堿性成纖維細胞生長因子基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的基因表達

趙 悅，馬 琳，彭珊珊，淦 鑫

0 引 言

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是目前倍受矚目的一類存在于骨髓等多種組織中的具有多向分化潛能的組織干細胞，具有取材方便、低免疫原性、易轉(zhuǎn)染并能穩(wěn)定表達外源性基因等優(yōu)點，為組織修復的細胞治療以及以BMSCs為載體的基因治療開辟了廣闊的前景。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)被認為是體內(nèi)最為有效的促血管生長因子之一。其可調(diào)控BMSCs定向分化為血管內(nèi)皮細胞，同時也是一種強大的毛細血管增殖刺激劑，如能使其在肺組織中大量表達，不僅能誘導移植的BMSCs分化為血管內(nèi)皮細胞，還可促進肺泡毛細血管再生，改善因局部缺血造成的肺泡數(shù)量不足及功能缺陷［1-3］，從而達到慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)肺組織的修復療效。本實驗在體外將bFGF基因用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染入大鼠BMSCs，使其大量表達分泌bFGF，為進一步研究bFGF基因?qū)OPD的修復作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔型SD大鼠(由南昌大學醫(yī)學院動物部提供)，180～200 g，雌雄不限，4～5周齡，實驗動物合格證號:SCXK(贛)2011-0003，飼養(yǎng)于恒溫恒濕動物飼養(yǎng)房，自由飲食、飲水;大腸埃希菌DH5α由南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科實驗室惠贈;bFGF-pcDNA3.1重組質(zhì)粒和pcDNA3.1空白質(zhì)粒，由英濰捷基公司上海分部合成并測序;流式抗體FITC antimouse CD29、PE anti-mouse CD34、FITC anti-mouse CD44(美國Becton Dickinson公司)，實時熒光定量試劑盒PCR SuperMix-UDG(美國英濰捷基公司)，質(zhì)粒抽提試劑盒(美國OMEGA公司)，RNA提取試劑盒(美國OMEGA公司)，Lipofectamine 2000(美國英濰捷基公司)，潮霉素(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs體外分離培養(yǎng)及傳代 將大鼠頸椎脫臼處死，完整取下并分離股骨、脛骨，用預溫PBS反復注入骨髓腔中沖洗直至髓腔轉(zhuǎn)白，制成單細胞懸液，離心后重懸，接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞鑒定 采用流式細胞表型鑒定術(shù)取P3代BMSCs，消化后重懸分裝至3個流式管中，避光條件下向3個流式管中各加入0.02 mL的流式抗體CD44-FITC、CD29-FITC、CD34-PE，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌后重懸細胞，得到已被標記的單細胞懸液，流式細胞儀檢測，所得的結(jié)果用 FCS Express V3軟件進行分析。

1.2.3 潮霉素最低篩選濃度測定 取 P3代BMSCs，消化重懸，接種于24孔板中，放于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后將第1排細胞培養(yǎng)液更換為以下潮霉素濃度梯度的完全培養(yǎng)基:15、20、25、30、35、40 μg/mL，第 2 ～4 排作為副孔更換不含潮霉素的完全培養(yǎng)基，每3～5天換液，2周左右觀察6個篩選孔中細胞狀態(tài)，以細胞被全部殺死的最低潮霉素濃度作為最低有效濃度。

1.2.4 bFGF-pcDNA3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、提取和測定 應(yīng)用雙酶切法構(gòu)建重組質(zhì)粒bFGF-pcDNA 3.1，轉(zhuǎn)化DH5α菌，按照 OMEGA質(zhì)粒抽提試劑盒說明書步驟，從含大鼠bFGF-pcDNA3.1真核表達載體的DH5α菌中提取bFGF-pcDNA3.1進行純化，并對質(zhì)粒進行酶切及測序鑒定。

1.2.5 bFGF基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 取 P3代大鼠BMSCs接種于培養(yǎng)皿中，24 h后更換為不含血清及雙抗的DMEM，培養(yǎng)3 h后根據(jù)質(zhì)粒濃度制備lipofectamine復合物，室溫下靜置20 min，將復合物逐滴加入培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h待其轉(zhuǎn)染，5 h后取出培養(yǎng)皿，更換為完全培養(yǎng)基。脂質(zhì)體介導bFGF-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染BMSCs為 bFGF-pc DNA 3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，脂質(zhì)體介導pcDNA3.1轉(zhuǎn)染BMSCs為空白pcDNA 3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，未轉(zhuǎn)染的BMSCs為未轉(zhuǎn)染組。

1.2.6 G418陽性克隆細胞篩選 轉(zhuǎn)染后48 h取出已成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒bFGF-pcDNA3.1和質(zhì)粒pcDNA3.1的BMSCs，更換為含20 μg/mL潮霉素的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后存活的細胞即為轉(zhuǎn)染成功的獲得抗性的細胞克隆。

1.2.7 bFGF基因及蛋白的表達 轉(zhuǎn)染48 h后將細胞置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。提取細胞RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴增后進行qRT-PCR反應(yīng):95℃預變性10 min，95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火/延伸 1 min，共 42個循環(huán)，結(jié)束后記錄結(jié)果。提取細胞總蛋白，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后結(jié)合抗體，與一抗Anti-FGF2 antibody結(jié)合室溫孵育2 h后洗脫，與二抗山羊抗兔IgG/辣根酶標記結(jié)合室溫孵育1 h后洗脫，即可化學顯影，所得膠片條帶用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BMSCs體外分離培養(yǎng) 獲得大鼠BMSCs的原代細胞后將其接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后置于倒置顯微鏡下觀察，可看到散在的貼壁細胞(即BMSCs)和大量懸浮在培養(yǎng)基中的圓形或類圓形的造血細胞，培養(yǎng)第3天，貼壁細胞增加，出現(xiàn)明顯的BMSCs克隆，呈梭形、三角形或紡錘形，細胞核質(zhì)比大，局部可形成小的集落。在2～4次的全量換液后，造血細胞隨著培養(yǎng)基的傾倒逐漸減少，在培養(yǎng)的7～10d BMSCs的原代細胞有85% ～90%融合，且呈魚群、旋渦狀或放射狀排列，此時可傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的細胞生長較原代迅速，并保持原代細胞的形態(tài)特征，3～5d便可達融合狀態(tài)，同時傳代次數(shù)越多，細胞的形態(tài)也就越均一。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察BMSCs情況(×200)Figure 1 Morphology of the cultured bone marrow mesenchymal stem cells(×200)

2.2 流式細胞表型鑒定 當細胞培養(yǎng)到P3代時，流式細胞學檢測細胞表型:P3代細胞CD44陽性表達(69.7%)，CD29 陽性表達(61.53%)，而 CD34陰性表達(2.71%)，見圖2。與文獻［4-5］報道基本一致。

圖2 流式細胞檢測細胞表型結(jié)果Figure 2 Phenotypes of the bone marrow mesenchymal stem cells by flow cytometry

2.3 潮霉素最低篩選濃度 接種后可發(fā)現(xiàn)第3天起6個篩選孔內(nèi)細胞均出現(xiàn)不同程度漂浮死亡現(xiàn)象，且死亡的細胞數(shù)明顯與潮霉素濃度呈正相關(guān)，至第14天可見濃度為20 μg/mL的潮霉素篩選孔內(nèi)細胞基本無貼壁，全部死亡，見圖3。

圖3 倒置顯微鏡下觀察潮霉素(20 μg/mL)作用后細胞生存情況(×200)Figure 3 Survival status of the bone marrow mesenchymal stem cells after treated with 20 μg/mL hygromycin(×200)

2.4 質(zhì)粒的鑒定

2.4.1 質(zhì)粒DNA濃度和純度的測定 經(jīng)分光光度計測量及計算后得到bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒及空白pcDNA3.1 質(zhì)粒標本濃度分別為 630、570 μg/mL。且2個質(zhì)粒標本A260/A280比值均在1.8以上，說明其核酸的純度在90%以上。

2.4.2 質(zhì)粒酶切電泳 bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒用HandⅢ、NotⅠ雙酶切后，在465 bp左右的位置出現(xiàn)目的基因帶，在4.5～6.5 kb之間出現(xiàn)載體條帶，分別與bFGF基因和pcDNA3.1載體吻合，初步鑒定目的基因質(zhì)粒構(gòu)建正確。見圖4。

圖4 重組bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒酶切電泳鑒定Figure 4 Enzyme digestion and electrophoresis the recombinant plasmid bFGF-pcDNA3.1

2.4.3 質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果 用T7引物對質(zhì)粒進行測序，結(jié)果表明，所插入的基因片段與公開發(fā)表的bFGF序列完全一致。詳細測序結(jié)果見圖5。

圖5 bFGF質(zhì)粒圖譜Figure 5 Atlas of the plasmid bFGF

2.5 綠色熒光蛋白表達 轉(zhuǎn)染后48 h將細胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察，可見部分細胞發(fā)出綠色熒光，見圖 6，因 bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒和空白 pcDNA3.1質(zhì)粒均攜帶GFP基因，可證明此即為表達綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)染成功的BMSCs。經(jīng)計算bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒和空白pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率均為50%左右。

圖6 鏡下觀察轉(zhuǎn)染48 h后綠色熒光蛋白表達(×200)Figure 6 Expression of the green fluorescent protein after transfection(×200)

2.6 qRT-PCR檢測bFGF基因的表達 擴增曲線可見明顯的對數(shù)期及平臺期，見圖7。溶解曲線可見未見引物二聚體和非特異擴增產(chǎn)物，見圖8。bFGF目的基因表達量見圖9，結(jié)果顯示:3組細胞中均可檢測到bFGF基因的表達，bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組bFGF 基因表達(7.028±0.568)較空白 pcDNA3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(1.000±0.082)及未轉(zhuǎn)染組(1)高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖7 bFGF基因轉(zhuǎn)染后qRT-PCR擴增曲線圖Figure 7 qRT-PCR amplification curve for the bFGF gene expression

圖8 bFGF基因轉(zhuǎn)染后qRT-PCR溶解曲線圖Figure 8 qRT-PCR melt curve for the bFGF gene expression

圖9 轉(zhuǎn)染后細胞bFGF蛋白條帶Figure 9 Protein bands of bFGF after transfection

2.7 Western blot檢測bFGF蛋白的表達 3組細胞中均可檢測到bFGF蛋白的表達，bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組bFGF蛋白表達(1.017±0.054)較空白pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(0.217 ± 0.009)及未轉(zhuǎn)染組(0.165 ±0.013)高，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，而空白pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組相比bFGF蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討 論

近年來，對干細胞以及以干細胞為載體的基因治療得到了越來越多的關(guān)注［6］，其中以BMSCs最為突出。研究表明，BMSCs也可在特定的環(huán)境中跨胚層分化為神經(jīng)元細胞、胰島細胞、肝細胞、腎小管上皮細胞以及肺上皮細胞等［7-13］。BMSCs可分化為肺實質(zhì)細胞，并在肺組織的損傷修復過程中發(fā)揮作用［14-15］。值得說明的是，有研究表明 BMSCs可能對肺組織有特殊的親和性［16］，表現(xiàn)出了利用BMSCs作為載體的基因治療對肺組織的修復作用的優(yōu)越性。本實驗采用全骨髓貼壁篩選法提取分離大鼠BMSCs，并用流式細胞表型檢測鑒定。研究表明，BMSCs表面 CD44、CD29、CD73 等抗原表達陽性，而不表達 CD34、CD45、CD14 等抗原［17］。本實驗中的BMSCs分離出后行流式細胞術(shù)表型檢測，結(jié)果CD44、CD29陽性表達，而CD34陰性表達，與文獻報道一致。充分證實所分離細胞即為BMSCs。

氣道炎癥、肺實質(zhì)破壞及肺毛細血管受損是COPD主要的病理特征。bFGF是血管生長因子家族重要成員之一，主要表達于氣道上皮細胞和基底膜等，是肺發(fā)育必不可少的因子之一［18］，它可促進COPD時血管生成，肺毛細血管再生，增加肺血流量，改善通氣/血流，是肺泡再生和自我修復必不可少的條件。研究發(fā)現(xiàn)，在體外將bFGF加入毛細血管中，不但可促進細胞增殖、分裂和生長，還可誘導毛細血管樣管腔形成，同時發(fā)現(xiàn)對血管內(nèi)皮細胞有強烈的趨化作用。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)bFGF因子有強烈的促血管形成作用。Pavlisa等［19］通過檢測COPD急性加重期患者外周血血管內(nèi)皮生長因子(vascμlar endothelial growth factor，VEGF)和bFGF水平，發(fā)現(xiàn)VEGF和bFGF可促進血管生成，增加肺血流灌注與改善組織氧合。Morino等［20-21］通過氣管內(nèi)給予bFGF治療彈性蛋白酶誘導的狗肺氣腫模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)bFGF治療后的肺氣腫動物模型動脈血氧分壓明顯增高，肺血流明顯增加，病理學觀察平均內(nèi)襯間隔明顯減小，單位面積平均肺泡數(shù)增加，表明肺氣腫程度減輕，肺組織病變得到修復。本實驗成功構(gòu)建了bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒并通過測序鑒定其序列準確性。

本實驗用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大鼠BMSCs中，于轉(zhuǎn)染后48 h置于熒光顯微鏡下觀察，可見細胞表達綠色熒光蛋白，熒光率約為50%。用qRT-PCR及Western blot法檢測bFGF目的基因及其蛋白表達情況。qRT-PCR結(jié)果顯示細胞大量表達bFGF目的基因，Western blot結(jié)果顯示細胞大量表達bFGF目的蛋白。綜合綠色熒光蛋白表達情況、qRT-PCR及 Western-blot結(jié)果顯示，bFGF基因成功轉(zhuǎn)染入大鼠BMSCs中并可大量表達其目的基因及目的蛋白。后續(xù)可將成功轉(zhuǎn)染了bFGF基因的BMSCs注入COPD大鼠體內(nèi)，進一步研究bFGF基因?qū)OPD的修復作用及其機制。

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