羽衣甘藍(lán)下胚軸農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

高航高玉亮李葵花

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，龍井 133400）

羽衣甘藍(lán)下胚軸農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

高航1高玉亮2李葵花1

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，龍井 133400）

以紅鷗羽衣甘藍(lán)下胚軸為試材，首先優(yōu)化了不定芽分化體系，其次探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中農(nóng)桿菌侵染濃度、侵染時(shí)間對(duì)不定芽分化率的影響及不定芽分化和生根過(guò)程中潮霉素B篩選壓力，最后對(duì)抗性植株進(jìn)行了潮霉素B篩選基因的PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，在MS + 6-BA 5.0 mg/L+AgNO39.0 mg/L培養(yǎng)基中不定芽分化率最高，為84.17%；農(nóng)桿菌侵染濃度OD600值為0.5、侵染5 min時(shí)利于遺傳轉(zhuǎn)化，分化率為69.17%；不定芽分化和生根過(guò)程中潮霉素B篩選壓力分別為4.0 mg/L和30.0 mg/L；潮霉素B篩選基因的PCR鑒定結(jié)果，在預(yù)期的602 bp處出現(xiàn)了條帶，初步證明潮霉素B篩選基因已整合到羽衣甘藍(lán)基因組中。

羽衣甘藍(lán)；農(nóng)桿菌侵染效率；潮霉素篩選壓力濃度

羽衣甘藍(lán)（Brassica oleracea var. acephala），屬十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的變種，轉(zhuǎn)色后心葉色彩豐富艷麗。相對(duì)于其他觀(guān)賞植物，羽衣甘藍(lán)耐寒性強(qiáng)，在我國(guó)北方地區(qū)作為秋冬觀(guān)賞花卉進(jìn)行栽培，但因其品種耐寒性應(yīng)用區(qū)域較窄，若在東北寒冷地區(qū)廣泛應(yīng)用，必須提高抗寒性。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法能有效轉(zhuǎn)入目的基因于植物基因組中，縮短育種年限，提高育種效率，且轉(zhuǎn)化的外源目的基因拷貝數(shù)低、穩(wěn)定，因而廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中，但其前提條件是必須建立高效的再生體系。

關(guān)于羽衣甘藍(lán)的再分化研究較多［1-4］，但有關(guān)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中受體材料再分化對(duì)農(nóng)桿菌及篩選劑敏感度影響的研究較少。徐勤青等［5］認(rèn)為農(nóng)桿菌濃度和篩選劑劑量等影響著植物材料的遺傳轉(zhuǎn)化效率，具有較高再分化率并不代表其遺傳轉(zhuǎn)化效率高；苑麗霞等［6］的研究表明，農(nóng)桿菌濃度和侵染時(shí)間影響抗性芽分化率。本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上，以紅鷗羽衣甘藍(lán)下胚軸為試材，優(yōu)化不定芽再分化條件，篩選適合侵染的農(nóng)桿菌濃度、侵染時(shí)間及不定芽分化和生根過(guò)程中篩選劑潮霉素B的篩選壓力，利用PCR方法驗(yàn)證篩選基因的存在與否，旨在為建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)羽衣甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 將紅鷗羽衣甘藍(lán)種子（購(gòu)自花卉市場(chǎng)）用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，滅菌水沖洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干水分，按10粒/瓶播種于B5培養(yǎng)基。25℃、黑暗條件下萌發(fā)后，轉(zhuǎn)移至25℃，2 000 lx，16 h/d光照條件下，培養(yǎng)7 d，切取1.0 cm左右的下胚軸用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.1.2 農(nóng)桿菌菌液濃度的配置 含PH7WG2D（攜帶潮霉素B篩選基因）載體的LBA4404農(nóng)桿菌菌株用于侵染試驗(yàn)。挑取農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于28℃，YEB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后，在6 000 r/min下離心5 min，收集菌體。用滅菌MS液體培養(yǎng)基重懸，配置OD600值為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9的不同菌液濃度。

1.1.3 培養(yǎng)基的組成 不定芽分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 5.0 mg/L + AgNO 9.0 mg/L；共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+36-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L；抑菌分化培養(yǎng)基：MS + 6-BA 5.0 mg/L + AgNO 9.0 mg/L+羧芐霉素5003mg/L；篩選分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 5.0 mg/L+AgNO39.0 mg/L+羧芐霉素500 mg/L+潮霉素B 4 mg/L；生根培養(yǎng)基：1/2 MS；生根篩選培養(yǎng)基：1/2 MS+潮霉素B 30 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 羽衣甘藍(lán)下胚軸不定芽分化體系的優(yōu)化 將下胚軸置于添加不同濃度6-BA和AgNO3的MS培養(yǎng)基中（表1），每組合處理40個(gè)下胚軸，觀(guān)察并計(jì)算不定芽分化率。

不定芽分化率（%）=分化不定芽的外植體數(shù)量/總外植體數(shù)量×100 %

1.2.2 農(nóng)桿菌侵染濃度（OD600值）和侵染時(shí)間對(duì)不定芽分化的影響 利用不同濃度的農(nóng)桿菌菌液（OD600值為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9）侵染外植體5 min；利用OD600值為0.5的菌液侵染外植體1、3、5、7和9 min后，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)接于抑菌分化培養(yǎng)基中，觀(guān)察并調(diào)查受體材料的農(nóng)桿菌感染致死率和不定芽分化率。

致死率（%）=過(guò)度污染農(nóng)桿菌的外植體數(shù)量/總外植體數(shù)量×100%

1.2.3 潮霉素B篩選壓力的確定 下胚軸外植體置于含有不同濃度潮霉素B（0、2.0、4.0、6.0和8.0 mg/L）的篩選分化培養(yǎng)基上，篩選不定芽分化率接近于對(duì)照不定芽分化率的半致死濃度。

將不定芽分化培養(yǎng)基中分化的2.0 cm左右的不定芽繼代于1/2 MS +潮霉素B（0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mg/L）的生根篩選培養(yǎng)基中，篩選生根率接近于對(duì)照生根率的半致死濃度。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化 采用OD600=0.5的農(nóng)桿菌菌液侵染下胚軸5 min后，在共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)移至篩選分化培養(yǎng)基中，當(dāng)抗性芽生長(zhǎng)至2.0 cm左右時(shí)，繼代于生根篩選培養(yǎng)基20 d，之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基，其植株用于潮霉素B篩選基因的PCR分子檢測(cè)。

上述試驗(yàn)均在25℃，2 000 lx，16 h/d光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理采用40個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.2.5 潮霉素B基因分子檢測(cè) CTAB法提取抗性植株葉片總DNA，以潮霉素B特異引物（上游引物：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'；下游引物：5'-GCGAAGAATCTCGTGCTTTC-3'，上海生工合成）進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 下胚軸不定芽分化體系的優(yōu)化及分化過(guò)程中潮霉素B篩選壓力的確定

羽衣甘藍(lán)下胚軸的再分化體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA和AgNO3濃度增加，分化率越來(lái)越高（表1），其最高臨界濃度分別為5.0 mg/L和9.0 mg/L。在該條件下，下胚軸外植體經(jīng)培養(yǎng)3-4周，就可分化出不定芽，分化率最高，達(dá)84.17%，且每個(gè)外植體能夠產(chǎn)生4個(gè)左右的不定芽（圖1），為誘導(dǎo)下胚軸不定芽的最適條件。另外，AgNO3的濃度高于9.0 mg/L時(shí)，不定芽的分化率雖高，但出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

圖1 不定芽分化培養(yǎng)基的下胚軸不定芽分化

潮霉素B濃度對(duì)誘導(dǎo)外植體不定芽分化的影響較大（結(jié)果未列出）。當(dāng)潮霉素B濃度為4.0 mg/L時(shí)，不定芽的分化率為41.24%，接近于半致死濃度，確定4.0 mg/L為篩選分化濃度。在篩選分化培養(yǎng)基上分化的外植體可產(chǎn)生大量淡黃色愈傷組織，部分愈傷組織可分化出不定芽；部分愈傷組織只分化出無(wú)生長(zhǎng)點(diǎn)的葉片。另外，接近于50%的下胚軸外植體未形成愈傷組織，發(fā)黑、褐化，最終枯死（圖2）。

圖2 篩選分化培養(yǎng)基（含羧芐霉素500 mg/L）的下胚軸不定芽分化

2.2 農(nóng)桿菌濃度（OD值）和侵染時(shí)間對(duì)不定芽分化率的影響

不同農(nóng)桿菌濃度和侵染時(shí)間對(duì)受體材料的致死率和不定芽分化率的影響（表2和表3）表明，保持較高不定芽分化率的前提下，OD600值0.5的侵染濃度和5 min的侵染時(shí)間是以較高侵染濃度來(lái)盡量延長(zhǎng)侵染時(shí)間的最佳農(nóng)桿菌侵染條件，其分化率為69.17%。濃度過(guò)大或侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成農(nóng)桿菌感染過(guò)度而增加受體材料死亡率，從而大幅度降低不定芽分化率，濃度過(guò)小或侵染時(shí)間過(guò)短，會(huì)降低農(nóng)桿菌的侵染機(jī)率而影響遺傳效果。

2.3 生根過(guò)程中潮霉素B篩選壓力的確定及抗性植株的獲得

潮霉素B濃度對(duì)羽衣甘藍(lán)小芽生根率和生長(zhǎng)勢(shì)的影響較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（數(shù)據(jù)未列出），隨著潮霉素B濃度的增加，隨著小芽的生根率減少其生長(zhǎng)勢(shì)也越來(lái)越弱。當(dāng)潮霉素B濃度為20.0 mg/L時(shí)，小芽均能產(chǎn)生白色正常的根，存活率達(dá)90%以上；當(dāng)潮霉素B濃度為50.0 mg/L時(shí)，所有小芽不能生根且干枯而死；當(dāng)潮霉素B濃度為30.0 mg/L時(shí)，45%小芽可產(chǎn)生白色健壯的根，植株葉片擴(kuò)展，呈淡綠色，植株生長(zhǎng)良好；55%小芽不產(chǎn)生根或產(chǎn)生短小的根，葉片窄小，呈暗紫色或濃綠色，且莖不伸長(zhǎng)，整個(gè)植株停止生長(zhǎng)，最終枯死（圖3）。因此，選用30.0 mg/L的潮霉素B濃度作為生根篩選濃度。

將農(nóng)桿菌侵染之后分化的抗性小芽置于生根篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周的生長(zhǎng)情況。圖4顯示，一些抗性芽產(chǎn)生黃褐色的根，其植株葉片發(fā)黃，最終枯死；部分抗性芽，長(zhǎng)出較短的白色根，植株葉片深綠，長(zhǎng)勢(shì)緩慢。此時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)緩慢的小植株，繼代到生根培養(yǎng)基（不含潮霉素B）中，可獲得生長(zhǎng)良好的抗性植株。通過(guò)該方法獲得了3株抗性株系。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

PH7WG2D植物表達(dá)載體攜帶潮霉素B篩選基因，因此通過(guò)潮霉素B基因存在與否，可間接的判斷目的基因是否整合于抗性植株中。經(jīng)3個(gè)抗性株系潮霉素B的PCR鑒定結(jié)果（圖5）表明，均在602 bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小相符，初步判斷潮霉素B基因已經(jīng)整合到植物基因組中。

3 討論

在羽衣甘藍(lán)的離體再生中，6-BA和AgNO3具有至關(guān)重要的作用。趙秀樞［7］研究表明，當(dāng)6-BA濃度大于1.5 mg/L時(shí)，不定芽質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，玻璃化現(xiàn)象明顯，而本研究中6-BA濃度5.0 mg/L時(shí)，不定芽生成率最高，且無(wú)玻璃化現(xiàn)象；但當(dāng)AgNO3的濃度高于9.0 mg/L時(shí)出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，不定芽分化率也開(kāi)始出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明不同品種之間不定芽再分化條件具有較大的差異。另外，羽衣甘藍(lán)的再分化研究中，激素種類(lèi)和濃度可引起外植體的褐化現(xiàn)象，所以用AgNO3等乙烯抑制劑，防止外植體褐化是必要的［8，9］。

表1 6-BA與AgNO3不同組合對(duì)下胚軸不定芽分化率的影響

表2 農(nóng)桿菌濃度（OD600值）對(duì)下胚軸的致死率和不定芽分化率的影響

表3 侵染時(shí)間對(duì)下胚軸致死率和不定芽分化率的影響*

圖3 生根篩選培養(yǎng)基上的芽生長(zhǎng)狀態(tài)

圖4 生根篩選培養(yǎng)基上的擬轉(zhuǎn)基因抗性芽生長(zhǎng)狀態(tài)

圖5 潮霉素B基因PCR檢測(cè)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，選用合理的農(nóng)桿菌的侵染濃度和侵染時(shí)間非常重要。菌液濃度過(guò)大或感染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致外植體被農(nóng)桿菌侵染過(guò)度而致死；反之，會(huì)導(dǎo)致受體細(xì)胞未被感染而不能成功進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。同屬于蕓薹屬的甘藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，采用OD600為0.4-0.5時(shí)，侵染5-8 min［10］；OD600為0.35時(shí)，侵染5-10 min［11］；OD600為0.6時(shí)，侵染3-5 min［12］，其再分化效果最佳，表明根據(jù)外植體的狀態(tài)可以適當(dāng)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的侵染濃度及侵染時(shí)間。本試驗(yàn)在保證較高的不定芽分化率前提下，篩選較高農(nóng)桿菌侵染濃度（OD600值為0.5左右）及較長(zhǎng)侵染時(shí)間（5 min），從而獲得更有效的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

潮霉素B對(duì)谷子、煙草、甘蔗的不定芽分化均有著強(qiáng)烈的抑制作用［13-15］。本研究的敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，4.0 mg/L和30.0 mg/L分別為不定芽再分化和生根過(guò)程中最適合的篩選壓力。進(jìn)行羽衣甘藍(lán)下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，在含有4.0 mg/L的潮霉素B的篩選分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)抗性芽，再轉(zhuǎn)移至含有30.0 mg/L潮霉素B的生根篩選培養(yǎng)基中，進(jìn)一步篩選。該方法可盡量保證獲得的株系是潮霉素B抗性芽，大幅度減少篩選假陽(yáng)性株系的可能性。

4 結(jié)論

為提高羽衣甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化效率，以紅鷗品種的下胚軸為試材，遴選了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)過(guò)程中能夠保持較高分化率的載體篩選劑劑量及農(nóng)桿菌的侵染濃度和侵染時(shí)間。篩選了MS+6-BA 5.0 mg/L + AgNO39.0 mg/L為最佳不定芽分化培養(yǎng)基；確定了OD600為0.5、侵染時(shí)間5 min為最適合的農(nóng)桿菌的侵染條件；確定了不定芽分化和生根過(guò)程中潮霉素B濃度的半致死劑量分別為4.0 mg/L和30.0 mg/L；通過(guò)優(yōu)化條件獲得的抗性株系，經(jīng)PCR鑒定初步證明潮霉素B抗性基因已整合到羽衣甘藍(lán)基因組中。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of Agrobacterium-mediated Transformation System for Brassica oleracea var. acephala with Hypocotyls as Explants

Gao Hang1Gao Yuliang2Li Kuihua1
（1. Agricultural College of Yanbian University，Yanji 133002；2. Yanbian Agricultural Sciences Academy，Longjing 133400）

An efficient transformation method for kale（Brassica oleracea var. acephala）cultivar Hongou was developed using hypocotyls as explant tissues with the following 3 steps：firstly optimizing the differentiation system of adventitious buds；secondly investigating the effects of Agrobacterium infection concentration and time on differentiation rate and the selective concentration of Hygromicin B（Hyg）gene during differentiation and rooting of adventitious buds；finally verifying the selective gene Hyg in the resistant plants by PCR. The highest differentiation rate（84.17%）of adventitious buds was found on MS + 6-BA 5.0 mg/L + AgNO39.0 mg/L medium. An infection concentration OD600of Agrobacterium as 0.5 and infection time for 5 min were favorable for genetic transformation， and the differentiation rate was 69.17%. The selective concentration of Hyg during the differentiation and rooting of adventitious buds were 4.0 mg/L and 30.0 mg/L， respectively. Moreover，the amplified specific gene Hyg bands were observed at the expected 602 bp by PCR analysis， which preliminarily demonstrated that the screened gene Hyg was integrated into the B. oleracea var. acephala genome.

Brassica oleracea var. acephala；Agrobacterium infection efficiency；selective concentration of hygromycin B

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.017

2014-10-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260470），延邊大學(xué)啟動(dòng)金項(xiàng)目（2011800-601010018）

高航，女，碩士研究生，研究方向：園藝學(xué)；E-mail：1547493298@qq.com

李葵花，副教授，研究方向：園藝學(xué)；E-mail：khli@ybu.edu.cn