柔嫩艾美耳球蟲沉默信息調(diào)節(jié)因子2真核表達質粒的構建及在細胞中的表達

楊斯涵，趙其平，韓紅玉，朱順海，李 莎，翟 頎，梁思婷，楊亮宇，黃 兵，董 輝

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241）

·研究論文·

柔嫩艾美耳球蟲沉默信息調(diào)節(jié)因子2真核表達質粒的構建及在細胞中的表達

楊斯涵1,2，趙其平2，韓紅玉2，朱順海2，李 莎2，翟 頎2，梁思婷2，楊亮宇1，黃 兵2，董 輝2

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241）

為構建柔嫩艾美耳球蟲沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Eimeria tenella silent information regulator 2，EtSIR2）的真核表達質粒，以柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA為模板，PCR擴增出EtSIR2基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切回收純化目的片段后與經(jīng)相應酶切的真核表達載體pCAGGs連接。連接產(chǎn)物經(jīng)PCR和酶切鑒定，再經(jīng)測序鑒定正確后，分別轉染DF-1細胞和BHK細胞進行表達，用Western blot 和間接免疫熒光鑒定EtSIR2基因的表達情況。結果表明：成功擴增了EtSIR2基因，長度為909 bp；Western blot可見大小約為37 kDa的表達蛋白條帶；間接免疫熒光可以檢測到特異性綠色熒光，表明成功構建了EtSIR2的真核表達質粒pCAGGs-EtSIR2，并能在哺乳動物細胞和禽類細胞中表達。該研究結果為深入研究EtSIR2的生物學特性和球蟲DNA疫苗的研制打下了基礎。

柔嫩艾美耳球蟲；沉默信息調(diào)節(jié)因子2；DF-1細胞；BHK細胞；真核表達

雞球蟲病是一種全球性原蟲病，其中集約化養(yǎng)雞場是球蟲爆發(fā)的主要場所，每年給全世界養(yǎng)殖業(yè)造成的直接經(jīng)濟損失高達5億英鎊，美國農(nóng)業(yè)部將該病列為對禽類危害最嚴重的五大疾病之一[1]。目前，雞球蟲病的防治主要以抗球蟲藥物為主，但隨著藥物的不斷使用，雞球蟲抗藥性日益嚴重[2]，獸藥殘留等引起的食品安全問題日益受到人們的重視，所以迫切需要更為理想的防治球蟲病方法。實踐表明，疫苗免疫預防雞球蟲病可獲得良好的效果，成為雞球蟲病防治的趨勢[3,4]，其中，核酸疫苗作為第三代疫苗，具有安全、穩(wěn)定、高效、使用方便等特點，逐漸成為人們研究的熱點[5]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2 (silent information regulator 2, SIR2) 首先在酵母中被發(fā)現(xiàn)[6]，是一類具有依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）去乙?；富钚缘慕M蛋白去乙酰化酶，存在于從古生菌到高等真核生物的多種生物細胞中，在染色質沉默、基因調(diào)控、代謝調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細胞壽命等一系列細胞生物活動過程中起重要作用[7,8]。SIR2基因已在瘧原蟲（Plasmodium）[9]、錐蟲（Trypanoma）[10]、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）[7]、犬新孢子蟲（Neospora caninum）[7]、利什曼原蟲（Leishmania）[11]、藍氏賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia）[12]等寄生蟲相繼報道，并發(fā)現(xiàn)其在寄生蟲的抗原變異、端粒沉默和DNA修復等生理過程中發(fā)揮重要作用[7]。

鄢遠會等[13]首次對柔嫩艾美耳球蟲沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Eimeria tenella SIR2，EtSIR2）基因初步特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與雞的同源性僅為25%，提示其蛋白質特性與宿主的明顯不同，可作為藥物靶標。本研究旨在構建EtSIR2的pCAGGs真核表達質粒，通過Western blot和間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay，IFA）鑒定真核質粒是否在DF-1細胞和BHK細胞中成功表達，為進一步研究EtSIR2的生物學特性和研制球蟲DNA疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA、兔源性抗rEtSIR2多抗、DF-1細胞和BHK細胞由本課題組制備保存；真核表達載體pCAGGs由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所禽病研究室李澤君老師饋贈；2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000、DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、TOP10感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；pGEM-T-easy vector、T4 DNA連接酶購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ購自大連寶生物工程有限公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；胎牛血清、DMEM、Opti-MEM購自Gibco公司；Western和IP細胞裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；近紅外熒光羊抗兔二抗購自LICOR公司；綠色熒光標記山羊抗兔二抗購自Jackson Immuno Research公司。

1.2 EtSIR2基因的克隆根據(jù)http∶//www.genedb.org/Homepage/Etenella中EtSIR2基因（登錄號：ETH 00033350）序列設計引物，擴增該基因完整的ORF序列，預計長度為909 bp。引物由上海賽百盛生物技術有限公司合成，其中上游引物序列為5'-GCGAATTCATGGGCCAGTGGT TAACAT-3'，下游引物序列為5'-GCCTCGAG TCATTCATTTTCCCCTGGG-3'，上下游引物分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點（標有下劃線的堿基）。以柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA為模板進行常規(guī)PCR擴增，反應體系為20 μL。反應參數(shù)：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進行35個循環(huán)；72℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收目的片段。

1.3 真核表達質粒的構建將EtSIR2的PCR產(chǎn)物和pCAGGs表達載體質粒分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收目的片段，16℃連接過夜。連接反應液轉入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞中，涂板培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于4 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，進行PCR鑒定。對鑒定為陽性的菌液提取質粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定，陽性克隆送至上海桑尼公司進行測序。

1.4 DF-1細胞和BHK細胞的復蘇培養(yǎng)凍存的DF-1細胞和BHK細胞經(jīng)復蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，傳代2代，至細胞生長狀態(tài)良好。轉染前，收集DF-1細胞和BHK細胞進行細胞計數(shù)，以每孔6×105個細胞鋪被6孔板2塊，37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，按照Lipofectamine 2000脂質體轉染操作步驟，將重組質粒pCAGGs-EtSIR2分別轉染DF-1細胞和BHK細胞，并設pCAGGs空載體以及正常DF-1細胞和BHK細胞對照組，用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h后，更換為含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，取一塊6孔板進行間接免疫熒光檢測，收集另一塊6孔板的細胞用于Western blot檢測。

1.5 Western blot鑒定真核表達質粒在DF-1細胞和BHK細胞中表達情況收集步驟1.4中培養(yǎng)48 h的DF-1細胞和BHK細胞，加入Western及IP細胞裂解液200 μL，15 294×g 離心5 min，取上清進行SDSPAGE電泳。半干法電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜；PBST洗滌3次，加入1∶100稀釋的抗rEtSIR2蛋白兔血清，室溫孵育2 h；PBST洗滌3次，加入1∶10 000稀釋的近紅外熒光羊抗兔二抗，室溫孵育2 h， PBS洗滌8次，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行拍照。

1.6 IFA鑒定真核表達質粒在DF-1細胞和BHK細胞中表達情況取步驟1.4中培養(yǎng)48 h的DF-1細胞和BHK細胞，棄去細胞培養(yǎng)液，自然風干后，PBS洗滌2次；每孔加2 mL 2%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，每孔再加入1% TritonX-100 2 mL，室溫下作用15 min，PBS洗3次；每孔加入2% BSA-PBS 2 mL，4℃封閉過夜，PBS洗滌3次；加入抗rEtSIR2蛋白兔血清（1∶100倍稀釋），37℃作用1 h，PBS洗滌3次，PBS浸泡30 min；加入1∶400稀釋的綠色熒光標記的山羊抗兔二抗，37℃作用1h，PBS洗滌3次，PBS浸泡30 min，在蓋玻片上滴適量熒光猝滅劑，正置熒光顯微鏡下觀察，拍照保存。

2 結果

2.1 EtSIR2基因的克隆以柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA為模板，用所設計合成的特異性引物擴增出1條大約1000 bp的目的條帶，其大小與預期目的條帶909 bp一致（圖1）。

圖1 EtSIR2 的PCR 擴增結果Fig.1 The result of PCR amplifi cation of EtSIR2 gene

2.2 真核表達質粒的構建與鑒定

2.2.1 pCAGGs-EtSIR2質粒的構建與鑒定 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別對EtSIR2的PCR產(chǎn)物和空載體pCAGGs進行雙酶切，純化后進行連接，對連接產(chǎn)物轉化菌進行PCR和雙酶切鑒定，結果均為陽性（圖2、3），測序結果顯示該基因正向插入，無移碼突變（圖略），表明pCAGGs-EtSIR2重組質粒構建成功。

圖2 重組質粒pCAGGs-EtSIR2 的PCR鑒定結果Fig.2 Identifi cation of recombinant plasmid pCAGGs-EtSIR2 by PCR

圖3 重組質粒pCAGGs-EtSIR2 的雙酶切鑒定結果Fig.3 Identifi cation of recombinant plasmid pCAGGs-EtSIR2 by enzyme digestion analysis

2.2.2 Western blot分析pCAGGs-EtSIR2在DF-1細胞和BHK細胞中的表達 結果顯示，在pCAGGs-EtSIR2重組質粒轉染的DF-1細胞和BHK細胞中均可檢測到大小約為37 kDa的目的條帶，而轉染空載體的DF-1細胞和BHK細胞中均沒有相應的條帶出現(xiàn)（圖4）。

2.2.3 間接免疫熒光檢測pCAGGs-EtSIR2在DF-1細胞和BHK細胞中的表達 利用抗rEtSIR2蛋白的兔血清，分別對pCAGGs-EtSIR2重組質粒轉染48 h后的DF-1細胞和BHK細胞進行了免疫熒光檢測。結果顯示，在pCAGGs-EtSIR2重組質粒轉染的DF-1細胞和BHK細胞中，均可看到特異性的綠色熒光；而在轉染了pCAGGs空載體的DF-1細胞和BHK細胞中，無綠色熒光（圖5）。

3 討論

核酸疫苗作為一種新型疫苗，成為近年來研究的熱點。與傳統(tǒng)的疫苗相比，核酸疫苗具有免疫效果好、安全性高、免疫應答持久、易于研制生產(chǎn)等優(yōu)點[14]。影響核酸疫苗效果的因素包括適宜抗原、載體類型及免疫佐劑等[15]。

雞球蟲核酸疫苗的研制始于20世紀80年代末，至今已經(jīng)篩選到了許多具有免疫保護性的球蟲抗原，構建了一批基因重組疫苗。用于核酸疫苗研制的球蟲抗原主要集中在與入侵相關的細胞器抗原（如微線蛋白MIC2、折光體蛋白SO7）、入侵宿主細胞階段（包括子孢子和裂殖子）的表面抗原（如TA4、3-1E、cSZ-1）和配子體抗原（如GAM230、GAM82、GAM56），其保護效果已經(jīng)被大量的研究所證實，但更多的抗原仍有待發(fā)現(xiàn)和研究[16]。

圖4 真核表達質粒轉染DF-1細胞和BHK細胞的Western blot鑒定結果Fig.4 Identifi cation of EtSIR2 protein in DF-1 and BHK cells transfected with eukaryotic recombinant plasmid by Western blot

本文所選用的抗原分子SIR2，能夠改變?nèi)旧|結構從而導致染色質沉默，而染色質沉默又是基因表達調(diào)控的重要方式[7]。SIR2在基因表達調(diào)控和調(diào)節(jié)細胞壽命等生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，近年來被作為抗病原微生物藥物靶標成為了研究的熱點[13]。目前已在瘧原蟲、賈第蟲、錐蟲等寄生蟲發(fā)現(xiàn)了SIR2的同源蛋白，并發(fā)現(xiàn)它們在寄生蟲的基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[17,18]。瘧原蟲SIR2能直接作用于變異抗原var的啟動子區(qū)域，與起始識別復合物1（origin recognition complex 1 protein，ORC1）共同介導端粒區(qū)沉默[19]，影響var編碼的毒力因子的表達[20,21]，是瘧原蟲重要的毒力因子，并與表面抗原變異相關[22]。利什曼原蟲SIR2基因與蟲體的毒力相關，是蟲體生存的必需基因[23,24]，并可以誘導小鼠B細胞的增殖，產(chǎn)生特定抗體，在免疫反應中發(fā)揮重要作用[11]。錐蟲SIR2的同源蛋白參與端粒沉默，但并不是其表面抗原變異所必須的[25]。在賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia）也發(fā)現(xiàn)了包括SIR2在內(nèi)的多種組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）[12]，使用HDACs抑制劑后，賈第鞭毛蟲體內(nèi)組蛋白的乙?；皆黾?；在成囊過程中使用HDACs抑制劑FR235222后，囊壁蛋白（cyst wall protein）的表達降低，影響包囊的形成。柔嫩艾美耳球蟲SIR2氨基酸序列與瘧原蟲、弓形蟲、新孢子蟲等低等生物具有較高的相似性（42%～58%），說明寄生性原蟲擁有保守的SIR2序列，而與高等生物人和雞的氨基酸序列相似性僅有24%～25%，說明EtSIR2在蛋白結構上與其宿主具有明顯差異，提示可作為抗寄生蟲藥物研究的重要靶標，已發(fā)現(xiàn)尼克酰胺（nicotinamide，NAM）能夠抑制EtSIR2的活性[13]。

圖5 真核表達質粒轉染DF-1細胞和BHK細胞IFA檢測結果Fig.5 Detection of EtSIR2 protein in DF-1 cells and BHK cells transfected with eukaryotic recombinant plasmid by IFA

質粒載體是核酸疫苗的主體，表達抗原蛋白的能力越強，有效激發(fā)免疫應答就越強。與原核表達系統(tǒng)相比，真核表達載體系統(tǒng)所表達的外源蛋白具有天然蛋白的生物活性，更能發(fā)揮其生物學功能。在球蟲核酸疫苗研究中常用的真核表達質粒包括pcDNA3.1[26]、pVAX1[27,28]、pMPl3[29]。本研究所用的pCAGGs 載體含有雞β-actin 啟動子與CMV 增強子序列構成的雜合啟動子，在基因的表達方面具有優(yōu)勢[30]，已應用于H5亞型禽流感[31]、新城疫病毒[32]、H1亞型豬流感[33]、鴨坦布蘇病毒[34]等動物疾病的核酸疫苗研制中。采用該載體，本實驗室已成功構建了柔嫩艾美耳球蟲棒狀體頸部蛋白2（rhoptry neck protein 2，RON2）、鈣依賴蛋白激酶 3（calcium-dependent protein kinases 3，CDPK3）、頂體膜蛋白1（apical membrane antigen，EtAMA1）、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）等基因的真核表達質粒，動物免疫保護性試驗結果表明，所構建的核酸疫苗對免疫雞可產(chǎn)生較好的免疫保護性[35]。

所構建的抗原基因真核表達質粒能在細胞內(nèi)成功表達是核酸疫苗成功的關鍵。本研究利用IFA和Western blot檢測了所構建的pCAGGs-EtSIR2真核表達質粒在哺乳動物細胞（BHK細胞）和禽類細胞（DF-1細胞）情況，結果顯示，所構建的真核表達質粒均可在這兩種細胞內(nèi)成功表達，表明真核表達質粒pCAGGs-EtSIR2構建成功，為進一步研究該蛋白的生物學功能和研制球蟲DNA疫苗奠定了基礎。

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CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF EUKARYOTIC EXPRESSION PLASMID CONTAINING SILENT INFORMATION REGULATOR 2 GENE OF EIMERIA TENELLA

YANG Si-han1,2, ZHAO Qi-ping2, HAN Hong-yu2, ZHU Shun-hai2, LI Sha2, ZHAI Qi2, LIANG Si-ting2, YANG Liang-yu1, HUANG Bing2, DONG Hui2

(1.College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2.Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The full-length cDNA of silent information regulator 2 of Eimeria tenella (EtSIR2) was amplifi ed in PCR from the cDNA of the second-generation merozoites in order to construct the eukaryotic expression plasmid.The PCR products and pCAGGs vectors were digested with the same restriction enzymes and ligated.The recombinant EtSIR2 plasmid was confi rmed through PCR, enzyme digestion and sequencing and then transfected into DF-1 cells and BHK cells, respectively.The expression of recombinant EtSIR2 in the transfected cells was examined in indirect immunofl uorescence assay (IFA) and Western blot.The results showed that the EtSIR2 gene was 909 bp in length.Western blot also indicated that the antiserum to recombinant EtSIR2 strongly recognized a protein with molecular mass at 37 kDa in the transfected cells.Specifi c green fl uorescence was observed in IFA.Construction and eukaryotic expression of EtSIR2 has laid the foundation for future research on biological functions and DNA vaccine.

Eimeria tenella; silent information regulator 2; DF-1 cell; BHK cell; eukaryotic expression

S852.723

A

1674-6422（2015）02-0053-07

2014-12-02

國家自然科學基金（31272557）

楊斯涵，女，碩士研究生，臨床獸醫(yī)學專業(yè)

董輝，E-mail∶ donghui@shvri.ac.cn；楊亮宇，E-mail∶ yangliangyu2004@163.com