穩(wěn)定表達(dá)兔巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶RK13細(xì)胞系的建立

朱 杰，繆秋紅，郭慧敏，譚永貴，李傳峰，孟春春，陳宗艷，劉光清

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

穩(wěn)定表達(dá)兔巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶RK13細(xì)胞系的建立

朱 杰，繆秋紅，郭慧敏，譚永貴，李傳峰，孟春春，陳宗艷，劉光清

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

為了構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)兔巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase, FUT2）的RK13細(xì)胞系，本研究將FUT2基因編碼序列插入到慢病毒載體 pLOV-GFP-3Flag中，構(gòu)建了pLOV-3Flag-FUT2重組質(zhì)粒。將pLOV-3Flag-FUT2與包裝質(zhì)粒psPAX2和外膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，獲得重組病毒樣顆粒。用含病毒樣顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液感染RK13細(xì)胞，并通過嘌呤霉素篩選、純化，獲得穩(wěn)定表達(dá)FUT2的細(xì)胞系，命名為RK-FUT2細(xì)胞。連續(xù)培養(yǎng)10代后，利用PCR、RT-PCR和Western blot方法鑒定，結(jié)果表明，RK-FUT2細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)兔巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。該細(xì)胞系為研究FUT2在兔病毒性出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）感染過程和致病機(jī)制中的作用提供了有力工具。

兔巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶；RK13細(xì)胞；兔病毒性出血癥病毒

兔病毒性出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）為單股正鏈RNA病毒，屬于杯狀病毒科（Caliciviridae）、兔病毒屬（Lagovirus）[1-3]。該病毒可使兔發(fā)生急性、敗血性傳染病，發(fā)病率達(dá)100%，病死率可達(dá)90%以上，是兔的一種毀滅性傳染病，俗稱“兔瘟”。1984年，兔瘟第一次在中國(guó)江蘇省大規(guī)模爆發(fā)，病兔呈現(xiàn)肝臟壞死，實(shí)質(zhì)臟器水腫，呼吸系統(tǒng)彌慢性出血等典型病變[4]。隨后，該病迅速傳播擴(kuò)散至全球，給世界各國(guó)兔養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失[3,5,6]。目前，關(guān)于RHDV的研究雖然也取得了一些進(jìn)展，但是由于缺少穩(wěn)定的細(xì)胞增殖模型，對(duì)于RHDV的感染和致病機(jī)理的研究還未取得突破性結(jié)果。據(jù)報(bào)道，RHDV能夠與H2型組織血型抗原（histo-blood group antigen, HBGA）家族的一種三糖（Fucα2Galβ4GlcNAcβ-R）結(jié)合，該三糖廣泛存在于各哺乳動(dòng)物中，且在組織分布上具有明顯的種屬差異[7]。由兔源功能基因SEC1、FUT1和FUT2編碼的α-1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase, FUT），催化巖藻糖基與H2型HBGA前體相結(jié)合，然后發(fā)揮巖藻糖的功能[8-10]。在諾瓦克病毒研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT2和FUT3表達(dá)障礙的人對(duì)諾瓦克病毒具有抵抗力，可見巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在諾瓦克病毒感染過程中發(fā)揮重要作用[11-13]。在RHDV研究中也發(fā)現(xiàn)，該病毒主要引發(fā)成年兔發(fā)病，幼兔很少感染發(fā)病，猜測(cè)可能是由于RHDV主要吸附因子H2 HBGA型受體在幼兔肝臟中不表達(dá)，因此FUT2基因表達(dá)受到抑制，從而使幼兔能夠抵抗兔RHDV感染[14]?？梢姡瑤r藻糖基轉(zhuǎn)移酶與RHDV的感染過程密切相關(guān)。本研究將兔源FUT2基因在兔腎上皮細(xì)胞RK13中穩(wěn)定表達(dá)，建立RK-FUT2細(xì)胞系，為探討FUT2在RHDV感染過程中的作用提供很好的平臺(tái)，進(jìn)而期望以此獲得對(duì)RHDV敏感的細(xì)胞模型。

1 材料和方法

1.1 菌種和質(zhì)粒E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；重組質(zhì)粒pET30a-FUT2（含有FUT2全基因序列，DQ：X91269）、pLOVGFP-3Flag、psPAX2、pMD2.G等慢病毒包裝載體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室（簡(jiǎn)稱禽病實(shí)驗(yàn)室）保存。

1.2 細(xì)胞系293T細(xì)胞系由禽病實(shí)驗(yàn)室保存；RK13細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞保存中心。

1.3 主要試劑與材料T4 DNA連接酶、Not I、Nhe I限制性內(nèi)切酶購(gòu)自 NEB公司；ECL顯色液購(gòu)自賽默飛公司；Pfu DNA聚合酶購(gòu)自北京天根生化技術(shù)有限公司；抗Flag標(biāo)簽小鼠單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；AxyPrep 96DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司（杭州）；DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、1×PBS購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)于Gibco生物公司；鈣轉(zhuǎn)染試劑自配（CaCl2和Heps試劑購(gòu)自Sigma公司）；Puromycin 購(gòu)自 Amresco 公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自 QIAGEN 公司；抽提細(xì)胞總基因組、mRNA試劑盒分別為OMEGA Tissue DNAkit、BioTeke無氯仿RNA提取試劑盒（離心柱型）。

1.4 慢病毒包裝質(zhì)粒pLOV-3Flag-FUT2的構(gòu)建根據(jù)GenBank中兔源FUT2 基因組序列（DQ：X91269）設(shè)計(jì)擴(kuò)增FUT2基因的引物。以FUT2-NheI-F （5′-CTAGCTAGCTGAGCCACCATGAGCACCGC CCAGGTC-3′）和FUT2-Not I-R（5′-ATTTGCGGC CGCTCAGTGCTTGAGCAATGG-3′）為引物，從前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的FUT2原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-FUT2[15]擴(kuò)增FUT2 基因的完整開放閱讀框。PCR 產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后用Nhe I 和Not I 酶切，并利用T4 DNA連接酶連接于同樣酶切的pLOV-GFP-3Flag載體中，構(gòu)建pLOV-3Flag-FUT2重組質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定無誤后測(cè)序。

1.5 含F(xiàn)UT2基因重組慢病毒樣顆粒的制備按照QIAGEN Maxiprep Endo-free Plasmid Kit I說明書操作提取高純度無內(nèi)毒素的pLOV-3Flag-FUT2、psPAX2、pMD2.G三個(gè)質(zhì)粒，利用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度后，利用鈣轉(zhuǎn)染試劑將3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集含重組慢病毒樣顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

1.6 表達(dá)FUT2基因RK-13細(xì)胞系的制備與陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選待轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，將含F(xiàn)UT2基因的重組慢病毒樣顆粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移至RK13細(xì)胞中，感染 24 h 后用含嘌呤霉素 (2 μg/mL)培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，每隔2 d 棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，換含嘌呤霉素的新培養(yǎng)液。4 d 后將陽(yáng)性細(xì)胞株在含嘌呤霉素的條件下連續(xù)傳代，待傳代至第5代與第10代細(xì)胞時(shí)進(jìn)行鑒定。

1.7 FUT2基因組插入水平檢測(cè)以及mRNA表達(dá)水平檢測(cè)提取第5代和10代細(xì)胞的基因組總DNA和總mRNA，mRNA用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA和細(xì)胞的基因組DNA為模板，用引物FUT2-Nhe I-F 和FUT2-Not I-R 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 min，72℃延伸 1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。以兔源β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用引物β-actin-F （5′-ATCGAGCACGGCATCGTCACC-3′）和β-actin-R（5′- CACGTCACACTTCATGATGGA-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 FUT2 蛋白表達(dá)水平Western blot檢測(cè)將第5代和第10代細(xì)胞加入適量細(xì)胞裂解液，裂解后離心取上清，然后加入4×Protein lading buffer，加熱煮沸10 min，再經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至NC膜。NC膜用4%BSA在37℃封閉2 h，加入小鼠Flag單克隆抗體（按1∶2000用BSA進(jìn)行稀釋），4℃孵育過夜；TBST清洗3次，10 min/次，然后加入以1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h；TBST清洗3次，10 min/次；最后用Thermo scientific公司的ECL發(fā)光顯色試劑盒，曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 pLOV-3Flag-FUT2重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定以pET30a-FUT2質(zhì)粒為模板，用引物pFUT2-Nhe I-F 和pFUT2-Not I-R 擴(kuò)增獲得FUT2基因片段，然后通過酶切連接獲得pLOV-3Flag-FUT2重組質(zhì)粒。利用Nhe I和Not I雙酶切鑒定正確后，經(jīng)上海杰李公司測(cè)序，確認(rèn)該質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 pLOV-3Flag-FUT2質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identifi cation of the plasmid pLOV-3Flag-FUT2

2.2 穩(wěn)定表達(dá)FUT2的RK13細(xì)胞篩選前期利用RK-13細(xì)胞篩選出殺死該細(xì)胞最低的嘌呤霉素濃度為2 μg/mL。將pLOV-3Flag-FUT2與包裝質(zhì)粒psPAX2和外膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞中，48 h后，收集含F(xiàn)UT2和eGFP的重組慢病毒樣顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)液。然后將其轉(zhuǎn)接至RK-13細(xì)胞中進(jìn)行感染，24 h后加入嘌呤霉素至終濃度為2 μg/mL，每隔2 d更換新培養(yǎng)基，待細(xì)胞不出現(xiàn)死亡，將細(xì)胞進(jìn)行傳代，如圖2所示，eGFP基因成功在RK-FUT2細(xì)胞中表達(dá)。

選取第5代和第10代RK-FUT2細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞DNA提取和總RNA的提取，細(xì)胞總RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后用FUT2-Nhe I-F 和FUT2-Not I-R 特異引物分別以細(xì)胞DNA和cDNA為模板擴(kuò)增FUT2基因。以β-actin為內(nèi)參基因，所得片段為408 bp。如圖3A所示，第5代和第10代均能在該細(xì)胞基因組中檢出FUT2基因，RK13細(xì)胞中未檢測(cè)出。如圖3B所示，第5代和第10代RK-FUT2細(xì)胞也能檢測(cè)出FUT2基因，RK13細(xì)胞中未檢測(cè)出。從而表明，F(xiàn)UT2基因成功插入到細(xì)胞基因組中，并且能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA。

圖2 嘌呤霉素篩選的陽(yáng)性RK-FUT2細(xì)胞Fig.2 The positive RK-FUT2 cells screened by puromycin

圖3 RK-FUT2細(xì)胞FUT2基因檢測(cè)Fig.3 Examination results of FUT2 gene in RK-FUT2 cells

2.3 Western blot檢測(cè)FUT2 蛋白表達(dá)選取第5代和第10代RK-FUT2細(xì)胞，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。以Flag標(biāo)簽單抗為一抗，β-actin為內(nèi)參蛋白，ECL顯影曝光結(jié)果如圖4所示，第5代和第10代RK-FUT2細(xì)胞均能檢測(cè)出FUT2蛋白高效表達(dá)，表明RK-FUT2細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)FUT2蛋白。

圖4 FUT2 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)Fig.4 Detection of FUT2 protein in RK-FUT2 cells by Western blot

3 討論

篩選與建立細(xì)胞系有多種方法，如利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染直接將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞篩選獲得，或利用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)將目的基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)。由于直接轉(zhuǎn)染的方法效率較低，目前慢病毒載體成為基因整合的良好工具，并已被廣泛應(yīng)用[16,17]。因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒在感染細(xì)胞上具有特異性，使得其在細(xì)胞系建立上逐漸被慢病毒系統(tǒng)所取代，然而逆轉(zhuǎn)錄病毒中所特有的水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）的G蛋白（lentiviral VSV-G protein），由于具有高效性，也被廣泛應(yīng)用于慢病毒包裝構(gòu)建細(xì)胞系[18-20]。通過分子克隆技術(shù)將目的基因插入到該慢病毒載體中，包裝細(xì)胞293T能提供慢病毒載體包裝所需的其他蛋白，形成具有靶基因的能夠感染其他宿主細(xì)胞的重組慢病毒樣顆粒。該病毒顆粒感染目的細(xì)胞后，目的基因進(jìn)入細(xì)胞并整合到細(xì)胞染色體中，從而使得目的基因在靶細(xì)胞中得到穩(wěn)定表達(dá)。RK13細(xì)胞是RHDV的天然宿主細(xì)胞，本研究利用慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建FUT2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，所使用的包裝載體為pLOV-GFP-3Flag，該載體是將GFP蛋白與目的蛋白融合表達(dá)，然后通過中間2A蛋白酶將FUT2蛋白與GFP蛋白分開，從而形成獨(dú)立的FUT2蛋白。同時(shí)，由于目前我們?nèi)鄙儆行У耐迷碏UT2抗體，所以我們利用FUT2 N端添加3Flag小標(biāo)簽進(jìn)行FUT2蛋白水平檢測(cè)。

RHDV屬于杯狀病毒科、兔病毒屬，是單股正鏈RNA病毒。由于該病毒不能在體外培養(yǎng)或穩(wěn)定增殖，限制了“兔瘟”細(xì)胞毒疫苗的研制，同時(shí)嚴(yán)重阻礙了RHDV研究進(jìn)程。至今為止，研究人員仍未找到能穩(wěn)定增殖該病毒的細(xì)胞系，并且關(guān)于RHDV的感染和致病機(jī)理等都知之甚少。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，RHDV能夠與人類組織血型抗原ABH/O和Lewis （HBGA）發(fā)生抗原抗體反應(yīng)[7]。HBGA為復(fù)雜的多聚糖，通過細(xì)胞內(nèi)單糖在α-1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FUT2）的作用下發(fā)生糖基化聚合形成[21]。同時(shí)Nystr?m等[22]研究發(fā)現(xiàn)，RHDV與HBGA的A2型、B2型和H2型結(jié)合。前期研究發(fā)現(xiàn)，兔瘟僅發(fā)生于成年兔，幼兔很少感染發(fā)病，猜測(cè)是由于幼兔體內(nèi)FUT2水平過低導(dǎo)致H2型HBGA糖基化水平低下，不能形成與RHDV有效結(jié)合的受體[14]。在杯狀病毒科的其他病毒研究中，同樣發(fā)現(xiàn)FUT2表達(dá)缺陷能夠抵抗該病毒的感染，如諾瓦克病毒[11-13]?？梢奆UT2在RHDV的感染和致病過程中發(fā)揮重要作用。因此，研究兔FUT2的功能，建立穩(wěn)定表達(dá)FUT2基因的兔源細(xì)胞系，對(duì)研究RHDV感染和致病機(jī)理具有重要意義，同時(shí)可以為尋找RHDV穩(wěn)定增殖的細(xì)胞系提供新的方向和重要基礎(chǔ)。

本研究通過慢病毒包裝的方法成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)兔源FUT2蛋白的RK-FUT2細(xì)胞系。通過蛋白水平檢測(cè)，該細(xì)胞系能夠穩(wěn)定高效表達(dá)兔源FUT2蛋白，為研究FUT2在RHDV感染和致病過程中的作用及其作用機(jī)制提供了重要的平臺(tái)。

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ESTABLISHMENT OF A STABLE RK13 CELL LINE EXPRESSING RABBIT FUCOSYLTRANSFERASE

ZHU Jie, MIAO Qiu-hong, GUO Hui-min, TAN Yong-gui, LI Chuan-feng, MENG Chun-chun, CHEN Zong-yan, LIU Guang-qing

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To establish a stable RK13 cell line that expresses rabbit fucosyltransferase (FUT2), a recombinant plasmid pLOV-3Flag-FUT2 was constructed by inserting FUT2 gene into lentivirus expression vector pLOV-GFP-3Flag.Then, pLOV-3Flag-FUT2 plasmid together with psPAX2 and pMD2.G plasmids were co-transfected into 293T cells.The lentivirus-like particles were harvested from 293T cells and inoculated into RK13 cells.The RK13 clones expressing FUT2 were screened using the selection medium containing puromycin.The transcription and expression of FUT2 in the selected RK13 cells were detected in PCR, RT-PCR and Western blot.After ten passages, FUT2 was found to be effi ciently expressed in the RK13 cells designated as RK-FUT2.These results indicated that a stable cell line RKFUT2 was established successfully.The availability of RK-FUT2 cell line will be benefi t to further explore the FUT2 function in the pathogenesis of Rabbit hemorrhagic disease virus.

Rabbit fucosyltransferase; RK13 cell; Rabbit hemorrhagic disease virus

S852.659.6

A

1674-6422（2015）02-0001-06

2014-12-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（31270194）

朱杰，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)；繆秋紅，女，碩士，主要從事兔出血癥病毒分子生物學(xué)研究

劉光清， E-mail∶ liugq@shvri.ac.cn