ABCC4基因多態(tài)性與ITP患者糖皮質(zhì)激素療效的相關(guān)性分析

徐顏美，張靜，李靜，黃波，劉靜，林晉，王燕，楊偉明，閔清華，王小中(、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

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ABCC4基因多態(tài)性與ITP患者糖皮質(zhì)激素療效的相關(guān)性分析

徐顏美1，張靜1，李靜2，黃波1，劉靜1，林晉1，王燕1，楊偉明1，閔清華1，王小中1
(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

摘要：目的探討ABCC4（ATP-binding cassette，subfamily Cmember 4）基因多態(tài)性rs10508022位點與ITP患者糖皮質(zhì)激素療效的相關(guān)性。方法收集我院2013年6月至2015年6月確診的75例ITP住院患者作為病例組，其中46例糖皮質(zhì)激素敏感型，29例糖皮質(zhì)激素耐藥型，并同期收集60例健康體檢者作為對照組。采用SNaPshot法對所有受試者進(jìn)行rs10508022位點基因分型，判斷其與激素治療ITP療效的關(guān)系。結(jié)果rs10508022位點基因型頻率分布在病例組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.15），但在ITP患者糖皮質(zhì)激素敏感組和耐藥組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），且G等位基因是ITP患者糖皮質(zhì)激素耐藥的風(fēng)險等位基因（OR=3.17，95%CI=1.55-6.47）。結(jié)論ABCC4基因多態(tài)性與ITP患者糖皮質(zhì)激素抵抗有關(guān)，且G等位基因可能是風(fēng)險基因。

關(guān)鍵詞：ABCC4；ITP；糖皮質(zhì)激素

免疫性血小板減少癥（Immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性自身免疫性疾病，血小板特異性自身抗體致敏的血小板被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)破壞過度，且自身抗體抑制巨核細(xì)胞生成血小板，導(dǎo)致循環(huán)中血小板數(shù)量減少[1]。糖皮質(zhì)激素是目前ITP治療的一線藥物，但由于個體間遺傳背景不一致，仍有部分患者表現(xiàn)為糖皮質(zhì)激素抵抗。因此，提前對ITP患者進(jìn)行糖皮質(zhì)激素敏感和抵抗評估，將有助于臨床合理用藥。雖然近年來糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性（如BclI、N363S和ER22/23EK等）已被較好地研究[2]，但并未發(fā)現(xiàn)這些多態(tài)性與ITP患者激素治療的相關(guān)性[3]?？紤]到ABCC4基因編碼的蛋白又稱多重耐藥相關(guān)蛋白4，本研究推測該基因多態(tài)性可能與糖皮質(zhì)激素耐藥機制有關(guān)，故采用SNaPshot法探討其與ITP患者糖皮質(zhì)激素療效的相關(guān)性，為ITP治療提供更明確的指導(dǎo)。

1　對象與方法

1.1研究對象根據(jù)《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識（修訂版）》為ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，收集2013年6月至2015年6月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院的75例成人ITP患者為病例組。收集同期60例健康體檢者為對照組。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會同意，所有受試者均簽名同意參與此研究。

1.2方法

1.2.1糖皮質(zhì)激素治療及療效判斷本研究所納入的ITP患者均以1～2mg/kg·d糖皮質(zhì)激素為起始治療，隨后根據(jù)病情好轉(zhuǎn)程度逐漸減量。糖皮質(zhì)激素敏感和耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：ITP患者經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療2周后，PLT≥30×109/L，比基礎(chǔ)PLT至少增加2倍，且無出血表現(xiàn)為敏感型；PLT<30×109/L或增加不到基礎(chǔ)PLT的2倍或有出血表現(xiàn)為耐藥型[4]。

1.2.2基因組DNA提取及檢測采集受試者外周EDTA抗凝靜脈血3～4ml，根據(jù)血液基因組柱式提取試劑盒（德國Qiagen公司）說明步驟，提取基因組DNA，-20℃保存。采用Theromo NanoDrop 2000C紫外/可見分光光度定量儀器對DNA定量檢測，以純度OD260/280位于1.8～2.0為合格樣本，用于后續(xù)SNaPshot檢測。

1.2.3基因分型采用SNaPshot法對所有受試者DNA進(jìn)行基因分型。SNaPshot技術(shù)原理是先擴(kuò)增目標(biāo)SNPs所在片段，用核酸外切酶和堿性磷酸酶消化體系中的引物序列和多余的單堿基，再以純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用測序酶、標(biāo)有不同熒光的ddNTPs和5’端緊靠SNP位點的延伸引物行PCR，最后采用基因測序儀對擴(kuò)增產(chǎn)物檢測不同的熒光信號，根據(jù)峰的移動位置來確定基因型。此步驟由武漢華大基因公司完成。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理運用SPSS 17.0對一般臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單樣本t檢驗。采用直接計數(shù)法計算SNP基因型和等位基因頻率，以擬合優(yōu)度χ2檢驗分析基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。應(yīng)用χ2檢驗分析各基因型及等位基因頻率分布差異，比值比（Odds ratio，OR）和95%置信區(qū)間（95%Confidence interval，CI）評價ABCC4基因多態(tài)性與ITP患者糖皮質(zhì)激素療效的關(guān)聯(lián)強度。P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1臨床特點根據(jù)一般臨床資料統(tǒng)計分析，年齡在病例組與對照組間無顯著性差異（P=0.72），PLT在兩組間具有顯著性差異（P=0.003）（見表1）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗病例組和對照組人群rs10508022位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05），表明本研究人群來自遺傳平衡的群體，見表2。

表1　一般臨床資料

表2　基因型頻數(shù)分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.3 rs10508022位點基因型頻率與ITP患者糖皮質(zhì)激素療效的關(guān)系rs10508022位點存在AA、AG 和GG三種基因型（見圖1），病例組中基因型頻率分別為76%、22.7%、1.3%，對照組中分別為88.3%、10.0%、1.7%，兩組間無顯著性差異（P= 0.15）（見表3）。

表3　rs10508022位點基因型頻率在病例組與對照組間的分布

圖1　SnaPsho t法檢測rs10508022位點的3種基因型峰值信號圖

rs10508022位點基因型頻率在ITP患者糖皮質(zhì)激素敏感組中分別為86.9%、10.9%、2.2%，耐藥組中分別為58.6%、41.4%、0.0%，兩組間具有顯著性差異（P=0.00）（見表4）。

2.4 rs10508022位點等位基因型頻率在糖皮質(zhì)激素敏感組與耐藥組間的分布rs10508022位點等位基因頻率分布在ITP患者的糖皮質(zhì)激素敏感組與耐藥組間具有顯著性差異（χ2=5.5，P=0.02）。敏感組的A等位基因頻率為92.4%，顯著高于耐藥組（79.3%），提示A等位基因為糖皮質(zhì)激素敏感的保護(hù)等位基因（OR=0.32，95%CI=0.16-0.64）。耐藥組的G等位基因頻率為20.7%，顯著高于敏感組7.6%，提示G等位基因為糖皮質(zhì)激素耐藥的風(fēng)險等位基因（OR=3.17，95%CI=1.55-6.47）（見表5）。

表4　rs10508022位點基因型頻率在糖皮質(zhì)激素敏感組與耐藥組間的分布

3　討論

糖皮質(zhì)激素為ITP治療的一線藥物，由于個體遺傳背景存在差異，部分患者表現(xiàn)為糖皮質(zhì)激素抵抗，導(dǎo)致延誤最佳治療時機。雖然研究者對糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性進(jìn)行了較多的研究，但未發(fā)現(xiàn)其與ITP療效的相關(guān)性。針對就ITP患者糖皮質(zhì)激素治療而言，目前仍然缺乏有效診斷指標(biāo)對患者進(jìn)行敏感和耐藥評估。

ABCC4基因編碼的蛋白又稱多重耐藥相關(guān)蛋白，是ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員之一，參與多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)運輸[5]，主要介導(dǎo)胞內(nèi)脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運[6]，如膽固醇外排，影響機體對藥物的敏感性[7，8]。Andrew J等[9]發(fā)現(xiàn)巨核祖細(xì)胞中膽固醇流出會降低細(xì)胞表面促血小板生成素受體水平，抑制血小板產(chǎn)生。陳亞鋒等[10]也報道高膽固醇血癥患者的血小板膜表達(dá)CD40配體增加，最終促進(jìn)炎癥反應(yīng)和血栓形成，提示膽固醇水平影響血小板的生成，其中ABCC4可能起著潛在重要的作用。此外，研究還報道ABCC4蛋白在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，顯著提高細(xì)胞化療的耐藥性，嚴(yán)重影響藥物療效，并與白血病等惡性腫瘤的預(yù)后及復(fù)發(fā)有關(guān)[11-15]。我們推測ABCC4基因異常改變蛋白功能活性，促進(jìn)膽固醇外排，減少血小板生成，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素治療ITP患者時PLT升高不明顯而出現(xiàn)的抵抗現(xiàn)象，但該基因與糖皮質(zhì)激素之間的具體作用機制仍然不清，需要后續(xù)大量實驗證實。

本研究結(jié)果顯示ABCC4基因多態(tài)性rs10508022位點與ITP發(fā)病無顯著關(guān)聯(lián)（P=0.15），但在ITP患者糖皮質(zhì)激素敏感組和耐藥組間具有顯著性差異（P=0.003），并且G等位基因是ITP患者糖皮質(zhì)激素耐藥的風(fēng)險等位基因（OR=3.17，95% CI=1.58-6.34），提示該位點與ITP患者糖皮質(zhì)激素抵抗具有顯著相關(guān)性。這表明ABCC4基因多態(tài)性可作為ITP患者糖皮質(zhì)激素療效的預(yù)測指標(biāo)之一，為ITP治療提供更明確的指導(dǎo)。此外，由于ITP發(fā)病率低，大樣本量檢測仍然是ITP遺傳學(xué)研究的巨大挑戰(zhàn)，因此開展多中心合作研究收集更大樣本量以豐富ITP遺傳學(xué)分子機制顯得尤為重要。

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Association analysis of ABCC4 gene polymorphism with the therapeutic effect of glucocorticoid in ITP patients

XU Yanmei1，ZHANG Jing1，LI Jing2，HUANG Bo1，LIU Jing1，LIN Jin1，WANG Yan1，YANGWeiming1，MIN Qinghua1，WANG Xiaozhong1. 1.Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.2.Departmentof Clinical laboratory，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Abstract：Objective To explore the association of ABCC4 rs10508022 gene single nucleotide polymorphism with glucocorticoid therapeutic effect in ITP patients.Methods Seventy-five hospitalized patients diagnosed with ITPwere collected from June 2013 to June 2015 in our hospital as case group，of which 46 patients were sensitive to glucocorticoid and remains were resistant to glucocorticoid.60 healthy subjects were collected from the same period as control group.The gene typing of rs10508022 was performed by SNaPshotmethod.And the correlation between rs10508022 and the effect of glucocorticoid therapy in ITP patients was estimated.Results The genotype distribution of rs10508022 had no statistical difference(P=0.15)between cases and controls，but had significant difference in the sensitive and resistantgroup for glucocorticoid in ITP patients(P=0.003).And Gallele was the risk allele for glucocorticoid resistance in ITP(OR=3.17，95%CI=1.55-6.47).Conclusions ABCC4 gene polymorphism is associated with the glucocorticoid resistant in ITP patients，and G allelemay be the risk allele.

Key words：ABCC4；ITP；Glucocorticoid

(收稿日期2015-11-24；修回日期2016-01-19)

通信作者：王小中，1973年12月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：血液病分子機制，E-mail：wangxzlj@126.com。

作者簡介：徐顏美，1989年9月生，女，碩士，檢驗技師，研究方向：血液病遺傳學(xué)發(fā)病機制；張靜為共同第一作者，1990年4月生，女，碩士研究生，檢驗技師，研究方向：血液病遺傳學(xué)發(fā)病機制。

基金項目：江西省教育廳項目（GJJ13157）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.003

中圖分類號：R446.62，R558.+2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0008-03