CYP2C19基因多態(tài)性與缺血性腦血管病患者PTAS術(shù)后氯吡格雷反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)研究

謝 霞，侯華娟，張治中，蔡必揚，張雨蒙，范文平，劉柯婷，戴敏慧，劉新峰

0 引 言

近年來，隨著血管內(nèi)介入技術(shù)的發(fā)展和新型血管內(nèi)支架的研制，經(jīng)皮血管內(nèi)支架成形術(shù)(percutaneous transluminalangioplasty and stenting，PTAS)已經(jīng)成為治療缺血性腦血管病的重要手段。但是，支架置入術(shù)后常造成血管損傷處的動脈粥樣硬化斑塊破裂、血管內(nèi)膜損傷，而暴露于富含各種血小板激活因子的血液中，導致血小板聚集形成血栓，活化的血小板又可進一步激活內(nèi)源性及外源性凝血途徑。因此為了預(yù)防PTAS術(shù)后支架內(nèi)血栓形成及支架內(nèi)再狹窄，指南推薦術(shù)后常規(guī)聯(lián)用阿司匹林及氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療［1］。因個體對氯吡格雷的反應(yīng)存在明顯的差異性，部分低反應(yīng)性的患者常易發(fā)生支架內(nèi)血栓［2］。目前對氯吡格雷反應(yīng)多樣性的遺傳學研究主要集中于CYP2C19的基因多態(tài)性。眾多研究已表明CYP2C19同工酶基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與氯吡格雷產(chǎn)生不同程度的抗血小板作用密切相關(guān)［3-4］;但關(guān)于CYP2C19基因多態(tài)性與缺血性腦血管病PTAS術(shù)患者氯吡格雷反應(yīng)性的研究較少。因此本研究擬通過評估患者PTAS術(shù)后6個月CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷治療后血小板高反應(yīng)性(high ontreatment platelet reactivity，HTPR)的關(guān)系及其對PTAS術(shù)后支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)的影響，以期指導今后的抗血小板藥物個體化治療。

1 資料與方法

1.1 研究對象 連續(xù)性納入2011年1月至2014年3月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科行PTAS術(shù)的缺血性腦血管病患者145例。納入標準:①漢族;②年滿18周歲;③確診為缺血性卒中，經(jīng)腦動脈數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)證實為顱內(nèi)外動脈狹窄(癥狀性狹窄＞50%或無癥狀性狹窄＞70%);④術(shù)后遵醫(yī)囑規(guī)律服用氯吡格雷(75 mg/d)和阿司匹林(100 mg/d)雙聯(lián)抗血小板治療6個月。排除標準:①對阿司匹林、氯吡格雷過敏或不能耐受者、低分子肝素禁忌證者;②血小板計數(shù)＜100×109/L或＞450×109/L，凝血功能障礙或有出血傾向者;③嚴重肝腎功能不良或心功能III級以上。入組患者平均年齡為(64.2±8.9)歲，男96例，女49例。其中高血壓病95例(65.5%)，糖尿病45例(31%)，高脂血癥40例(27.6%)。145例患者共置入支架174枚，其中顱外支架111枚(76.6%)，所有患者均成功施行PTAS術(shù)，均無血管破裂、血管夾層、腎功能損害等非神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥及手術(shù)相關(guān)神經(jīng)功能缺損或癥狀惡化。根據(jù)CYP2C19*2基因分型結(jié)果:將患者分為野生型組(CYP219*1/*1，69例)和突變組(雜合突變型CYP2C19*1/*2與純合突變型CYP2C19*2/*2，76例)。2組患者臨床基線資料差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。本研究經(jīng)南京軍區(qū)南京總醫(yī)院倫理委員會批準(批準號:812201080088)，所有入選患者均簽署知情同意書。

表1 行PTAS術(shù)缺血性腦血管病患者各組臨床基線資料的比較Table 1 Baseline characteristicsstratified based on CYP2C19 polymorphism

1.2 研究方法

1.2.1 基線資料收集 ①基本信息如性別、年齡等;②既往病史如糖尿病病史、高血壓史、吸煙史、飲酒史;實驗室常規(guī)檢查項目如血糖、血脂等;③PTAS手術(shù)情況如支架置入數(shù)量、部位等臨床資料。

1.2.2 全腦血管造影及支架置入術(shù) PTAS術(shù)前予口服阿司匹林(100～300 mg)及氯吡格雷(75～300 mg)24 h以上或阿司匹林(100 mg/d)及氯吡格雷(75 mg/d)4 d以上。根據(jù)DSA結(jié)果決定PTAS方式，由經(jīng)驗豐富的血管內(nèi)介入治療醫(yī)師參照現(xiàn)行指南標準操作。支架置入后造影確定支架位置和殘余狹窄。PTAS術(shù)后聯(lián)用維持劑量氯吡格雷(75 mg/d)和阿司匹林(100 mg/d)6個月，常規(guī)復(fù)查DSA評估支架內(nèi)有無再狹窄。

1.2.3 血小板抑制率的檢測方法 采用TEG儀(型號:GE5000，Haemoscope公司，美國)檢測。試劑包括:花生四烯酸、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、激活劑F(由蝮蛇血凝酶和血小板XIIIa因子混合而成)、高嶺土(含1%kaolin液)。分別用3.2%枸櫞酸鈉和肝素鈉抗凝管抽取患者空腹靜脈血液2 mL。采血后2h內(nèi)使用TEG4個通道進行檢測，TEG軟件根據(jù)檢測結(jié)果自動計算出血小板ADP受體抑制率。

1.2.4 DNA提取及基因型測定 乙二胺四乙酸抗凝管抽取患者空腹外周血2 mL，采用DNA試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］提取全血基因組DNA并將濃度標化至10 ng/μL。采用多重高溫連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)進行基因型測定。設(shè)立空白對照樣本并隨機選取10%重復(fù)樣本，評價基因檢測結(jié)果的可靠性。

1.2.5 評定標準 成功施行PTAS定義為顱外動脈殘余狹窄＜30%，顱內(nèi)動脈術(shù)后狹窄程度較術(shù)前至少降低50%。支架內(nèi)再狹窄標準［5］:①顱外動脈:經(jīng)DSA證實的支架內(nèi)及支架附近5 mm內(nèi)管腔直徑狹窄≥50%;②顱內(nèi)動脈:置入支架附近5mm內(nèi)直徑狹窄≥50%或血管絕對管徑較術(shù)后減少＞20%。判定顱內(nèi)外動脈狹窄程度分別采用WASID［6］和 NASCET［7］標準。參照既往文獻［8-9］將TEG檢測的血小板ADP受體抑制率＜30%定義為氯吡格雷HTPR。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布時以均數(shù)±標準差(±s)表示，2組間均數(shù)比較用t檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡采用χ2檢驗。多因素Logistic回歸分析HTPR發(fā)生的相關(guān)危險因素。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因分型結(jié)果 CYP2C19*2最小等位基因頻率為32.8%。野生型69例、雜合突變型57例、純合突變型19例。CYP2C19*2位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，樣本的群體代表性良好。

2.2 基因型與氯吡格雷反應(yīng)性 突變組血小板ADP受體抑制率較野生型組明顯減弱［(45.22±22.96)%vs(58.43 ±21.98)%，P=0.001］。突變組中雜合突變型為(47.80±22.93)%，純合突變型為(37.53±21.84)%。所有患者HTPR發(fā)生率為26.9%(39例)，突變組HTPR發(fā)生率高于野生型組(35.5%vs17.4%，P=0.014)。雜合突變型為29.8%(17/57)，純合突變型為 52.6%(10/19)。單因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，只有攜帶CYP219*2等位基因與氯吡格雷HTPR發(fā)生相關(guān)，見表2。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，攜帶CYP219*2等位基因為PTAS術(shù)后6個月氯吡格雷HTPR的獨立預(yù)測因素(OR=2.356，95%CI:1.053 ～5.272)，見表3。

表2 行PTAS術(shù)缺血性腦血管病患者氯吡格雷治療后HTPR影響因素的單因素回歸分析結(jié)果Table 2 Logistic analysis of factors associated with HTPR

表3 行PTAS術(shù)缺血性腦血管病患者氯吡格雷治療后HTPR多因素Logistic回歸分析結(jié)果的因素Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of factors associated with HTPR

2.3 基因型與ISR發(fā)生率 根據(jù)PTAS術(shù)后6個月的DSA結(jié)果，10例(6.9%)患者發(fā)生 ISR，顱內(nèi)外PTAS發(fā)生率分別為20.6%和2.7%。突變型基因(CYP2C19*2)ISR發(fā)生率較野生型患者高(11.8%vs 1.4%，P=0.019)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在PTAS術(shù)后長期服用氯吡格雷抗血小板的患者中，CYP2C19*2基因型攜帶者血小板抑制功能減弱，氯吡格雷治療后HTPR發(fā)生率增高，且與PTAS術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生有一定的相關(guān)性。

目前用于檢測血小板功能的方法多樣，對于檢測時間、HTPR定義均無統(tǒng)一公認的標準。部分研究表明氯吡格雷反應(yīng)性存在時間依賴性，Campo G等［10］通過分別檢測患者PCI術(shù)前、術(shù)后1個月及術(shù)后6個月的血小板功能，發(fā)現(xiàn)患者術(shù)后半年氯吡格雷抗血小板聚集作用基本穩(wěn)定。TEG具有可操作性強，重復(fù)性好等優(yōu)點，因此本研究選擇于患者術(shù)后6個月時通過TEG在來檢測氯吡格雷的反應(yīng)性。

CYP2C19是氯吡格雷發(fā)揮抗血小板作用的關(guān)鍵酶，在氯吡格雷經(jīng)肝兩步氧化代謝轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物過程中，分別有45%和20%由CYP2C19基因編碼的蛋白介導［11］。CYP2C19*2為其最主要的突變體，其突變機制為第5外顯子681位堿基G突變?yōu)锳，使外顯子5'端前40bp的堿基發(fā)生缺失，從而改變 mRNA閱讀框架，導致蛋白合成提前終止［12］。攜帶CYP2C19無功能等位基因的患者，氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物減少，抑制血小板功能下降25% ～33%［13］。本研究患者的 CYP2C19*2最小等位基因頻率為32.8%，等位基因分布與既往中國人群的研究報道相似［14-15］。通過多因素Logistic回歸分析校正既往文獻中報道的危險因素如年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、藥物相互作用等因素后發(fā)現(xiàn)CYP2C19*2基因多態(tài)性與HTPR的發(fā)生顯著相關(guān)。

支架置入術(shù)后再狹窄是腦血管介入治療的一大難題，高齡、糖尿病、吸煙、支架置入數(shù)量及部位可能與ISR有關(guān)［16］。本研究入選患者PTAS術(shù)后6個月復(fù)查DSA結(jié)果顯示有10例患者發(fā)生ISR，顱內(nèi)外PTAS發(fā)生率分別為20.6%和 2.7%，顱內(nèi)動脈PTAS術(shù)后 ISR發(fā)生率高于顱外動脈。攜帶CYP2C19*2等位基因患者ISR發(fā)生率高于野生型患者，提示CYP2C19*2基因攜帶者可能因其血小板抑制功能降低而ISR發(fā)生率增高。

本研究仍存在以下不足之處:①僅對CYP2C19的單個SNP位點進行了檢測，尚需增加樣本量來探討多個位點基因多態(tài)性與氯吡格雷反應(yīng)性的關(guān)系;②只采用了TEG一種方法來檢測血小板抑制率，可能存在一定的局限性;③本研究為小樣本回顧性研究，仍需大樣本研究來進一步證實。

［1］ 中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會腦血管病學組缺血性腦血管病血管內(nèi)介入診療指南撰寫組.中國缺血性腦血管病血管內(nèi)介入診療指南［Z］.2011，44，863-869.

［2］ Campo G，F(xiàn)ileti L，de Cesare N，et al.Long-term clinical outcome based on aspirin and clopidogrel responsiveness status after elective percutaneous coronary intervention:a 3T/2R(tailoring treatment with tirofiban in patients showing resistance to aspirin and/or resistance to clopidogrel)trial substudy［J］.J Am Coll Cardiol，2010，56(18):1447-1455.

［3］ Collet JP，Hulot JS，Pena A，et al.Cytochrome P450 2C19 polymorphism in young patients treated with clopidogrel after myocardial infarction:a cohort study［J］.Lancet，2009，373(9660):309-317.

［4］ Mega JL，Simon T，Collet JP，et al.Reduced-function CYP2C19 genotype and risk of adverse clinical outcomes among patients treated with clopidogrel predominantly for PCI:a meta-analysis［J］.JAMA，2010，304(16):1821-1830.

［5］ Albuquerque FC，Levy EI，Turk AS，et al.Angiographic patterns of Wingspan in-stent restenosis［J］.Neurosurgery，2008，63(1):23-28.

［6］ Kasner SE，Lynn MJ，Chimowitz MI，et al.Warfarin vs aspirin for symptomatic intracranial stenosis:subgroup analyses from WASID［J］.Neurology，2006，67(7):1275-1278.

［7］ Moneta GL，Edwards JM，Chitwood RW，et al.Correlation of North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial(NASCET)angiographic definition of 70%to 99%internal carotid artery stenosis with duplex scanning［J］.J Vasc Surg，1993，17(1):152--159.

［8］ Bliden KP，Dichiara J，Tantry US，et al.Increased risk in patients with high platelet aggregation receiving chronic clopidogrel therapy undergoing percutaneous coronary intervention:is the current antiplatelet therapy adequate?［J］ J Am Coll Cardiol，2007，49(6):657-666.

［9］ Fu Z，Dong W，Shen M，et al.Relationship between hyporesponsiveness to clopidogrel measured by thrombelastography and in stent restenosis in patients undergoing percutaneous coronary intervention［Z］.2014，47，197-202.

［10］ Campo G，Parrinello G，F(xiàn)erraresi P，et al.Prospective evaluation of on-clopidogrel platelet reactivity over time in patients treated with percutaneous coronary intervention relationship with gene polymorphisms and clinical outcome［J］.J Am Coll Cardiol，2011，57(25):2474-2483.

［11］ Kazui M，Nishiya Y，Ishizuka T，et al.Identification of the human cytochrome P450 enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite［J］.Drug Metab Dispos，2010，38(1):92-99.

［12］ Frere C，Cuisset T，Morange P E，et al.Effect of cytochrome p450 polymorphisms on platelet reactivity after treatment with clopidogrel in acute coronary syndrome［J］.Am J Cardiol，2008，101(8):1088-1093.

［13］ Mega JL，Close SL，Wiviott SD，et al.Cytochrome p-450 polymorphisms and response to clopidogrel［J］.N Engl J Med，2009，360(4):354-362.

［14］ Zhang L，Chen Y，Jin Y，et al.Genetic determinants of high ontreatment platelet reactivity in clopidogrel treated Chinese patients［J］.Thromb Res，2013，132(1):81-87.

［15］ Li X，Zhang L，Chen X，et al.PON1 Q192R genotype influences clopidogrel responsiveness by relative platelet inhibition instead of on-treatment platelet reactivity［J］.Thromb Res，2013，132(4):444-449.

［16］ Zhu SG，Zhang RL，Liu WH，et al.Predictive factors for instent restenosis after balloon-mounted stent placement for symptomatic intracranial atherosclerosis［J］.Eur J Vasc Endovasc Surg，2010，40(4):499-506.