急性早幼粒細(xì)胞白血病實驗室診斷方法研究進(jìn)展

薛白綜述，李靖，王奔放審校(、江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，江蘇淮安3300；、江陰人民醫(yī)院檢驗科，江蘇江陰4400)

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急性早幼粒細(xì)胞白血病實驗室診斷方法研究進(jìn)展

薛白1綜述，李靖1，王奔放2審校
(1、江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，江蘇淮安223300；2、江陰人民醫(yī)院檢驗科，江蘇江陰214400)

摘要：目前，急性早幼粒細(xì)胞白血病的實驗室診斷主要是以細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查為基礎(chǔ)，結(jié)合免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)檢驗的MICM綜合性診斷技術(shù)。近幾年，D-二聚體在急性早幼粒細(xì)胞白血病中的診斷價值也逐漸被臨床重視。本文將對這些實驗室診斷方法進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：急性早幼粒細(xì)胞白血病；MICM分型；D-二聚體；FISH；FCM

急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloblastic leukemia，AML）的M3亞型[1]，多伴有異常染色體t（15；17）而形成PML-RARα融合基因。以異常早幼粒細(xì)胞增生為主，臨床上除有發(fā)熱、感染、貧血和浸潤等急性白血病的癥狀外，廣泛而嚴(yán)重的出血常是本病的特點，易并發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），可發(fā)生原發(fā)性纖溶亢進(jìn)。經(jīng)誘導(dǎo)化療或骨髓移植后達(dá)到臨床完全緩解（CR），但體內(nèi)依然會殘存約106~108個微量白血病細(xì)胞（MRLC），即微量殘留白血?。╩inimal residuai disease，MRD）[2]，而這些細(xì)胞則是APL復(fù)發(fā)的根源。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，通過聯(lián)合測定PML-RARα融合基因進(jìn)行診斷，即將形態(tài)學(xué)（morphology，M）、免疫學(xué)（immunology，I）、細(xì)胞遺傳學(xué)（cytogenetics，C）和分子生物學(xué)（molecular，M）相聯(lián)合的MICM分型技術(shù)[3]，極大地提高了APL診斷的準(zhǔn)確率，并為MRD提供了更為可靠的診斷依據(jù)。本文結(jié)合近幾年相關(guān)學(xué)者利用MICM分型技術(shù)和D-二聚體檢測等在APL上的診斷報道及相應(yīng)研究成果，對這些診斷方法進(jìn)行綜述，并探討各診斷方法的優(yōu)劣。

1　血細(xì)胞形態(tài)學(xué)在診斷中的應(yīng)用

1.1血象APL的血涂片觀察，可見血紅蛋白和紅細(xì)胞呈不同程度的減少；血小板中度到重度減少，多數(shù)為（10~30）×109/L。白細(xì)胞計數(shù)大多病例在15× 109/L以下，明顯減少者見于全血細(xì)胞減少，但也可有明顯增高（M3v型），分類以異常早幼粒細(xì)胞為主，也可見少數(shù)原粒及其他階段粒細(xì)胞，胞漿易見Auer小體。

1.2骨髓象多數(shù)APL病例骨髓增生極度活躍，個別病例增生低下。各階段幼紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞形態(tài)分類以早幼粒細(xì)胞為主，占30% ~90%（NEC），可見少量的原粒和中幼粒細(xì)胞。增多的早幼粒細(xì)胞形態(tài)異常，大小不一，外形呈橢圓形或不規(guī)則形。胞核扭曲變形，可見雙核，核染色質(zhì)疏松有明顯核仁。胞質(zhì)中含多量大小不等的嗜苯胺藍(lán)顆粒[4]，根據(jù)胞質(zhì)中顆粒的不同可分為3個亞型：粗顆粒型（M3a），顆粒粗大深染密集；細(xì)顆粒型（M3b），顆粒密集而細(xì)小；變異型（M3v），顆粒極少甚至沒有。

1.3細(xì)胞化學(xué)染色過氧化物酶（POX）、蘇丹黑染色（SBB）、酸性磷酸酶（ACP）、非特異性脂酶（NSE）均呈陽性或強(qiáng)陽性；且非特異性脂酶（NSE）不被NaF抑制，中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶（NAP）積分減低。

通過APL細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征而對其進(jìn)行分型主要依據(jù)1976年法（F）、美（A）、英（B）三國協(xié)作組提出的急性白血病FAB形態(tài)學(xué)分型方案及診斷標(biāo)準(zhǔn)（1985年有修改）[5]。借助光學(xué)顯微鏡和一定的細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)，在形態(tài)學(xué)上對APL做出初步的分型診斷。由于僅是憑借人眼進(jìn)行分型，其在細(xì)胞形態(tài)的辨認(rèn)上易受檢驗人員學(xué)識水平、工作經(jīng)驗等因素影響，從而影響對APL分型的準(zhǔn)確性；且靈敏度低，對于MRD的監(jiān)測也很難實施。近幾十年，國際上在白血病FAB分型的基礎(chǔ)上又開展了免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的研究工作，大大提高了對白血病診斷的準(zhǔn)確性也更利于對MRD的監(jiān)測[6]。但利用光學(xué)顯微鏡的形態(tài)學(xué)診斷也一直被臨床沿用，主要由于光學(xué)顯微鏡方便易得，成本相對較低，利于普及，特別是基層醫(yī)院，可以作為白血病篩查的主要手段；且對于細(xì)胞形態(tài)典型的病例，血細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷更是有利于疾病的及時診斷和治療。

2　免疫學(xué)分型在診斷中的應(yīng)用

典型的APL免疫學(xué)表型呈CD13、CD33陽性，CD34及HLA-DR陰性，CD34陽性的APL惡性細(xì)胞顆粒小而少，且易出現(xiàn)白細(xì)胞計數(shù)增高，預(yù)后較差[7]。近年來隨著單克隆抗體的不斷開發(fā)及流式細(xì)胞術(shù)的廣泛開展，急性白血病免疫表型研究得到迅猛發(fā)展，極大地提高了APL診斷和分型的準(zhǔn)確性[8]。同時隨著流式細(xì)胞儀（FCM）性能的不斷完善，也使得MRD的檢測更為靈敏。FCM是將單克隆抗體、流體力學(xué)、免疫熒光、計算機(jī)等技術(shù)相結(jié)合，測量射門參數(shù)在單細(xì)胞水平上辨認(rèn)細(xì)胞形態(tài)、大小和熒光等特征，其檢測快速、簡便，特異性好、敏感度高，能對大量細(xì)胞進(jìn)行定量分析，使用的單克隆抗體容易購買，價格相對便宜，便于臨床推廣。但由于目前缺乏理想的抗體組合，F(xiàn)CM檢測APL患者M(jìn)RD的靈敏度還較低[9]；且隨著病程發(fā)展，細(xì)胞表面的抗原發(fā)生改變，亦會導(dǎo)致結(jié)果假陰性。因此，較多研究中心建議同時采用多種不同的免疫表型會使這種影響降至最低[10]。張紅靈等[11]人采用一組四色熒光標(biāo)記單克隆抗體組合（CD15-CD11b-CD33-CD45）的流式細(xì)胞儀對40例初診時經(jīng)形態(tài)學(xué)及流式免疫分型診斷為APL的白血病患者及其治療后12例骨髓標(biāo)本進(jìn)行檢測，同時檢測正常對照8例。以CD45/SSC選定粒細(xì)胞門，選出其中CD33+細(xì)胞再進(jìn)一步分析CD11b及CD15的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD33+APL白血病細(xì)胞群均表達(dá)CD15-CD11b-CD33+，有少數(shù)病例同時含有少量CD15-CD11b+CD33+分化細(xì)胞。而在正常骨髓標(biāo)本中以CD45/SSC設(shè)門粒細(xì)胞群CD15-CD11b-CD33+細(xì)胞多數(shù)為0，以CD15++CD11b++細(xì)胞為主，少數(shù)表達(dá)CD15+CD11b++，CD15+CD11b+，CD15++CD11b+和CD15++CD11b-細(xì)胞，表現(xiàn)出與白血病早幼粒細(xì)胞明顯不同的表型。因此四色組合FCM可用于APL中MRD的檢測。

3　細(xì)胞遺傳學(xué)在診斷中的應(yīng)用

約70%~90%的APL具有特異染色體t（15；17）易位，形成PML-RARα融合基因，這是APL特有的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志[12]。PML-RARα產(chǎn)物可抑制RARα-RXR二聚體，進(jìn)而使早幼粒細(xì)胞分化成熟障礙[13]。臨床上全反式維甲酸ATRT誘導(dǎo)分化治療能使85%左右的APL患者獲得緩解，預(yù)后較好；極少數(shù)無此融合基因者，維甲酸治療不敏感，預(yù)后較差。常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)中的染色體檢驗主要包括染色體顯帶/非顯帶技術(shù)、染色體高分辨技術(shù)和染色體脆性部位顯示技術(shù)等。侯繼申等人[14]研究表明APL的細(xì)胞遺傳學(xué)與形態(tài)學(xué)的相關(guān)性并不總是一致的。少數(shù)具變異易位核型、變異型APL患者常表現(xiàn)不典型的形態(tài)學(xué)特征，易誤診為其他白血病。其研究的39例APL患者中有2例APL初診時被誤診為M2和M5，其中1例早幼粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)富含多個空泡、顆粒稀少，可能與早幼粒細(xì)胞顆粒缺失導(dǎo)致空泡形成有關(guān)，經(jīng)核型分析確診。因此常規(guī)染色體核型分析在形態(tài)不典型的APL診斷中具有重要作用，可提高APL診斷的準(zhǔn)確性和靈敏度。常規(guī)染色體核型分析作為經(jīng)典的分析細(xì)胞遺傳學(xué)方法，已研究的較為成熟，由于著眼于所有染色體因此容易發(fā)現(xiàn)新的染色體異常，其主要不足是對于標(biāo)本質(zhì)量要求較高，靈敏度較低，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，且對于導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的微小殘留病監(jiān)測較不敏感[15]。

4　分子生物學(xué)檢驗在診斷中的應(yīng)用

4.1熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是一種高分辨率和高靈敏度的染色體和基因分析技術(shù)[16]，通過將生物素標(biāo)記的DNA探針與互補(bǔ)的DNA鏈染色體原位雜交，熒光顯色后顯微鏡觀察，其將細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)充分結(jié)合，不僅用于分裂中期細(xì)胞，還可用于細(xì)胞分裂間期，拓展了檢測范圍，提高了白血病診斷和MRD檢測的靈敏度[17]。鄭玲等人[18]利用多重?zé)晒庠浑s交（M-FISH）技術(shù)對20例APL患者進(jìn)行檢測，并與常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）結(jié)果相比較，從而揭示了M-FISH對于APL的診斷及其MRD的檢測有重要應(yīng)用價值：MFISH雖不如RT-PCR敏感，但其反映的是處于增殖期的單個白血病細(xì)胞的狀況，通過反復(fù)檢測可以動態(tài)地觀察體內(nèi)白血病細(xì)胞負(fù)荷的消長，似比RT-PCR更能預(yù)測白血病的復(fù)發(fā)。同時Gordon Dewald W[19]在其報道中表明FISH還可以檢測一些變異型的RARα融合基因，且檢測效率高，利于標(biāo)準(zhǔn)化開展。

4.2聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種用于體外擴(kuò)增核酸片段的技術(shù)[20]，在進(jìn)行APL檢測時目前臨床常用的是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）以及在PCR反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)的實時熒光定量PCR（RQ-PCR）[21]。趙威等人[22]利用實時定量PT-PCR技術(shù)可檢測出10-5μg人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株（NB4）細(xì)胞cDNA中的PML-RARα融合基因，其靈敏度高、重復(fù)性好，且有助于監(jiān)測白血病微小殘留病灶。實時定量RTPCR是在普通PCR反應(yīng)中加入能與PCR產(chǎn)物結(jié)合的熒光探針或熒光染料，使之熒光信號隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而成比例增長，儀器實時檢測每一個循環(huán)結(jié)束后的熒光強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得出定量結(jié)果[23]，動態(tài)監(jiān)測PML-RARα融合基因，以及PML-RARα亞型[24]，來檢測APL細(xì)胞的殘余數(shù)量和預(yù)測復(fù)發(fā)，還可以預(yù)測白血病患者的治療反應(yīng)，從而成為指導(dǎo)臨床個體化治療、預(yù)防復(fù)發(fā)和提高患者生存率的重要手段。

5　D-二聚體檢測在APL中的臨床價值

近年來，D-二聚體在幫助診斷凝血系統(tǒng)和纖溶亢進(jìn)，特別是繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)等方面的臨床價值越來越受到醫(yī)學(xué)專家的重視[25]。急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）在疾病進(jìn)程和治療期最常見的臨床表現(xiàn)是廣泛而嚴(yán)重的出血[26]，甚至出現(xiàn)顱內(nèi)出血，且易并發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），從而繼發(fā)纖溶亢進(jìn)。究其原因，有研究表明因為APL的異常早幼粒細(xì)胞具有合成釋放大量促凝物質(zhì)的能力，如組織因子，這些促凝物質(zhì)會激活凝血系統(tǒng)，引起繼發(fā)性的纖溶功能亢進(jìn)，當(dāng)這些細(xì)胞增多到一定程度時，血液將呈現(xiàn)為高凝狀態(tài)，機(jī)體內(nèi)微循環(huán)廣泛形成血栓，進(jìn)一步促進(jìn)繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)，造成嚴(yán)重出血等并發(fā)癥狀。因而血漿D-二聚體的檢測對APL有一定的診斷意義。董大鵬等人[27]通過臨床上72 例APL患者治療前和治療后D-二聚體含量檢測結(jié)果分析得出該指標(biāo)有較高的靈敏度，能夠較好的反應(yīng)早期患者體內(nèi)的纖溶亢進(jìn)及凝血系統(tǒng)激活狀態(tài)。通過檢測患者血D-二聚體含量可以直接反映D-二聚體水平和患者病情的變化情況，因此能夠作為APL病情進(jìn)展及預(yù)后的重要參考指標(biāo)[28]，且該指標(biāo)的檢測在臨床上簡便、快速、成本低，利于普及。但值得注意的是，任何引起DIC的疾病都會導(dǎo)致D-二聚體的增高，因此缺乏特異性，一般只作為APL繼發(fā)DIC診斷的實用性指標(biāo)[29]。

綜上所述，APL的實驗室診斷方法已不單靠FAB形態(tài)學(xué)分型，免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)的發(fā)展，為白血病的診斷，特別是MRD的診斷，提供了更精確，更敏感，更為標(biāo)準(zhǔn)化的檢測技術(shù)。這不僅使我們對APL的本質(zhì)、發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)特性有了進(jìn)一步的了解，而且對指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后復(fù)發(fā)更是具有相當(dāng)大的臨床實用價值。而FCM、FISH、PCR等這些技術(shù)的應(yīng)用雖然大大提高APL診斷敏感性，但由于其對儀器和試劑的要求條件高、成本高，且檢測周期較長，目前在臨床較難完全普及。而針對APL，由于其更易并發(fā)DIC，D-二聚體的檢測雖然特異性不強(qiáng)，但在于其成本較低，敏感性較高，也逐漸被臨床所重視。因此在節(jié)約成本、減少診斷時間、為患者爭取寶貴的治療時間上，APL的實驗室診斷方法依然還有更廣闊的研究空間[30]。

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(收稿日期2015-07-14；修回日期2016-01-06)

通信作者：李靖，女，1971年10月生，本科，醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)；副教授；電話：15061227775。

作者簡介：薛白，女，1989年10月生，本科，助教，醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)、研究方向為醫(yī)學(xué)檢驗，電話：15162927007；E-mail：xuebai2429@163. com.

基金項目：江蘇淮安市職業(yè)教育科學(xué)研究“十二五”規(guī)劃2014年度課題（編號：Hazy14056）。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.015

中圖分類號：R733.71，R446

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0044-04