海南飛機(jī)草病原真菌鑒定、致病力測(cè)定及其寄主范圍分析

李雨龍　楊葉　韋誠(chéng)　符旖晴

摘 要 對(duì)海南多個(gè)市縣的飛機(jī)草發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)研發(fā)現(xiàn)，飛機(jī)草葉斑病受自然環(huán)境及病菌種類(lèi)的影響，從發(fā)病樣品上分離獲得46株病原真菌。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察與分子鑒定比對(duì)，確定飛機(jī)草的重要病原真菌分別為：鏈格孢Alternaria alternata、新月彎孢Curvularia lunata和尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporu。通過(guò)離體葉片針刺法和活體接種法對(duì)病源真菌致病力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，強(qiáng)致病力菌株12個(gè)（占26.09%），中等致病力菌株13個(gè)（占28.26%），弱致病力菌株19個(gè)（占41.30%），無(wú)致病力菌株2個(gè)（占4.3%），其中鏈格孢菌株LGB100501、LGB100401和彎孢菌株WB110216表現(xiàn)出較高的致病力。利用11個(gè)高致病力菌株針對(duì)8種海南常見(jiàn)雜草進(jìn)行寄主范圍測(cè)試，結(jié)果表明，不同菌株致病力存在差異，僅有13.6%的供試雜草對(duì)這些菌株表現(xiàn)出高度和中度感病。

關(guān)鍵詞 海南；飛機(jī)草；病原真菌；致病力；寄主范圍

中圖分類(lèi)號(hào) S451.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The investigation and sampling of the infection situation of Chromolaena odorata in some regions of hainan revealed that the leaf spot was influenced by natural environment. 46 pathogenic fungi were isolated. Based on morphological characteristics and sequence alignments of rDNA ITS region，the most important pathogen fungi of C. odorata were identified as Alternaria alternata， Curvularia lunata and Fusarium oxysporu. The virulence of the strains were determined by inoculation in vitro and in vivo. The results showed that the high-pathogenic strains were 12（26.09%），the medium-pathogenic were 13（28.26%），the low-pathogenic were 19（41.30%），and non-pathogenic 2（4.3%）. The virulence of LGB100501， LGB100401 and WB110216 were very high. High virulence of 11 strains to 8 weeds showed that different strains had differences in virulence，highly susceptible and moderately susceptible accounted for only 13.6%.

Key words Hainan；Chromolaena odorata；Pathogenic fungi；Virulence；Host range

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.029

飛機(jī)草（Chromolaena odorata L）是菊科（Compositae）澤蘭屬（Eupatorium）多年生雜草，學(xué)名香澤蘭[1]，是IUCN 確定的全球100種最具破壞力的入侵生物之一，該草遍布海南全島，對(duì)海南農(nóng)林牧業(yè)的生產(chǎn)、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)安全造成了嚴(yán)重危害。越來(lái)越多的研究表明，篩選和利用本土天敵控制入侵生物是一條簡(jiǎn)捷安全的途徑。迄今為止，已有不少應(yīng)用病原真菌防治入侵雜草的成功實(shí)例，并產(chǎn)生不少商品化的生物制劑[1-3]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)飛機(jī)草的研究主要集中在入侵生態(tài)學(xué)方面，并取得了突破性進(jìn)展，而有關(guān)飛機(jī)草生物防除的相關(guān)研究工作較為落后，尤其是有關(guān)病原微生物控制與應(yīng)用的研究報(bào)道較少。海南作為國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)飛機(jī)草較早且危害最嚴(yán)重的地區(qū)，野外存在自然感病的植株，這為篩選和利用本土天敵控制入侵惡性雜草的研究工作提供了有利條件。但是，目前還沒(méi)有研發(fā)出能夠成功用于飛機(jī)草防治的真菌除草劑。已報(bào)道的飛機(jī)草致病菌主要有從葉片上分離的澤蘭尾孢Cerospora eupatorii（又名Mycovellosiella perfoliata）、 假尾孢Pseudocercospora eupatorii-formosani、鏈格孢Alternaria alternata、Anhellia niger和Colletotrichum sp.、Septoria ekmaniana等[4-6]，從花序上分離到的Aureobasidium pullulans對(duì)飛機(jī)草也具有極高的生防潛力[7]。筆者于2013～2014年對(duì)海南地區(qū)的飛機(jī)草真菌病害進(jìn)行調(diào)查，經(jīng)分離獲得大量致病菌株，并對(duì)其展開(kāi)致病力及寄主范圍的測(cè)定，對(duì)其潛在的生防價(jià)值進(jìn)行初步評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料

飛機(jī)草：采集自海南各個(gè)地區(qū)自然發(fā)病的飛機(jī)草；接種材料：從海南大學(xué)環(huán)植學(xué)院教學(xué)基地及其周邊采集健康無(wú)癥狀的飛機(jī)草葉片及幼苗。

PDA培養(yǎng)基：1 000 mL蒸餾水，200 g馬鈴薯，20 g瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 田間調(diào)研 調(diào)查時(shí)間：2013年9～10月、2014年4～6月。調(diào)查地區(qū)：?？?、東方、澄邁、臨高、儋州、昌江、樂(lè)東、三亞等市縣。調(diào)查方法：以田間、村莊等為主，以5 km為調(diào)查單位，沿途記錄飛機(jī)草種群、分布情況、生長(zhǎng)環(huán)境等。采集發(fā)病的葉片，記錄飛機(jī)草發(fā)病癥狀及病害發(fā)生程度。

1.2.2 致病菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定 從野外采集自然感病的飛機(jī)草，記錄典型的發(fā)病癥狀后，采用常規(guī)的組織分離法對(duì)病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化并將其接種到原雜草[8]；確定是致病菌后再作屬或種的鑒定[9]。

1.2.3 重要病原菌的分子鑒定 待菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后收集菌絲，用CTAB法提取菌株DNA，PCR擴(kuò)增引物為真菌ITS序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。對(duì)rDNA的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：Buffer（含Mg2+）2.5 μL，引物ITS1（10 μmol/L）以及ITS4（10 μmol/L）各0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPS 1μL，Taq聚合酶0.2 μL，模板DNA 0.5 μL，用雙蒸滅菌水將體積至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min后，94 ℃變性45 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，于EB溶液（0.5 μg/mL）中染色15 min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)檢查電泳結(jié)果。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，采用B1ast程序?qū)⑵渑c GenBank上的序列進(jìn)行相似性比較。

1.2.4 致病力測(cè)定 （1）菌絲對(duì)離體葉片的致病力測(cè)定。根據(jù)柯赫氏法則，采用離體葉片針刺法。取健康、大小均一的飛機(jī)草葉片，先用4%次氯酸鈉溶液消毒1 min，后用無(wú)菌水沖洗3次，再用解剖針穿刺造成輕微傷口，以刺破下表皮而上表皮完好為標(biāo)準(zhǔn)；在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打菌塊并將其接在刺傷處，以無(wú)菌瓊脂塊為對(duì)照，每處理接種3個(gè)葉片，共重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)；3 d后觀(guān)察并記錄發(fā)病的癥狀，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率及進(jìn)行病情分級(jí)。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下： 0級(jí)為不發(fā)病；1級(jí)為僅刺傷點(diǎn)有侵染，病斑直徑小于1 mm；2級(jí)為傷點(diǎn)有侵染，病斑直徑1～5 mm；3級(jí)為傷點(diǎn)有侵染，病斑直徑5～10 mm；4級(jí)為傷點(diǎn)有侵染，病斑直徑10～15 mm；5級(jí)為傷點(diǎn)有侵染，病斑直徑大于15 mm。

（2）菌絲對(duì)飛機(jī)草活體的致病力測(cè)定。選取11株致病力較高的菌株，采用水培法進(jìn)行測(cè)定[10]。從田間采集健康、大小均一的飛機(jī)草植株，每株含4～6健康新鮮葉片，于三角瓶中扦插水培，待恢復(fù)生長(zhǎng)24 h后接種，接種處以薄脫脂棉保濕，7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和發(fā)病情況。其它方法見(jiàn)1.2.4（1）。

（3）寄主范圍測(cè)試。采用離體葉片針刺法測(cè)定11個(gè)菌株對(duì)常見(jiàn)菊科、禾本科及科雜草的致病力，以了解其寄主范圍，7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。其它方法見(jiàn)1.2.4（1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 飛機(jī)草自然發(fā)病狀況及病原情況

海南的飛機(jī)草真菌性病害主要有5種，病原分別由鏈格孢屬、彎孢屬、炭疽屬、鐮刀菌屬、尾孢屬等引起，其中最為常見(jiàn)的是由尾孢屬引起的角斑病，在陰暗潮濕、生長(zhǎng)密集的地方發(fā)病較為普遍，以老葉發(fā)病較為嚴(yán)重；由鐮刀菌屬引起的病害一般發(fā)生在葉緣處，病建交界比較明顯，病斑初期呈黑褐色，后期病葉逐漸變黃直至枯死，此病害只在儋州和?？趦傻匕l(fā)現(xiàn)；由鏈格孢屬引起的病害，病斑呈明顯的輪紋狀，病斑初期為小黃點(diǎn)，后期多為不規(guī)則型深黑褐色病斑，葉緣處病斑較為明顯，此病害在東方、澄邁、三亞等地大量發(fā)生，其余地區(qū)零星分布；由彎孢屬引起的病害其病斑在葉片上隨機(jī)分布，與由鏈格孢侵染引起的病斑輪紋類(lèi)似，但輪紋不明顯，后期病斑稍小，此病害只在儋州和澄邁兩地發(fā)現(xiàn)，發(fā)生較為嚴(yán)重；由炭疽菌屬引起的病害病斑為黃褐色的圓形及多角形，初期多從葉尖或葉緣發(fā)病，后期病斑連合成片，病部壞死變黑，此病在澄邁和儋州發(fā)生。

2.2 重要菌株的鑒定

2.2.1 鏈格孢（參考菌株LGB100401） 分生孢子梗一般比菌絲粗，顏色比菌絲略深；頂端產(chǎn)生手雷形或橢圓形的分生孢子（圖1-a），呈現(xiàn)暗灰褐色，多為單生，大多數(shù)具喙，橫隔1～5個(gè)，縱隔1～2個(gè)；孢子大?。?1.88～56.79）μm×（10.92～13.61）μm。對(duì)其rDNA的ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，從發(fā)病飛機(jī)草上分離的菌株LGB100401（登錄號(hào)KT209589）與GenBank中Alternaria alternata的相似性為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子鑒定，確定菌株LGB100401為鏈格孢Alternaria alternata。

2.2.2 新月彎孢（參考菌株WB110216） 分生孢子梗單生或叢生，產(chǎn)于菌絲末端或中間細(xì)胞上，直立或彎曲，不分枝，有分隔，淡褐色至暗褐色，頂部產(chǎn)孢區(qū)顏色較淡。分生孢子（圖1-b）多為單生，深褐色，具隔膜3個(gè)，從基部起第3個(gè)細(xì)胞膨大且彎曲，顏色較深，孢子大小為（10.36～30.85）μm×（4.31～14.33）μm。對(duì)其rDNA ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，從發(fā)病飛機(jī)草上分離的菌株WB110216 （登錄號(hào)KT209588）與GenBank中Curvularia lunata的相似性為99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子鑒定，確定菌株WB110216為新月彎孢Curvularia lunata。

2.2.3 尖孢鐮刀菌（參考菌株LD062203） 分生孢子梗（圖1-c），顏色較淺；產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗（圖1-d），具分枝；大型分生孢子（圖1-e）多為單生，無(wú)色，3～5隔膜，足胞明顯，頂細(xì)胞逐漸變窄，形狀有鐮刀形、橢圓形等，大?。?6.57～36.18）μm×（4.04～4.48）μm；小型分生孢子大?。?2.67～15.52）μm×（3.67～4.40）μm，單生，無(wú)色，一般為0～1隔膜，形狀為腎形等；厚垣孢子大小為（7.80～12.41）μm×（7.82～13.48）μm， 多為簇生或頂生，球型，無(wú)橫隔。對(duì)其rDNA ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，從發(fā)病飛機(jī)草上分離的菌株LD061903（登錄號(hào)KT339743）與GenBank中Fusarium oxysporum的同源性為99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子鑒定，確定菌株LD061903為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum。

2.3 分離菌株致病力測(cè)定

2.3.1 菌絲對(duì)離體葉片的致病力初步測(cè)定 挑選分離率較高的5種病菌共46個(gè)菌株進(jìn)行致病力測(cè)定。結(jié)果表明，強(qiáng)致病力菌株共有12株（占總26.09%），中等致病力菌株有13株（占28.26%）， 弱致病力菌株有19株（占41.30%）， 2個(gè)菌株無(wú)致病力（占4.3%）（表1）。

接種7 d后，供試的病原菌中，鏈格孢菌株LGB100501病情指數(shù)最高為84.00，其次是LGB100401菌株病情指數(shù)為79.44，發(fā)病癥狀見(jiàn)圖2；彎孢菌株WB110216病情指數(shù)最高為76.30；而鐮刀菌菌株LD062203（發(fā)病癥狀見(jiàn)圖2）和LD061903病情指數(shù)最高為56.00；炭疽菌株TJ110205病情指數(shù)最高為73.33；未知菌WZ050502、WZ050503菌株病情指數(shù)則高達(dá)96.75和96.89。

2.3.2 菌絲對(duì)飛機(jī)草活體的致病力測(cè)定 活體致病力測(cè)定結(jié)果表明，有4個(gè)菌株的發(fā)病率均達(dá)到100%，且病斑擴(kuò)展較慢，接種7 d的病情指數(shù)較低，為30.00～55.00。其它7個(gè)菌株的發(fā)病率在50%～75%，病情指數(shù)在20.00～51.25。致病力達(dá)2級(jí)的僅有菌株LGB100501 和WB110216（表2）。

2.4 寄主范圍測(cè)試

11個(gè)菌株針對(duì)8種供試材料共88個(gè)測(cè)定中（表3），在不同植物中表現(xiàn)高度感病的菌株共有9個(gè)，分別為菌株LGB050503、LGB100401、LD062203（對(duì)羽芒菊）；菌株LGB050503、WB110216、LD062203（對(duì)馬唐）；菌株LD062203（對(duì)三葉鬼針草、蟛蜞菊、龍葵）。表現(xiàn)中度感病的菌株僅有3個(gè)，分別為菌株LGB100501、WB110216（對(duì)蟛蜞菊）和LD062104（對(duì)馬唐）。所有測(cè)定中，高度感病和中度感病的雜草很少，僅占13.6%；此外，少數(shù)為輕微致病（病斑不擴(kuò)散），多數(shù)對(duì)供試雜草無(wú)致病性。

在供試病原菌中，鐮刀菌LD062203的侵染力最強(qiáng)，供試的8種雜草中有5種對(duì)其極為敏感，表現(xiàn)高度感??；其次是鏈格孢菌LGB050503、彎孢菌WB110216，2種植物對(duì)其極敏感或較敏感，表現(xiàn)中度感??；其余供試病原菌侵染力較弱，供試植物對(duì)其不敏感或稍敏感。對(duì)供試雜草而言，9個(gè)雜草表現(xiàn)為高度感病，其中菊科雜草羽芒菊和禾本科的馬唐各占3個(gè)，表現(xiàn)較為突出。

3 討論與結(jié)論

早期研究指出，飛機(jī)草尾孢C. eupatorii侵染速度遠(yuǎn)滯后于飛機(jī)草的生長(zhǎng)速率，其生防作用較小[13]，因此，本研究主要針對(duì)飛機(jī)草鏈格孢、鐮刀菌、彎孢菌3種病原展開(kāi)研究；通過(guò)離體和活體測(cè)定綜合分析，供試的46個(gè)菌株中以鏈格孢屬菌株LGB100501、LGB100401和彎孢屬菌株WB110216對(duì)飛機(jī)草致病力最強(qiáng)。寄主范圍測(cè)試發(fā)現(xiàn)，供試雜草對(duì)絕大部分菌株的敏感性較低，具有較高的選擇性；菊科雜草羽芒菊和禾本科雜草馬唐對(duì)部分菌株極敏感?？偟膩?lái)說(shuō)，上述菌株對(duì)其原寄主飛機(jī)草的致病力強(qiáng)于對(duì)其他寄主植物的致病力。

活體測(cè)定與離體測(cè)定相比，大部分菌株的致病力都較弱，與自然條件下致病情況存在差異。可能的原因有：一是活體接種的保濕條件不夠；二是可能自然條件下大部分飛機(jī)草病原菌為復(fù)合侵染，而實(shí)驗(yàn)室單一病原菌致病力相對(duì)較弱。Zachariades等[14]曾指出，從美洲分離的飛機(jī)草病原菌難以控制非洲南部飛機(jī)草，與該病原菌的致病力及野外的生存競(jìng)爭(zhēng)能力有很大關(guān)系。田間雜草的生物防治是極其復(fù)雜的過(guò)程，受諸多因素的影響，因此，上述病菌對(duì)田間飛機(jī)草的生防價(jià)值還有待進(jìn)一步確定。

國(guó)內(nèi)，戴新賓等[15]在惡性入侵雜草紫莖澤蘭Eupatorium adenophora病株上分離獲得A. alternata，并將其菌絲體成功開(kāi)發(fā)為真菌除草劑。另外，研究表明，鏈格孢A. alternata和彎孢C. lunata除了具有很強(qiáng)的致病能力外，它們產(chǎn)生的毒素也具有很好的除草活性，是開(kāi)發(fā)新型微生物除草劑的重要材料來(lái)源，如AAC-毒素可防治紫莖澤蘭，其作為天然除草劑已經(jīng)申請(qǐng)專(zhuān)利[16-17]。本研究篩選出的鏈格孢和新月彎孢菌株，表現(xiàn)出良好的生防潛力，其真菌毒素的除草活性研究及活性物質(zhì)的分離工作正在進(jìn)行。本研究結(jié)果豐富了飛機(jī)草的病菌資源和信息，為飛機(jī)草的生物防治奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：林海妹