湖南省豬源糞腸球菌耐藥性分析

王送林，李蕓芳，劉秋菊，朱 娜，蔣 偉，鄧治邦，黎滿香

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128）

·研究論文·

湖南省豬源糞腸球菌耐藥性分析

王送林，李蕓芳，劉秋菊，朱 娜，蔣 偉，鄧治邦，黎滿香

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128）

為了解湖南省豬源糞腸球菌臨床分離株的耐藥性及各耐藥基因的分布情況，使用K-B法檢測了42株豬源糞腸球菌對11種抗生素的敏感性，采用PCR方法檢測了糞腸球菌中8種耐藥基因的分布情況。結(jié)果顯示，湖南省臨床分離的42株糞腸球菌對大部分的抗生素高度耐藥，對四環(huán)素、氯霉素、苯唑青霉素、紅霉素、米諾霉素、左氧氟沙星、高濃度慶大霉、高濃度鏈霉素、環(huán)丙沙星、萬古霉素、青霉素G的耐藥率依次為100%、92.9%、88.1%、83.3%、81%、57.1%、52.4%、47.6%、45.2%、31%、11.9%；耐藥基因的檢出率為Aac（6）'/aph（2''）97.6%、ant（6）'-Ⅰ 90%、aph（3）'-Ⅲ76.2%、tetM90.5%、ermB 73.8%、VanA 4.8%、VanB 54.8%、VanC 88.1%。從表型與基因型共同分析糞腸球菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌的多耐藥性嚴(yán)重，其耐藥表型與耐藥基因并不完全一致。

糞腸球菌；耐藥性；耐藥基因

糞腸球菌是人和動物腸道內(nèi)的正常菌群之一，也是一種條件致病菌，能引起腦膜炎、尿路感染、敗血癥、腹腔感染等多種感染[1]。近年來不斷有動物感染糞腸球菌的報道[2]，糞腸球菌在獸醫(yī)臨床的分離率不斷增多?？咕幬锏拇罅渴褂?，使糞腸球菌進(jìn)化出許多針對抗生素的機(jī)制，并產(chǎn)生了對應(yīng)的耐藥基因，同時這些耐藥基因還能通過轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、基因盒-整合子系統(tǒng)、基因插入、質(zhì)粒、細(xì)菌染色體交換等方式，從一種細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌，或者從這一株細(xì)菌轉(zhuǎn)移到其他同種的細(xì)菌，使臨床治療糞腸球菌感染成為一大難題。為了解臨床分離糞腸球菌的耐藥情況，為臨床治療提供根據(jù)，本文對湖南省臨床分離的42株糞腸球菌的藥敏情況及耐藥基因進(jìn)行了分析研究。

1 材料與方法

1.1 菌株試驗(yàn)菌株包括從湖南省各地送檢病豬腦、脾臟、肺臟、關(guān)節(jié)等組織分離的42株糞腸球菌[3]以及糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212。

1.2 儀器與試劑ZHJH-1214B型凈化工作臺購自上海智城分析儀器制造有限公司；ABI 2720型PCR擴(kuò)增儀及成像系統(tǒng)購自美國ABI公司；AYJI-1002-U型超純水儀購自臺灣艾科浦；DYY-6C型電泳儀及DYPZ-24E型電泳槽購自北京六一儀器廠； YXQLS-18SI型自動高壓滅菌器購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；藥敏紙片及標(biāo)準(zhǔn)菌株皆購自杭州天和微生物試劑有限公司；Taq DNA聚合酶和dNTP購自天根生物工程公司。

1.3 藥敏試驗(yàn)在凈化工作臺內(nèi)取吸光度已調(diào)節(jié)至0.08～0.1范圍內(nèi)的稀釋菌液100 μL均勻、全面地涂布于TSA平板上后，將平板置于凈化工作臺內(nèi)10～15 min直至表面液體被培養(yǎng)基吸收，然后將藥敏紙片根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最大抑菌圈的大小輕輕一次性貼于平板表面，37℃靜置培養(yǎng)18～24 h后測量結(jié)果（據(jù)NCCLS參考方案，由于萬古霉素作用時間緩慢，應(yīng)當(dāng)靜置培養(yǎng)24h以上才能觀察結(jié)果）。藥敏紙片包括：四環(huán)素（30 μg/片）、紅霉素（15 μg/片）、萬古霉素（30 μg/片）、米諾霉素（30 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、苯唑青霉素、青霉素G (10萬單位)、環(huán)丙沙星（5 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、高濃度慶大霉素（120 μg/片）、高濃度鏈霉素（300 μg/片）。

1.4 PCR擴(kuò)增耐藥基因

1.4.1 擴(kuò)增引物 擴(kuò)增所用引物[4]見表1，由上海生物工程有限公司合成。

表1 耐藥基因擴(kuò)增引物Table1 The primers used to amplify resistance genes

1.4.2 PCR擴(kuò)增耐藥基因 PCR擴(kuò)增體系如下：10×Buffer緩沖液2 μL、dNTP混合物1 μL、上下游引物各0.2 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、模板1 μL、加滅菌ddH2O將體系調(diào)至20 μL。擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，各耐藥基因按表1中的溫度退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物在1 g/mL的瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照進(jìn)行結(jié)果對比分析，產(chǎn)生預(yù)計擴(kuò)增大小的條帶為陽性，無預(yù)計大小條帶的為陰性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果湖南省臨床分離的42株糞腸球菌均呈現(xiàn)為多重耐藥，所有的菌株都對3種或3種以上的抗生素耐藥，有3株糞腸球菌對11種抗生素全部耐藥。所有的糞腸球菌對四環(huán)素全部耐藥；對其他幾種抗生素的耐藥性由高到低依次為氯霉素（92.9%）、苯唑青霉素（88.1%）、紅霉素（83.3%）、米諾霉素（81.0%）、左氧氟沙星（57.1%）、高濃度慶大霉素（52.4%）、高濃度鏈霉素（47.6%）、環(huán)丙沙星（45.2%）、萬古霉素（31.0%）、青霉素G（11.9%）。糞腸球菌對青霉素最為敏感，敏感率為（88.1%）。結(jié)果詳見表2。

2.2 耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析，湖南省臨床分離的42株糞腸球菌中除VanA的檢出率為4.8%（2/42），其他耐藥基因的檢出率都相當(dāng)高，均在50%以上，Aac（6）'/aph （2''）的檢出率更是高達(dá)97.6%（41/42）。見表3。aph(3)'-Ⅲ和ermB耐藥基因電泳結(jié)果見圖1和圖2。

表2 42株糞腸球菌的藥敏情況Table2 Drug susceptibility rates of 42 stains of Enterococcus faecalis

2.3 42株糞腸球菌耐藥表型與基因型比較42株耐四環(huán)素的糞腸球菌有38株檢出tetM基因，符合率為90.5%。耐紅霉素的35株糞腸球菌中有29株檢出ermB，符合率為82.9%；6株對紅霉素中介的菌株中2株檢出ermB。13株耐萬古霉素的糞腸球菌中有2株同時檢出VanA、VanB、VanC基因；對萬古霉素中介或敏感的29株菌有15株檢出VanB，24株檢出VanC；只有2株對萬古霉素敏感的糞腸球菌未檢測到VanA、VanB、VanC。31株對高濃度慶大霉素或高濃度鏈霉素耐藥糞腸球菌中，全部檢出氨基糖苷類修飾酶基因Aac(6)'/aph(2'')，27株檢出aph(3)'-Ⅲ，24株檢出ant(6)'-Ⅰ；11株對氨基糖苷類藥物敏感菌株有6株檢測到Aac(6)'/aph(2'')，2株檢出aph(3)'-Ⅲ，2株檢出ant(6)'-Ⅰ。從耐藥表型與基因型的比較中可發(fā)現(xiàn)有些菌株表型耐藥但未檢出耐藥基因，也有些菌株表型敏感但檢測出有耐藥基因，詳見表4。

表3 42株糞腸球菌耐藥基因的檢出率Table3 The detection rate of resistance genes in 42 stains of Enterococcus faecalis

圖1 aph（3）'-Ⅲ基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplifi cation of aph（3）'-Ⅲ gene

3 討論

本研究結(jié)果顯示，湖南省臨床分離的42株豬源糞腸球菌對于抗生素的耐藥性相當(dāng)高，尤其是對四環(huán)素全部不敏感。對氯霉素、苯唑青霉素、米諾霉素、紅霉素的耐藥率均在80%以上，對左氧氟沙星的耐藥率也達(dá)到了57%。發(fā)現(xiàn)了對萬古霉素耐藥的糞腸球菌13株，并有26.2%的糞腸球菌對萬古霉素呈耐藥中介。對青霉素G的敏感率為88.1%，表明青霉素G是治療糞腸球菌感染較好的抗生素。本次所測得的結(jié)果全部比羅燕萍等[5]在醫(yī)院監(jiān)測的結(jié)果高出許多，這可能是因?yàn)楂F醫(yī)用抗生素不僅僅用于預(yù)防和治療疾病，還作為生長促進(jìn)劑添加在動物飼料中以增加經(jīng)濟(jì)效益[6]。

圖2 ermB基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR amplifi cation of ermB gene

腸球菌對于四環(huán)素的耐藥，多是由于可移動性元件介導(dǎo)的tetM基因編碼的蛋白質(zhì)-核糖體保護(hù)蛋白（RPPS）和核糖體結(jié)合蛋白，二者聯(lián)合作用，阻止了體內(nèi)四環(huán)素與其藥物靶點(diǎn)結(jié)合蛋白的結(jié)合，從而使細(xì)菌對四環(huán)素耐藥。本研究對于四環(huán)素的耐藥率高達(dá)100%，tetM基因的檢出率為90.5%，比劉晶[7]等報道的檢測結(jié)果顯著偏高?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的與紅霉素耐藥性相關(guān)的基因有mefA、ermB，它們共同編碼合成紅霉素核糖體甲基化酶，這種酶能使23S rRNA的DNA堿基甲基化，從而使該基因不能表達(dá)出生物活性物質(zhì)，使之對紅霉素耐藥。本研究檢測了已報道的由可移動性元件介導(dǎo)的ermB基因，其檢出率為87.3%，這與Poeta等[8]的報道結(jié)果相似。產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶是腸球菌對高濃度氨基糖苷類抗生素耐藥的主要原因，其中以雙重功能酶6'位-乙酰轉(zhuǎn)移酶/2"位-磷酸轉(zhuǎn)移酶最為重要，該酶由Aac(6)'/ aph(2'')基因編碼。第2種為由aph(3)'-Ⅲ基因編碼的3'位-磷酸轉(zhuǎn)移酶。第3種為由ant(6)'-Ⅰ基因編碼6 位-核苷轉(zhuǎn)移酶[9]。本研究對于這幾種基因的檢出率較高，Aac(6)'/aph(2'')、aph(3)'-Ⅲ、ant(6)'-Ⅰ的檢出率分別為97.6%、76.2%、90%。萬古霉素耐藥基因可編碼D-丙氨酰-D乳酸、D-丙氨酰-D-絲氨酸及D-丙氨酰等糞腸球菌細(xì)胞壁的前體，使其靶點(diǎn)對于萬古霉素的親合力下降，從而產(chǎn)生耐藥性。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的耐萬古霉素的基因型有VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG、VanL、VanM和VanN 9型[10]，本研究僅檢測了VanA、VanB、VanC三種基因的存在。其中有2株對萬古霉素耐藥菌株含有VanA基因，而VanB、VanC的檢出率分別為54.8%、88.1%。

表4 42株菌株耐藥表型與耐藥基因比較Table4 Resistance phenotypes and genes in 42 stains of Enterococcus faecalis

從表型與基因型共同分析糞腸球菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)湖南省獸醫(yī)臨床分離株耐藥表型的檢出率或是耐藥基因的檢出率都相當(dāng)高，糞腸球菌的多重耐藥性嚴(yán)重。全部細(xì)菌都至少對3種或3種以上的抗生素耐藥且同時檢出3種或3種以上的耐藥基因，其中有3株糞腸球菌對11種抗生素均耐藥，1株糞腸球菌攜帶有所檢的全部8種耐藥基因。研究中還發(fā)現(xiàn)有些細(xì)菌具有某種耐藥基因，卻不一定表現(xiàn)出相應(yīng)的表型，這可能是與細(xì)菌體內(nèi)各基因是否表達(dá)或表達(dá)的量是否達(dá)到可行使其生物學(xué)功能的閾值有一定的關(guān)系。也有部分細(xì)菌表現(xiàn)為表型耐藥但未檢測到相關(guān)耐藥基因，這表明細(xì)菌可能還含有其他耐藥基因或者還有其他的耐藥機(jī)制。糞腸球菌耐藥表型與耐藥基因并不完全一致，因此在檢測細(xì)菌的耐藥情況時，不能僅檢測細(xì)菌的耐藥表型，還應(yīng)該在基因水平上來發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的隱性耐藥，為更合理的使用抗生素提供依據(jù)。

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DRUG RESISTANCE OF SWINE ENTEROCOCCUS FAECALIS IN HUNAN PROVINCE

WANG Song-lin, LI Yun-fang, LIU Qiu-ju, ZHU Na, JIANG Wei, DENG Zhi-bang, LI Man-xiang

(College of Veterinary Medicine, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China)

The aim of this study was to determine the drug resistance of Enterococcus faecalis and the genes related to resistance.Total 42 isolates were evaluated for their sensitivity to 11 antimicrobial drugs by K-B disc diffusion method and for the presence of 8 resistance genes in PCR.All 42 isolates of Enterococcus faecalis were highly resistant to most antimicrobial drugs.The drug resistance percentages of these isolates to acheomycin, chloramphenicol, oxacillin, erythromycin, minocycline, levofloxacin, gentamicin, streptomycin, ciprofl oxacin, vancomycin and penicillin G were 100%, 92.9%, 88.1%, 83.3%, 81%, 57.1%, 52.4%, 47.6%, 45.2%, 31% and 11.9%, respectively.The percentages of drug resistance genes were Aac(6)'/aph(2'')97.6%, ant(6)'-Ⅰ 90%, aph(3)'-Ⅲ 76.2%, tetM90.5%, ermB 73.8%, VanA 4.8%, VanB 54.8% and VanC 88.1%, respectively.In addition, analysis of multi-drug resistance of Enterococcus faecalis did not fi nd relationship between phenotypes and resistance genes.

Enterococcus faecalis; drug resistance; resistance genes

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-6422（2015）02-0041-06

2014-12-15

湖南省科技計劃項(xiàng)目（2013FJ6060）

王送林，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

黎滿香，E-mail∶ manxiangl@163.com