)進(jìn)化分析

象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶Me-PEL2蛋白序列由277個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測(cè)分子量為29.86 ku，等電點(diǎn)pI為8.67。Signal P軟件預(yù)測(cè)Me-PEL2蛋白N端含有一個(gè)起分泌功能的信號(hào)肽前體序列，長(zhǎng)度為16個(gè)氨基酸殘基，剪切位點(diǎn)位于丙氨酸Ala16與異亮氨酸Ile17之間（圖2）。BlastP 搜索結(jié)果顯示，Me-PEL2與南方根結(jié)線蟲（M. incognita）果膠酸裂解酶Mi-pel3（GenBank No： AY861685）具有較高的一致性，為54%。Me-PEL2與植物線蟲的其它果膠酸裂解酶一致性均較低，其中與孢囊線蟲果膠酸裂解酶一致性在30%～33%之間，而與象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶Me-pel1（HQ180169）的一致性僅為23%。保守結(jié)構(gòu)域搜索及多序列比對(duì)結(jié)果表明，象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶Me-PEL2屬于多糖裂解酶第Ⅲ家族，具有第Ⅲ家族典型特征的4個(gè)高度保守區(qū)域，且含多個(gè)保守的半胱氨酸殘基和帶正電荷殘基，為果膠酸裂解酶的活性位點(diǎn)（圖2）。

從GenBank中選取與Me-PEL2具有同源性的30個(gè)植物寄生線蟲、細(xì)菌和真菌的果膠酸裂解酶氨基酸序列，運(yùn)用MEGA6.0軟件鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果顯示，植物寄生線蟲的果膠酸裂解酶聚為4個(gè)進(jìn)化分支，分別為NematodeⅠ、NematodeⅡ、NematodeⅢ和NematodeⅣ（圖3）。象耳豆根結(jié)線蟲Me-PEL1和Me-PEL2屬于不同分支，其中Me-PEL1與南方根結(jié)線蟲Mi-PEL1、爪哇根結(jié)線蟲Mj-PEL1形成一個(gè)小的分支（NematodeⅠ），并且與來自細(xì)菌和真菌的果膠酸裂解酶聚為一個(gè)較大的分支。Me-PEL2與南方根結(jié)線蟲Mi-PEL2和Mi-PEL3，以及擬禾本科根結(jié)線蟲Mg-PEL1聚為一個(gè)小的獨(dú)立分支（NematodeⅢ）。多個(gè)孢囊線蟲果膠酸裂解酶基因包括大豆孢囊線蟲Hg-PEL1，Hg-PEL2和Hg-PEL5、甜菜孢囊線蟲Hs-PEL1、馬鈴薯白線蟲Gp-PEL、馬鈴薯金線蟲Gr-PEL1以及煙草孢囊線蟲Gts-PEL1和Gv-PEL1聚為一個(gè)大的分支（NematodeⅣ）。其余植物線蟲果膠酸裂解酶包括甜菜孢囊線蟲Hs-PEL2、馬鈴薯金線蟲Gr-PEL2、燕麥真滑刃線蟲Aa-PEL1和Aa-PEL2、松材線蟲Bx-PEL1和Bx-PEL2以及擬松材線蟲Bm-PEL1和Bm-PEL2則構(gòu)成另外一個(gè)較大的分支Nematode PEL3-II。

2.3 Me-pel2在根結(jié)線蟲各蟲態(tài)的表達(dá)

通過運(yùn)用RT-PCR分析象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶基因Me-pel2在卵期，侵染前2齡幼蟲，侵染期2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲、雌成蟲及雄蟲等蟲態(tài)的發(fā)育表達(dá)特征。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，Me-pel2在象耳豆根結(jié)線蟲各蟲態(tài)均有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但表達(dá)豐度不同（圖4）。以象耳豆根結(jié)線蟲在各蟲態(tài)穩(wěn)定表達(dá)的持家基因β-actin為對(duì)照，Me-pel2 在侵染前和侵染期2齡幼蟲中以及雄蟲階段表達(dá)量相對(duì)最高，電泳條帶清晰明顯，而在卵期表達(dá)量次之。在3齡、4齡幼蟲以及雌成蟲期，Me-pel2轉(zhuǎn)錄豐度顯著降低，電泳檢測(cè)信號(hào)微弱。

3 討論與結(jié)論

克隆和鑒定植物線蟲寄生致病相關(guān)基因是解析其分子寄生機(jī)制的關(guān)鍵途徑，也是當(dāng)今國(guó)際植物線蟲學(xué)研究的熱點(diǎn)方向。果膠酸裂解酶作為關(guān)鍵植物細(xì)胞壁降解酶類之一，在植物寄生線蟲成功侵染寄生過程中具有重要地位，參與到植物線蟲侵入寄主、在寄主體內(nèi)遷移以及誘導(dǎo)取食位點(diǎn)形成等過程[21，25-27]。本研究從象耳豆根結(jié)線蟲中克隆了一個(gè)新的果膠酸裂解酶基因Me-pel2，編碼蛋白Me-PEL2的N端含有16個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，同時(shí)內(nèi)部有4個(gè)保守肽段和多個(gè)半胱氨酸殘基，符合多糖裂解酶第Ⅲ家族特征[13，28]，確定Me-PEL2為多糖裂解酶第Ⅲ家族新成員。

象耳豆根結(jié)線蟲Me-PEL2與其它植物寄生線蟲果膠酸裂解酶一致性在20%～54%之間，與真菌和細(xì)菌的果膠酸裂解酶進(jìn)行聚類分析的結(jié)果中，植物線蟲果膠酸裂解酶并沒有形成一個(gè)共同的進(jìn)化分支，而是分散在4個(gè)獨(dú)立的分支，該結(jié)果與一些文獻(xiàn)所報(bào)道相似[17，29]。半定量PCR研究結(jié)果表明，象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶基因Me-pel2在遷移性幼蟲和雄蟲期表達(dá)豐度最高，而在固著期寄生階段轉(zhuǎn)錄水平急劇下降，該結(jié)果與南方根結(jié)線蟲3個(gè)果膠酸裂解酶基因的發(fā)育表達(dá)類型一致[16]。結(jié)果說明，果膠酸裂解酶基因的表達(dá)及其產(chǎn)物的分泌與植物線蟲寄生行為密切相關(guān)。象耳豆根結(jié)線蟲屬于專性固著性內(nèi)寄生，僅在侵染性2齡幼蟲和雄蟲期具有遷移能力，Me-pel2在2齡幼蟲和雄蟲期高豐度表達(dá)，表明其蛋白產(chǎn)物主要在遷移性寄生階段起作用，通過降解寄主細(xì)胞壁果膠質(zhì)成分，協(xié)助線蟲侵入寄主（2齡幼蟲）以及在寄主體內(nèi)遷移（侵染期2齡幼蟲和雄蟲）。在3齡幼蟲、4齡幼蟲和雌成蟲期，象耳豆根結(jié)線蟲呈固著態(tài)從取食位點(diǎn)攫取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些發(fā)育階段Me-pel2表達(dá)量顯著降低，表明其蛋白產(chǎn)物在寄生階段后期的發(fā)育過程不具有重要作用。此外，Me-pel2在卵期表達(dá)量也相對(duì)較高，推測(cè)可能是已有卵塊即將蛻皮發(fā)育成侵染性，2齡幼蟲，Me-pel2開始誘導(dǎo)表達(dá)有助于孵化后能夠立即侵染寄主植物。

象耳豆根結(jié)線蟲能夠突破Mi介導(dǎo)的抗性反應(yīng)，在對(duì)南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲等多種根結(jié)線蟲具有抗性的作物上寄生繁殖，表明其與寄主植物建立親和互作關(guān)系，具有獨(dú)特的分子機(jī)制。然而，目前有關(guān)象耳豆根結(jié)分子致病機(jī)理的研究還處于初始階段，有關(guān)象耳豆根結(jié)線蟲寄生致病相關(guān)基因的報(bào)道很少。本研究克隆鑒定了一個(gè)新的果膠酸裂解酶基因Me-pel2，通過研究Me-pel2序列特征和發(fā)育表達(dá)類型，為解析Me-pel在象耳豆根結(jié)線蟲寄生過程中的作用特點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為了解象耳豆根結(jié)線蟲的分子寄生致病機(jī)理提供，新的分子證據(jù)，后續(xù)研究中可結(jié)合利用RNAi技術(shù)進(jìn)一步對(duì)Me-pel2進(jìn)行功能驗(yàn)證。

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責(zé)任編輯：趙軍明