雞爪槭金陵丹楓組培再生體系的建立

朱璐　李淑順　聞婧　馬秋月　顏坤元　李倩中

摘要：雞爪槭新品種金陵丹楓葉色絢爛，是優(yōu)質(zhì)的彩葉樹(shù)種。以金陵丹楓帶芽莖段為外植體，75%乙醇40s+0.1%氯化汞20min消毒效果最佳。以NN69為基本培養(yǎng)基，篩選獲得最適宜的啟動(dòng)培養(yǎng)基為NN69+0.1mg/LIBA，增殖培養(yǎng)基為NN69+0.4mg/LKT+0.1mg/LIBA，生根培養(yǎng)基為NN69+0.3mg/LIBA。探討了金陵丹楓不定芽對(duì)羧芐青霉素和潮霉素的敏感性，篩選獲得羧芐青霉素的臨界值為300～400mg/L，潮霉素的臨界值為2.5mg/L。

關(guān)鍵詞：金陵丹楓;再生體系;羧芐青霉素;潮霉素

中圖分類(lèi)號(hào)：S792.350.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）01-0054-05

作者簡(jiǎn)介：朱璐（1987—），女，山東淄博人，博士，助理研究員，研究方向?yàn)殡u爪槭遺傳育種。E-mail：luzhu@jaas.ac.cn。

通信作者：李倩中，研究員，研究方向?yàn)殚蕵?shù)新品種選育及種質(zhì)資源利用。E-mail：qianzhongli@jaas.ac.cn。

金陵丹楓是槭樹(shù)科槭屬植物雞爪槭（Acerpalmatum）的一個(gè)園藝品種，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)過(guò)多年選育而成[1]。其葉片掌狀5～7裂，葉片邊緣具有重鋸齒，葉基部近心臟形，新葉為亮紅色，觀賞期達(dá)100d以上。金陵丹楓已獲得江蘇省林木良種認(rèn)定證書(shū)和植物新品種權(quán)證書(shū);可孤植、群植或作為高檔盆栽用，具有極高的觀賞和應(yīng)用價(jià)值。

在金陵丹楓種苗的生產(chǎn)中，通常采用嫁接的方式，但是嫁接成活率受多種外界因素影響較大，如砧木和接穗的質(zhì)量，嫁接季節(jié)和溫度、濕度等，不利于大規(guī)模生產(chǎn)[2]。金陵丹楓扦插不易生根，繁殖較困難，因此亟待建立金陵丹楓的組培再生體系，解決批量生產(chǎn)的問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)雖有少量雞爪槭品種已建立了組培再生體系，如金陵黃楓、赤楓、日本紅楓等[3-6]，但是不同品種的雞爪槭對(duì)不同培養(yǎng)基和植物激素的適應(yīng)性差異很大，還需要針對(duì)不同品種研究其適宜的組培繁殖技術(shù)。

本研究以金陵丹楓當(dāng)年生枝條作為外植體，通過(guò)啟動(dòng)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等階段，篩選最適宜金陵丹楓生長(zhǎng)的激素濃度，同時(shí)還研究了金陵丹楓不定芽對(duì)不同濃度的羧芐青霉素（carbenicillin，簡(jiǎn)稱(chēng)Carb）和潮霉素（hygromycin，簡(jiǎn)稱(chēng)Hyg）的敏感性，以期為金陵丹楓轉(zhuǎn)基因體系的建立提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

雞爪槭品種金陵丹楓健康無(wú)病害的當(dāng)年新鮮枝條，采集于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院槭樹(shù)良種基地。試驗(yàn)于2019年5月開(kāi)始進(jìn)行，試驗(yàn)地點(diǎn)為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)室。[LM]

1.2培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基為NN69，購(gòu)于北京酷來(lái)搏科技有限公司，添加蔗糖20g/L、瓊脂5g/L，調(diào)整pH值至5.7。其他試劑均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。本試驗(yàn)光照強(qiáng)度為100μmol/（m2·s），光周期為16h—8h（光照—黑暗），溫度為（25±2）℃。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1外植體消毒

將采集到的金陵丹楓當(dāng)年生新鮮枝條剪去葉片，切取約3cm的帶芽莖段，用洗潔劑清洗，自來(lái)水流水沖洗1h。使用75%乙醇和0.1%氯化汞組合消毒不同時(shí)間，同時(shí)添加0.2%Tween-20，消毒完畢后使用無(wú)菌水漂洗3次，在無(wú)菌濾紙上晾干表面水分后，接種到NN69培養(yǎng)基中，每瓶接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)3次。隨時(shí)觀察其污染率，防止交叉感染，篩選最佳外植體消毒時(shí)間。

1.3.2啟動(dòng)培養(yǎng)

將上述獲得的無(wú)菌外植體分別接種到含有不同生長(zhǎng)素（IAA、IBA、NAA、6-BA和TDZ）不同濃度配比的NN69培養(yǎng)基中（表2），培養(yǎng)45d后，統(tǒng)計(jì)腋芽誘導(dǎo)率，觀察腋芽萌動(dòng)及后續(xù)生長(zhǎng)狀況。每個(gè)處理重復(fù)3次，篩選最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基。

1.3.3增殖培養(yǎng)

將生長(zhǎng)狀況良好、長(zhǎng)約1cm的腋芽剪下，放入含有不同濃度的細(xì)胞分裂素（6-BA和KT）和生長(zhǎng)素（IBA和NAA）配比的NN69培養(yǎng)基中，培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)平均增殖系數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3次，篩選最佳增殖培養(yǎng)基。

1.3.4生根培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)獲得的約1cm叢生芽分別剪下，轉(zhuǎn)移到含有不同濃度生長(zhǎng)素IAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L）、IBA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L）配比的NN69培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)及平均根長(zhǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次，篩選獲得最佳生根培養(yǎng)基。

1.3.5羧芐青霉素（Carb）抗性試驗(yàn)

選取增殖培養(yǎng)基上獲得的生長(zhǎng)狀況良好的健壯不定芽接種到含有不同濃度Carb（0、100、200、300、400、500、600、700mg/L）的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率及平均增殖系數(shù)，同時(shí)觀察不定芽的成活率及生長(zhǎng)狀況。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)處理50個(gè)芽。

1.3.6潮霉素（Hyg）抗性試驗(yàn)

選取增殖培養(yǎng)基上獲得的生長(zhǎng)狀況良好的健壯不定芽接種到含有不同濃度Hyg（0、2.5、5.0、7.5、10、12.5、15.0、17.5mg/L）的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增值率及增殖系數(shù)，同時(shí)觀察不定芽的成活率及生長(zhǎng)狀況。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)處理50個(gè)芽。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2016和SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理及分析，差異顯著性采用ANOVA分析，Duncans檢驗(yàn)（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒處理對(duì)外植體的影響

將田間采集的外植體莖段用不同的消毒時(shí)間進(jìn)行處理（表1）。[JP+1]金陵丹楓外植體使用75%乙醇消毒40s和0.1%氯化汞消毒20min的組合處理時(shí)，既能保證金陵丹楓外植體具有較低的污染率（17.6%），又能保持較高的腋芽萌發(fā)率（90.3%）。因此，選用該處理對(duì)金陵丹楓外植體消毒效果最佳。

2.2不同激素配比對(duì)外植體啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

將無(wú)菌外植體接種到不同激素配比的NN69培養(yǎng)基中，接種約10d后腋芽開(kāi)始萌動(dòng)，同時(shí)莖基部開(kāi)始形成愈傷組織。接種45d后統(tǒng)計(jì)腋芽誘導(dǎo)率（表2），在NN69培養(yǎng)基中添加單種激素對(duì)金陵丹楓外植體啟動(dòng)培養(yǎng)的影響顯著優(yōu)于同時(shí)添加多種激素。其中添加IBA濃度為0.1mg/L時(shí)，腋芽誘導(dǎo)率最高，為（90.6±3.1）%，腋芽生長(zhǎng)快且長(zhǎng)勢(shì)健壯。最終選擇該培養(yǎng)基為金陵丹楓最佳培養(yǎng)基。

2.3不同激素配比對(duì)芽增殖培養(yǎng)的影響

將無(wú)菌外植體在啟動(dòng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的腋芽剪下，放入不同激素濃度配比的NN69培養(yǎng)基中培養(yǎng)45d后，統(tǒng)計(jì)觀察腋芽平均增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=產(chǎn)生的叢生芽數(shù)/接種的腋芽數(shù)×100%）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，金陵丹楓腋芽在不同激素組合的增殖培養(yǎng)基中的平均增殖系數(shù)差異顯著。6-BA和IBA組合的平均增殖系數(shù)為3.1～3.6，TDZ和IBA組合的平均增殖系數(shù)為2.2～2.9，KT和IBA組合的平均增殖系數(shù)為6.2～8.3，明顯優(yōu)于其他激素組合。其中在添加0.4mg/LKT和0.1mg/LIBA的NN69培養(yǎng)基中腋芽的增殖系數(shù)最高，為8.3，顯著高于添加其他激素組合的培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的叢生芽狀態(tài)良好，長(zhǎng)勢(shì)健壯，利于進(jìn)行生根培養(yǎng)。

2.4不同濃度生長(zhǎng)素對(duì)生根的影響

將在增殖培養(yǎng)基上產(chǎn)生的叢生芽剪下，分別轉(zhuǎn)移到含有不同生長(zhǎng)素濃度的NN69培養(yǎng)基中，觀察統(tǒng)計(jì)不定芽的生根狀況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，金陵丹楓不定芽在添加不同生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中生根狀況差異顯著。在添加IAA的培養(yǎng)基上，生根率僅為55.9%～65.4%，平均根系量?jī)H為2.5～3.7，平均根長(zhǎng)僅為1.9～2.9cm。在添加IBA的培養(yǎng)基上，生根率顯著升高，為75.9%～95.6%，平均根系量為4.3～7.1條，平均根長(zhǎng)為3.0～3.9cm。在添加NAA的培養(yǎng)基上，生根率僅為67.8%～80.1%，平均根系量?jī)H為3.1～3.9條，平均根長(zhǎng)僅為2.3～2.9cm。不定芽在添加0.3mg/LIBA的培養(yǎng)基上，生根率最高，平均根系量和平均根長(zhǎng)最大，小苗長(zhǎng)勢(shì)最好（表4）。雞爪槭金陵丹楓叢生芽分化及生根情況見(jiàn)圖1。

2.5不同濃度的羧芐青霉素對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響

抗生素Carb可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)抑制叢生芽的誘導(dǎo)和增殖。隨著Carb濃度的增高，金陵丹楓叢生芽的誘導(dǎo)率和平均增殖系數(shù)顯著降低（表5），表明金陵丹楓叢生芽對(duì)Carb非常敏感。Carb濃度為700mg/L時(shí)，叢生芽誘導(dǎo)率僅為45.9%，且叢生芽基本停止增殖。

2.6不同濃度的潮霉素對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響

抗生素Hyg在遺傳轉(zhuǎn)化篩選過(guò)程中起著重要作用。Hyg也會(huì)抑制叢生芽的誘導(dǎo)和增殖，甚至?xí)?dǎo)致叢生芽白化死亡。Hyg對(duì)金陵丹楓叢生芽的生長(zhǎng)影響尤為明顯。當(dāng)Hyg濃度為10.0mg/L時(shí)，叢生芽的誘導(dǎo)率僅為20.3%，且叢生芽幾乎不增殖。當(dāng)Hyg濃度為12.5mg/L時(shí)，叢生芽不被誘導(dǎo)，且20.6%叢生芽出現(xiàn)白化死亡現(xiàn)象（表6）。

3結(jié)論與討論

組培再生技術(shù)具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)大、繁殖后代整齊一致等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種植物種苗繁育中。但是由于物種之間的差異，許多木本植物仍面臨組培再生困難的問(wèn)題。本研究以雞爪槭金陵丹楓為研究對(duì)象，建立了組培再生技術(shù)體系。以當(dāng)年生枝條為外植體，75%乙醇消毒40s，0.1%氯化汞消毒20min，流水沖洗后接種到NN69+0.1mg/LIBA的培養(yǎng)基上進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng)，誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。將萌發(fā)的腋芽切下，接種到NN69+0.4mg/LKTNN69+0.1mg/LIBA的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽。從產(chǎn)生的叢生芽切下的單個(gè)不定芽接種到NN69+0.3mg/LIBA的培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，長(zhǎng)成帶根小苗后可以移栽到穴盤(pán)。通過(guò)金陵丹楓不定芽對(duì)羧芐青霉素和潮霉素的敏感性的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Carb濃度為700mg/L或者Hyg濃度為10mg/L時(shí)，叢生芽基本停止增殖。

進(jìn)行組培再生體系的建立第1步是要解決外植體的污染問(wèn)題。由于本試驗(yàn)的外植體取自大田的當(dāng)年生枝條，附生菌較多，故采用了75%乙醇消毒和0.1%氯化汞消毒組合消毒的方式，這與前人的研究結(jié)果[3]一致。在組培過(guò)程中，常用的基本培養(yǎng)基有MS[7]、WPM[8]、NN69[9]、B5[10]、White[11]等，不同基本培養(yǎng)基對(duì)槭屬植物再生體系的建立具有重要影響。雞爪槭赤楓使用了MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基[4]，日本紅楓青龍使用了WPM培養(yǎng)基[5]，雞爪槭金陵黃楓使用了NN69培養(yǎng)基[3]。本試驗(yàn)也選擇NN69作為基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是組培再生體系建立過(guò)程中不可或缺的物質(zhì)，其種類(lèi)、濃度和配比等是誘導(dǎo)腋芽生長(zhǎng)、腋芽增殖和不定芽生根的關(guān)鍵因子[12-13]。雞爪槭赤楓[4]、復(fù)葉槭[13]、紅翅槭[14]和尖尾槭[15]均采用了6-BA和IAA的組合實(shí)現(xiàn)了腋芽的增殖。雞爪槭金陵黃楓利用TDZ和NAA組合使用時(shí)，腋芽增殖系數(shù)最高[3]。日本紅楓青龍?jiān)赥DZ和IBA組合中增殖最快[5]。這說(shuō)明槭屬植物對(duì)激素種類(lèi)和濃度的感知具有較大差異，不同基因型的槭屬植物需要不同激素濃度和配比。

羧芐青霉素對(duì)根癌農(nóng)桿菌具有很好的抑制作用，但是高濃度的羧芐青霉素會(huì)抑制不定芽的生長(zhǎng)和增殖，濃度過(guò)低又不足以抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)。在貢菊葉片誘導(dǎo)不定芽的過(guò)程中，當(dāng)羧芐青霉素為250mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)不受影響[16]。藍(lán)莓與樹(shù)莓在分化階段羧芐青霉素的臨界值為200～300mg/kg[17]。金陵丹楓不定芽對(duì)羧芐青霉素的臨界值則為300～400mg/L。在轉(zhuǎn)基因體系建立過(guò)程中，潮霉素作為抗性篩選標(biāo)記具有重要作用。潮霉素濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡，嚴(yán)重抑制植株生長(zhǎng)。不同物種對(duì)潮霉素的敏感性差異巨大。巨霸楊對(duì)潮霉素臨界濃度為4～6mg/L[18]。甘蔗在愈傷組織形成過(guò)程中，潮霉素的篩選濃度為30mg/L[19]。[JP3]金陵丹楓不定芽對(duì)潮霉素較為敏感，潮霉素濃度為2.5mg/L時(shí)，已經(jīng)影響叢生芽的誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)。

本研究建立了雞爪槭金陵丹楓組培再生體系，為大量工廠化育苗提供了技術(shù)支撐;并且開(kāi)展了不定芽對(duì)羧芐青霉素和潮霉素的抗性試驗(yàn)，篩選出了臨界濃度，以期為金陵丹楓遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化提供參考，同時(shí)為進(jìn)一步目的基因?qū)牒头肿舆z傳育種改良奠定了基礎(chǔ)。

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