牛源ISG15蛋白的原核表達及抗血清的制備

陶 潔，廖金虎，張 倩，張信軍，朱國強

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009；3.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106）

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牛源ISG15蛋白的原核表達及抗血清的制備

陶 潔1,2,3，廖金虎1,2，張 倩1,2，張信軍1,2，朱國強1,2

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009；3.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106）

本研究利用人重組干擾素IFNα-2A刺激牛腎細胞（Mardin-Darby bovine kidney cells, MDBK），并提取細胞總RNA。RT-PCR擴增牛源干擾素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15, ISG15），將其克隆入pCold-TF表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。經(jīng)IPTG誘導表達后，獲得約70 kDa可溶性ISG15重組蛋白。用試劑盒對重組蛋白ISG15進行純化回收，經(jīng)BCA法測定其蛋白濃度為1 mg/mL。用純化的ISG15重組蛋白免疫ICR小鼠，制備多克隆抗體血清，用間接ELISA方法測定多抗血清效價為1:102 400。利用Western blot進一步鑒定ISG15多抗血清，結果發(fā)現(xiàn)其與純化的ISG15重組蛋白能發(fā)生特異性反應，可用于后續(xù)研究。

ISG15；蛋白表達；多抗血清

1979年，F(xiàn)arrell等[1]首次發(fā)現(xiàn)干擾素可誘導產(chǎn)生一種15 kDa的蛋白質(zhì)，但當時并沒有引起重視。直到1984年，Korant等[2]報道使用干擾素處理人和牛細胞系，可誘導表達一種分子質(zhì)量為15 kDa的蛋白質(zhì)，且依賴細胞RNA合成。Blomstrom等[3]在1986年從Daudi細胞中克隆獲得人類ISG15的cDNA，當時所測定的ISG15序列中含有一個額外核苷酸，導致終止密碼子提前，由該序列所推導的翻譯產(chǎn)物分子質(zhì)量恰好為15 kDa，與先前試驗測定的分子質(zhì)量相一致，因此該基因被命名為干擾素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15, ISG15），編碼蛋白為ISG15蛋白。目前已從多種物種體內(nèi)擴增出ISG15，包括人、猴、熊貓、綿羊、奶牛、馬、狗、小鼠和大鼠、貓、兔等，ISG15在不同物種間同源性高低不等，最低為38%，最高為98%，但在絕大多數(shù)動物中，ISG15 C-末端都具有一個高度保守序列LRLRGG[4]。

ISG15蛋白是先天免疫抗病毒過程中一個重要因子。研究報道，ISG15主要通過ISG化和去ISG化參與宿主抗病毒作用，同時還通過細胞信號通路調(diào)節(jié)相關酶類參與細胞相關功能，這需要很多蛋白和細胞因子共同參與，例如JAK-STAT（酪氨酸激酶JAK）信號通路、細胞周期蛋白D1等[5]。目前對ISG15蛋白功能研究日漸深入，本研究克隆表達牛源ISG15，并制備抗ISG15多克隆抗體，為后續(xù)探索ISG15蛋白功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞、菌株和載體牛腎細胞（Madin-Darby bovine kidney cell, MDBK）由賓夕法尼亞大學Dr.Leonard R.Bello 贈與；大腸桿菌工程菌DH5α和重組蛋白表達受體菌大腸桿菌BL21（DE3）均由本實驗室保存；冷休克表達載體pCold-TF購于TaKaRa公司；pEASY-T1-simple載體購自北京全式金公司。

1.2 主要試劑T4 DNA鏈接酶、rTaq DNA聚合酶、DL2000、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit購自TaKaRa公司；Trans 2k Plus II Marker、TransStart FastPfu DNA Polymerase購自北京全式金公司；PageRulerTMPrestained Protein Ladder購自Thermo Scientific；TIANgen Midi Purification Kit購自 TIANGEN BIOTECH 公司；Donor Equine Serum（HS）購自Hyclone；DMEM細胞培養(yǎng)基購自CORNING公司；Protino Ni-TED 2000 packed columns購自德國Macherey-Nagel公司；HRP標記羊抗鼠IgG和DAB顯色液購自博士德公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 實驗動物6～8周齡ICR小鼠購自揚州大學實驗動物中心。

1.4 引物設計根據(jù)GenBank中ISG15序列設計一對引物，并在上下游引物末端分別添加Hind III和Pst I酶切位點（下劃線標注）。引物由上?；瞪锛夹g有限公司合成，ISG15-up：5'-CAAGCTTATGGGCGGGGAC CTGA-3'（Hind III），ISG15-low：5'-CTGCAGCC TACCCACCCCGAAGACGTA-3' (Pst I)。

1.5 干擾素刺激因子ISG15的克隆

1.5.1 人重組干擾素刺激MDBK細胞 將MDBK細胞鋪于6孔細胞板中，待單層細胞融合度達90%左右時，在細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為6000 U/mL人重組干擾素IFNα-2A，刺激MDBK細胞7 h[6]。

1.5.2 細胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照參考文獻[7]，提取經(jīng)IFNα-2A刺激后的MDBK細胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5.3 ISG15 PCR擴增 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴增ISG15，反應體系（50 μL）：2 μL cDNA、2 μL dNTP、上游和下游引物各1 μL、1 μL Pfu DNA Polymerase和43 μL超純水。PCR反應程序：94℃預變性2 min；94℃變性20 s、55℃退火20 s、72℃延伸20 s，進行25個循環(huán)；72℃延伸5 min。最后給PCR產(chǎn)物添加“A”尾巴，在上述PCR產(chǎn)物溶液中直接加入2 μL rTaq，PCR儀上72℃延伸20 min即可。1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測PCR擴增條帶的特異性及其大小。

1.5.4 PCR產(chǎn)物的純化 利用TIANgen Midi Purification Kit進行PCR擴增產(chǎn)物的純化。

1.5.5 連接與轉(zhuǎn)化 取4 μL PCR純化產(chǎn)物與1 μL pEASY-T1-simple載體混合均勻后在恒溫金屬浴上25℃連接10 min，然后參照文獻[8]操作步驟將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。

1.5.6 陽性克隆的篩選及測序 在轉(zhuǎn)化的氨芐抗性平板上挑取單個菌落接種于氨芐抗性LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)16 h。然后用堿裂解法提取質(zhì)粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小正確的陽性克隆重組質(zhì)粒pEASY-ISG15。將篩選出的陽性克隆送上海生物工程技術服務有限公司測序，每個樣品重復測序3次。1.5.7序列比對與分析 利用Lasergene軟件對測序所得序列進行剪接，并將其與GenBank中原序列進行比對分析。

1.6 重組原核表達質(zhì)粒的構建與鑒定用Hind III和Pst I雙酶切質(zhì)粒pEASY-ISG15和pCold-TF載體，回收目的片段ISG15和線性載體pCold-TF，然后用T4 DNA 連接酶將兩片段（目的片段∶載體= 3∶1）在16℃連接過夜。按上述操作步驟，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，并通過重組質(zhì)粒大小和雙酶切方法雙重鑒定，篩選陽性重組原核表達質(zhì)粒pCold-ISG15。

1.7 ISG15在pCold-TF載體中的原核表達[9]按照上述操作，將重組原核表達質(zhì)粒pCold-ISG15轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞（制作方法同DH5α感受態(tài)細胞）中，37℃培養(yǎng)過夜；次日從平板上挑取單菌落接種到氨芐LB液體培養(yǎng)基中制備種子液，37℃培養(yǎng)過夜；種子液按1∶100轉(zhuǎn)接并擴大培養(yǎng)，待菌液OD600達0.5左右時，15℃靜置30 min；然后加入終濃度為1.0 mol/L 的IPTG，15℃誘導培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液，10 800×g離心2 min，收集菌體并用等體積PBS洗滌2次；然后將PBS重懸物超聲破碎裂解，4℃、10 800×g離心5 min，取上清和沉淀分別制樣并配制12%的SDS-PAGE凝膠進行電泳。同時用pCold-TF轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，作陰性對照。

1.8 ISG15重組蛋白的純化及濃度測定參考文獻[10]，利用Protino Ni-TED 2000試劑盒純化 ISG15重組蛋白，并用BCA法測定純化蛋白的濃度。

1.9 ISG15重組蛋白多抗血清的制備與鑒定

1.9.1 免疫小鼠 選取6～8周齡的ICR雄性小白鼠，用純化的ISG15重組蛋白進行免疫。免疫程序：頸背部皮下多點注射弗氏完全佐劑乳化的ISG15蛋白，50 μg/只，2周后皮下注射弗氏不完全佐劑乳化的等量ISG15蛋白，二免后2周再次皮下注射弗氏不完全佐劑乳化的等量ISG15蛋白，三免后1周加強免疫ISG15蛋白，50 μg/只，不加弗氏佐劑。

1.9.2 ELISA法測定血清效價 四免后1周斷尾法采集每只小鼠的血液，4℃過夜析出血清，收集血清用ELISA方法測定效價。以未進行免疫的ICR雄性小鼠血清作陰性對照，PBST作為空白對照調(diào)零孔，在酶標板上進行方陣試驗。將純化的ISG15蛋白用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋成不同梯度：10、8、4、2、1 μg/mL，橫向加入酶標板中，每孔100 μL，37℃孵育2 h后4℃過夜；次日， PBST洗滌3次，每次5 min，拍干，加封閉液（10% HS+PBST）封閉，150 μL/孔，37℃孵育2 h，洗滌；加入待檢血清，用PBST進行800、1600、3200、6400、12 800、25 600倍稀釋，縱向加樣，100 μL/孔，37℃孵育1 h，洗滌；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（按1∶6000用PBST進行稀釋），100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗滌；加入TMB顯色液，100 μL/孔，37℃作用10～15 min；加入2 mol/L H2SO4（50 μL/孔）終止反應，測OD450。判斷標準：待檢孔的OD值/陰性孔的OD值≥2.1即可判為陽性。

1.9.3 Western blot檢測ISG15多克隆抗體 取4 μg純化后的ISG15重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后通過濕轉(zhuǎn)膜儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane, NC）上，轉(zhuǎn)印條件為恒流0.35 A，轉(zhuǎn)印時間為90 min；轉(zhuǎn)印結束后，將NC膜置于5%脫脂奶粉中37℃封閉2 h；PBST洗滌3次，每次5 min；用ISG15多抗血清（1∶3000稀釋）孵育1 h，洗滌；然后加入HRP標記的羊抗鼠IgG （1∶3000稀釋）孵育1 h，洗滌；最后，配制DAB顯色液（在10 mL 超純水中分別加入3滴A、B、C試劑混勻）進行顯色并拍照記錄結果[11]。

1.9.4 分離血清 摘眼球法采集小鼠血液后，37℃放置30 min，然后4℃放置2 h，10 000×g離心10 min，吸取的上清即為ISG15多抗血清，經(jīng)過濾除菌后4℃保存。

2 結果

2.1 ISG15的PCR產(chǎn)物提取IFNα-2A刺激后MDBK細胞的總RNA，RT-PCR擴增ISG15，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示ISG15 PCR擴增產(chǎn)物大小約為500 bp，與理論大小469 bp相符（圖1）。

圖1 ISG15的RT-PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR amplifi cation of ISG15

圖2 pEASY-ISG15質(zhì)粒的PCR檢測和雙酶切鑒定Fig.2 Identifi cation of pEASY-ISG15 by PCR and double restriction enzyme digestion

2.2 重組T載體質(zhì)粒的鑒定將ISG15目的片段克隆入pEASY-T1-simple載體后，提取重組質(zhì)粒pEASY-ISG15進行PCR和雙酶切鑒定。如圖2，pEASY-ISG15質(zhì)粒大小約為4300 bp，與預期相符。以pEASY-ISG15質(zhì)粒為模板，用ISG15擴增引物進行PCR鑒定，結果能擴增出約500 bp條帶。此外，用Hind III和Pst I雙酶切pEASY-ISG15質(zhì)粒，獲得約3850 bp和469 bp兩條目的片段，電泳結果與預期相符，說明ISG15成功插入pEASY T1 simple載體中。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送華大基因有限公司測序，用Lasergene軟件進行序列剪切，并與GenBank中牛ISG15原序列進行比對，結果確定成功插入pEASYT1-simple載體的ISG15序列沒有突變，該重組質(zhì)?？捎糜诤罄m(xù)克隆操作。

2.3 原核表達重組質(zhì)粒的鑒定參照上述方法，對原核表達重組質(zhì)粒pCold-ISG15進行鑒定。如圖3，質(zhì)粒pCold-ISG15大小約為6200 bp，用Hind III和Pst I雙酶切pCold-ISG15后，獲得約5700 bp的載體片段和469 bp的ISG15目的條帶，電泳結果與預期相符。此外，PCR鑒定結果顯示能擴增出大小約500 bp的條帶，亦與預期相符。說明ISG15原核表達重組質(zhì)粒構建成功。

圖3 pCold-ISG15質(zhì)粒的PCR檢測和雙酶切鑒定Fig.3 Identifi cation of pCold-ISG15 plasmid by PCR and double restriction enzyme digestion

2.4 ISG15重組蛋白的表達與鑒定將ISG15克隆至冷表達載體pCold-TF中進行原核表達，重組菌誘導表達后用SDS-PAGE鑒定。如圖4，與空載體對照相比，誘導表達的重組質(zhì)粒pCold-ISG15明顯多出一條分子量約為70 kDa的特異條帶（標簽TF約55 kDa）。用超聲波破碎裂解菌體，發(fā)現(xiàn)ISG15重組蛋白存在于菌體裂解上清中，即ISG15重組蛋白以可溶性融合蛋白形式存在（圖5）。

用Protino Ni-TED 2000試劑盒進行ISG15重組蛋白純化，如圖6，與重組蛋白的過柱液相比較，我們獲得了ISG15重組蛋白的純化產(chǎn)物，且蛋白濃度較高。

圖4 ISG15蛋白誘導表達鑒定Fig.4 Identifi cation of the recombinant protein ISG15

圖5 ISG15重組蛋白可溶性鑒定Fig.5 Identifi cation of the solubility of the recombinant protein ISG15

圖6 ISG15重組蛋白純化結果Fig.6 Purifi cation results of recombinant protein ISG15

2.5 ISG15多克隆抗體的鑒定

2.5.1 ELISA方法檢測多抗血清效價 以純化的ISG15重組蛋白為檢測抗原，以非免疫小鼠的血清作為陰性對照，以PBST作為空白調(diào)零對照，經(jīng)酶標儀讀取OD450值。判斷標準：待測孔的OD值/陰性孔的OD值≥2.1即可判定為陽性。經(jīng)測定，在ISG15蛋白濃度為0.8 μg/mL時，小鼠多抗血清效價為1∶102 400。

2.5.2 Western blot檢測多抗 用純化的ISG15重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后用制備的小鼠多抗血清作為一抗進行Western blot檢測，結果表明，在約70 kDa大小處有明顯的顯色帶（圖7），說明制備的多克隆抗體能很好和重組蛋白發(fā)生反應。

圖7 ISG15蛋白多克隆抗體的Western blot檢測Fig.7 Detection of anti-ISG15 polyclonal antibodies by Western blot

3 討論

ISG15是干擾素誘導表達最強的ISG之一，也是第一個被鑒定的ISG[12]。ISG15蛋白由ISG15編碼，病毒感染和I型干擾素刺激均能強烈誘導其表達，在抗病毒天然免疫過程中具有重要調(diào)節(jié)作用[13]。為了開展ISG15和BVDV相關作用關系的探究，本研究將ISG15克隆至pCold-TF原核表達載體上，利用其ATG作為目的基因的起始密碼子，在噬菌體T7 lac啟動子強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制下，ISG15重組蛋白在E.coli BL21（DE3）中得到正確且高效的表達。將純化后ISG15重組蛋白免疫小鼠，為了提高多抗血清效價，我們將免疫程序進行了稍微調(diào)整，即在常規(guī)免疫程序二免2周后，按照二免程序再加免1次（弗氏不完全佐劑和純化的蛋白等體積混合），隔2周直接用純化的重組蛋白加強免疫。經(jīng)間接ELISA檢測證實，我們獲得的抗ISG15蛋白多抗血清效價較高，達1∶102 400。Western blot鑒定結果也證實獲得的ISG15蛋白多抗血清能與純化的ISG15蛋白發(fā)生較好的特異性反應，說明此多抗血清可用于后續(xù)實驗，為后續(xù)開展ISG15的相關研究奠定了基礎。

本研究所用pCold-TF是一種冷休克表達載體，它利用冷休克基因cspA啟動子進行外源蛋白質(zhì)表達，在cspA下游的lac operator可以嚴格調(diào)控目的基因表達。載體上Trigger factor（TF）是大腸桿菌來源的分子伴侶基因，作為可溶性蛋白標簽，可與目的基因進行融合表達，提高目的蛋白的可溶性。通常，重組菌經(jīng)15℃低溫誘導24 h后，表達的目的蛋白幾乎都在細胞質(zhì)中呈可溶性表達，而且表達產(chǎn)量高?？扇苄缘鞍拙哂刑烊坏目臻g結構，能夠保持天然構象，直接作為抗原免疫動物時，激活B細胞產(chǎn)生的抗體能識別的表位包括構象表位和線性表位，增強了多克隆抗體的免疫原性。此外，表達的目的蛋白氨基端帶有6個His融合標簽，便于使用商品化Ni柱蛋白純化試劑盒進行重組蛋白純化。

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PROKARYOTIC EXPRESSION OF ISG15 PROTEIN AND PREPARATION OF ANTI-ISG15 POLYCLONAL ANTIBODIES

TAO Jie1,2,3, LIAO Jin-hu1,2, ZHANG Qian1,2, ZHANG Xin-jun1,2, ZHU Guo-qiang1,2

(1.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009,China; 2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease and Zoonosis, Yangzhou 225009,China; 3.Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Shanghai 201106,China)

In the present study, total RNA was extracted from MDBK cells stimulated with recombinant human interferon IFN α-2A and interferon-stimulated gene 15 (ISG15) was amplifi ed using RT-PCR.Then, ISG15 gene was cloned into prokaryotic expression vector pCold-TF and transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells.Soluble ISG15 protein with molecular mass of 70 kDa was expressed following induction with IPTG and purifi ed.The concentration of the purifi ed ISG15 was 1mg/mL as measured in BCA kit.Subsequently, ICR mice were inoculated with the purifi ed ISG15 for preparation of polyclonal antibodies.Blood samples were collected from mice post the fourth immunization and antibody titer was 1: 102 400 as detected in indirect ELISA.The reactivity of antiserum preparation to purifi ed ISG15 was confi rmed in Western blot.

ISG15; protein expression; antiserum

S852.4

A

1674-6422（2015）02-0068-06

2014-12-16

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；重大動物疫病防控技術引進（國家農(nóng)業(yè)部948計劃，2011-G24）；江蘇省屬高校自然科學重大基礎研究項目（14KJA230001）；江蘇省農(nóng)業(yè)支撐項目（BE2014358）；泰州市農(nóng)業(yè)科技計劃項目（TZ201421）

陶潔，女，碩士研究生，微生物學專業(yè)；廖金虎，男，碩士研究生，微生物學專業(yè)

朱國強，E-mail：yzgqzhu@hotmail.com; yzgqzhu@yzu.edu.cn