柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的制備及其在蛋白定位中的應用

李 莎，梁思婷,2，趙其平，韓紅玉，朱順海，翟 頎，楊斯涵,3，黃 兵,4，董 輝

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234；3.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201；4.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009）

·研究論文·

柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的制備及其在蛋白定位中的應用

李 莎1，梁思婷1,2，趙其平1，韓紅玉1，朱順海1，翟 頎1，楊斯涵1,3，黃 兵1,4，董 輝1

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234；3.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201；4.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009）

為了制備柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶（Eimeria tenella lactate dehydrogenase, EtLDH）單克隆抗體，用大腸桿菌表達的重組EtLDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)5次免疫后取脾臟制備免疫脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，經(jīng)3次亞克隆后獲得2株能穩(wěn)定分泌EtLDH單克隆抗體的雜交瘤細胞株2F7和2H4，抗體亞類鑒定均為IgG1，腹水效價分別為1:8000和1:64 000。Western blot結果顯示2F7抗體能識別柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子中大小約為35 kDa的天然蛋白。利用該單抗對EtLDH在柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子中的分布進行了定位，結果顯示該蛋白主要分布于裂殖子的細胞質，表明成功地制備了EtLDH 單克隆抗體，為深入研究EtLDH的功能和特性奠定了基礎。

柔嫩艾美耳球蟲；乳酸脫氫酶；單克隆抗體；免疫熒光定位

柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella, Et）是隸屬于頂復器門（Apicomplexa）艾美耳屬的一種胞內寄生性原蟲，蟲體寄生在雞盲腸內，可引起急性盲腸球蟲病，主要臨診表現(xiàn)為精神萎頓，排血便，食欲下降，痙攣等癥狀，嚴重者可致死亡[1]。目前球蟲病的控制主要依賴抗球蟲藥物預防，但球蟲幾乎對所有使用過的抗球蟲藥物都已產(chǎn)生耐藥性[2]，迫切需要尋求新的藥物靶標來合成新型抗球蟲藥。通過尋找具有特異化學結構和理化性質并在球蟲生活史中有重要作用的酶類[3, 4]，應用其特異性設計特異的抑制劑作用于寄生蟲蛋白，從而可達到控制雞球蟲病的目的[5]。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是糖酵解途徑的末端酶，能夠催化丙酮酸與乳酸之間可逆的氧化還原反應，大多數(shù)體內寄生蟲依靠此途徑獲取能量維持生存[6]。各種寄生蟲LDH在理化性質和分子結構方面均有獨特的特性，是良好的診斷分子和潛在的藥物作用靶標。在頂復器門原蟲中，LDH 研究主要集中在瘧原蟲[7-9]和弓形蟲[10-12]中。本實驗室在前期研究中對EtLDH基因特性進行了初步研究[13]，本研究以原核表達的重組EtLDH （rEtLDH）蛋白免疫小鼠，制備了2株EtLDH的特異性McAb，并對EtLDH在蟲體上的分布進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 蟲株和菌株柔嫩艾美耳球蟲上海株、含表達質粒pET28a(+)-EtLDH的大腸桿菌BL21均為本實驗室保存。

1.2 實驗動物與細胞系6周齡雌性BALB/c小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為本實驗室保存。

1.3 主要試劑及試劑盒胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；HRP-羊抗鼠IgG、Protein G Agarose購自碧云天公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、HAT、HT、DMSO、PEG-2000、降植烷、Texas RedR-羊抗鼠IgG等購自Sigma公司；鼠源McAb亞類鑒定試劑盒購自洛陽賽爾維生物器材有限公司；Donkey-anti-Mouse IRDyeR660RD購自ODDYSSEY公司。

1.4 抗原制備與動物免疫將保存于-70℃的pET28a(+)-EtLDH重組質粒轉化菌接種于LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)至OD600值達0.6，加IPTG誘導表達6 h后，離心收集菌體沉淀，冰浴條件下超聲破碎細胞，離心收集上清，經(jīng)Ni-NTA純化可溶性蛋白，用SDS-PAGE檢測純化效果后，剩余的蛋白用BCA法測定蛋白濃度[13]。

將rEtLDH與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，按100 μg/只皮下多點注射免疫BALB/c小鼠。此后每隔2周將rEtLDH與弗氏不完全佐劑乳化，100 μg/只皮下多點注射以加強免疫，共免疫3次。融合前3 d用不加佐劑的rEtLDH（100 μg/只）腹腔注射1次進行沖擊免疫。

1.5 細胞融合與篩選依據(jù)王建科[14]所述方法略作修改。無菌摘取免疫小鼠脾臟按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，37℃、5%CO2濃度條件下培養(yǎng)，5 d后用HAT培養(yǎng)基半量換液，7～10 d后換HT培養(yǎng)基。同時，以rEtLDH（含His融合蛋白標簽）、柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子蛋白和His蛋白分別包被96孔板。當雜交瘤細胞生長至1/3～1/2孔底面積時，取上清液用間接ELISA方法檢測，并以免疫小鼠血清作為陽性對照，健康小鼠血清作為陰性對照。以能與rEtLDH和柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子蛋白反應（OD450＞0.5）而不與His蛋白反應（OD450＜0.1），且P/N＞2.1（P為陽性對照OD值，N為陰性對照OD值）時的克隆判為陽性。對經(jīng)2次檢測均呈陽性的孔進行擴大培養(yǎng)并凍存，同時用有限稀釋法亞克隆，直到陽性克隆率達100%時，方可確定建株。

1.6 腹水制備與McAb純化取6周齡BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌降植烷0.5 mL/只，7 d后每只腹腔注射DMEM培養(yǎng)基懸浮的雜交瘤細胞懸液0.5 mL（約含5×106個細胞），10 d后無菌采集腹水，10 800×g離心10 min，取上清，根據(jù)試劑盒說明書用Protein G免疫親和層析柱進行純化，SDS-PAGE檢測純化效果，過濾除菌后分裝，置于-70℃冰箱保存。

1.7 單克隆抗體相關特性的測定

1.7.1 亞類鑒定 按照McAb亞類鑒定試劑盒說明書對得到的單克隆雜交瘤細胞上清進行亞類鑒定。

1.7.2 效價測定 參照張花景[15]的方法。將rEtLDH和McAb分別稀釋成一系列的濃度梯度，同時設置陰性對照和空白對照，用方陣滴定法確立抗原抗體最佳工作濃度，從實驗結果的對角線位置選取OD450值接近1.0左右的孔，其對應的rEtLDH包被濃度和McAb最大稀釋度分別作為抗原最佳包被濃度和McAb效價。

1.7.3 Western blot鑒定 分別取柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子蛋白和His蛋白進行SDS-PAGE后轉PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的PBS懸液于4℃封閉過夜后，1∶1 000稀釋的McAb作為一抗，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次；Donkey anti-Mouse IRDyeR660RD作為二抗，以1∶10 000稀釋，37℃避光孵育1 h，PBS漂洗5次，用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)觀察結果。

1.8 EtLDH在第二代裂殖子的分布

1.8.1 柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子的制備 參照劉立恒等[16]的方法。將柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊接種2周齡無球蟲雞，感染后120 h剖殺取盲腸，滅菌PBS清洗盲腸后剪碎，經(jīng)酶消化液充分消化后過濾離心，用紅細胞裂解液充分裂解，然后用Percoll密度梯度離心法純化第二代裂殖子。

1.8.2 EtLDH的免疫熒光定位 將裂殖子懸液滴于蓋玻片上，自然風干，加2%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次；加1% Triton-X-100室溫放置15 min，PBS洗3次；用含2% BSA的PBS封閉20 min，PBS洗3次；加McAb（200倍稀釋），37℃孵育l h，PBS洗3次，同時設置陰性鼠血清對照組；加TexasRRed-羊抗鼠IgG（1000倍稀釋），37℃避光孵育l h，PBS洗5次，并在PBS中避光浸泡30 min；加DAPI室溫放置30 min，PBS洗3次；加抗熒光淬滅劑，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 雜交瘤細胞株的建立融合后d7雜交克隆的融合率為90%，經(jīng)2次ELISA篩選共得到18孔分泌抗體的陽性克隆，再通過3次亞克隆篩選出2株穩(wěn)定分泌EtLDH McAb的強陽性雜交瘤細胞，分別命名為2F7 和2H4，經(jīng)多次傳代擴大培養(yǎng)后雜交瘤細胞分泌抗體仍然穩(wěn)定，液氮凍存，經(jīng)復蘇后測定細胞仍保持分泌抗體的能力。

2.2 McAb亞類鑒定與效價測定McAb亞類鑒定結果顯示，2株McAb均為IgG1。2F7和2H4分泌McAb的最佳抗原包被濃度分別為12 μg/mL與8 μg/mL，效價分別為1∶8000與1∶64 000。

2.3 McAb的SDS-PAGE分析和Western blot鑒定純化后的2株McAb經(jīng)SDS-PAGE均顯示出大、小2條主帶，分子量分別約為50 kDa（重鏈）和25 kDa（輕鏈）（圖1）。Western blot結果顯示，2F7能識別柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子約35 kDa大小的天然目的蛋白（圖2），而2H4卻不能識別蟲體蛋白（圖片略）。

2.4 EtLDH在第二代裂殖子中的定位間接熒光定位結果顯示，2株McAb均能使裂殖子產(chǎn)生特異性熒光，熒光主要分布于細胞質中（圖3）。

3 討論

McAb是由單一克隆的雜交瘤細胞產(chǎn)生，相比多克隆抗體，McAb具有無限量生產(chǎn)、高度的特異性和均一性等優(yōu)點。球蟲McAb的研究始于20世紀末，至今已制備了抗球蟲特異性階段蟲體單抗（如子孢子[17]、裂殖子[18]）、細胞器單抗（如頂復合器[19]、折光體[20]）、蛋白單抗（如天冬氨酰蛋白酶[21]、棒狀體蛋白A08[22]）。McAb技術已被廣泛應用于球蟲新基因和新抗原篩選、發(fā)育過程與致病機理探索、疾病診斷和預防治療等方面的研究，是球蟲研究領域一種十分重要的工具[23]。

制備McAb的關鍵是有足量純凈的抗原[23]。常用的免疫原是以大腸桿菌表達的重組蛋白，其優(yōu)點是抗原的獲得簡單、方便，但在重組蛋白中含有標簽序列，大的標簽序列必須予以切割，否則可能會干擾目的雜交瘤細胞的篩選[24]。本研究首次利用重組表達的EtLDH蛋白免疫小鼠制備了單抗，所用的表達載體為pET28a（+），該質粒含有的His標簽只有6個組氨酸大小，在pH8.0時不帶電荷，分子量很小，幾乎沒有什么免疫原性，對蛋白的分泌、折疊、結構甚至功能幾乎沒影響，所以無需切除[24]。單抗的制備需要進行多層次的篩選，本研究中分別以蟲體抗原、重組蛋白和His標簽作為包被抗原進行檢測，以減少假陽性、標簽干擾等問題。

圖l 純化后單克隆抗體2F7和2H4的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purifi ed McAb 2F7 and 2H4

圖2 單克隆抗體2F7的Western blot鑒定Fig.2 Identifi cation of McAb 2F7 by Western blot

圖3 間接免疫熒光法檢測EtLDH在第二代裂殖子的分布Fig.3 The distribution of EtLDH in second-generation merozoites by IFA

本研究所獲得的2F7和2H4，亞型均為IgG1，腹水效價分別為1∶8000和1∶64 000。而同為頂復器門的惡性瘧原蟲 LDH McAb腹水效價為1∶6400～1∶51 200，亞類為IgG1/IgG2[25, 26]。間日瘧原蟲LDH的McAb腹水效價為1∶12 800～1∶25 600，亞類為IgG1[27]。2F7能識別蟲體的天然蛋白，而2H4不能，推測前者識別的是EtLDH的線性表位，而后者識別的是構象表位。在Western blot中，抗原因變性而構象表位遭到破壞，因此不適于檢測識別構象表位的McAb。王建科[14]制備的8株水貂腸炎細小病毒的McAb均能用于間接免疫熒光檢測，但僅有5株能用于Western blot檢測。孫莉等[27]制備的5株間日瘧原蟲LDH的McAb均能識別重組蛋白，但只有2株能識別蟲體天然蛋白。有關EtLDH McAb識別抗原表位的鑒定尚需進一步研究。

免疫熒光實驗對抗體的純度、抗原特異性和效價都有要求，純度不高、特異性不好的抗體會產(chǎn)生非特異性熒光，效價低則成像不清晰[28]。Dong等[29]用EtLDH多抗作為一抗，熒光定位結果顯示EtLDH分布于第二代裂殖子整個蟲體的細胞質，且EtLDH蛋白表達水平在第二代裂殖子階段最高。本研究用制備的2F7和2H4兩株McAb對柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子進行免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)與前者相比，McAb的特異性和親和性更好，無非特異性熒光，更適于EtLDH的定位和蟲體檢測。

本研究成功制備了EtLDH的McAb，為后續(xù)用免疫共沉淀技術篩選相互作用蛋白，以及從球蟲cDNA文庫或噬菌體展示文庫中分離鑒定功能基因等奠定了基礎。

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GENERATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST LACTATE DEHYDROGENASE OF EIMERIA TENELLA AND ITS APPLICATION IN PROTEIN LOCALIZATION

LI Sha1, LIANG Si-ting1, 2, ZHAO Qi-ping1, HAN Hong-yu1, ZHU Shun-hai1, ZHAI Qi1, YANG Si-han1, 3, HUANG Bing1, 4, DONG Hui1

(1.Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3.College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

Eimeria tenella; lactate dehydrogenase; monoclonal antibody; immunofl uorescent localization

: In order to prepare specifi c monoclonal antibodies (McAbs) against lactate dehydrogenase of Eimeria tenella (EtLDH), BALB/ c mice were immunized fi ve times with the recombinant fusion protein expressed in E.coli.Murine myeloma cells were fused with the splenocytes of the immunized mice.An indirect ELISA was used to screen antibody-producing hybridomas.After subcloned three times, two hybridoma clones 2F7 and 2H4 that secreted specifi c McAbs against EtLDH were obtained.Both belonged to IgG1 isotype.The ELISA titer of murine ascites from 2F7 and 2H4 was l:8000 and l:64 000, respectively.Western blot analysis indicated that a 35 kDanative protein of the second-generation merozoites of E.tenella was recognized by 2F7 McAb.The distribution of EtLDH in the secondgeneration merozoites of E.tenella was investigated through immunofl uorescent technique using both McAbs.The results indicated that LDH was distributed in the cytoplasm of the second-generation merozoites.The generation of these two McAbs will be useful to further study the function and characteristics of EtLDH.

2014-12-08

國家自然科學基金（31272557）

李莎，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

董輝，E-mail∶ donghui@shvri.ac.cn

S852.723

A

1674-6422（2015）02-0047-06