• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    犬α干擾素在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其抗病毒活性的測定

    2015-10-27 01:25:27李皓洋胡小元易詠竹楊鑫張志芳李軼女
    生物技術(shù)通報(bào) 2015年6期
    關(guān)鍵詞:桿狀病毒家蠶干擾素

    李皓洋胡小元易詠竹楊鑫張志芳李軼女

    (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京100081;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,鎮(zhèn)江 212018)

    犬α干擾素在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其抗病毒活性的測定

    李皓洋1胡小元1易詠竹2楊鑫1張志芳1李軼女1

    (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京100081;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,鎮(zhèn)江 212018)

    犬α干擾素(CaIFNα)在犬病防治過程中應(yīng)用廣泛。旨在開發(fā)一種高效的CaIFNα表達(dá)方法。首先按家蠶密碼子的偏好性對GenBank中的一個(gè)CaIFNα基因進(jìn)行了優(yōu)化與合成,將其克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393中,并與親本病毒BmBacmid共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)重組。得到的重組病毒用于感染家蠶幼蟲,收集發(fā)病幼蟲的蠶血淋巴用于CaIFNα檢測。采用細(xì)胞病變抑制法在MDCK-VSV*GFP系統(tǒng)中測定其抗病毒活性。結(jié)果顯示家蠶表達(dá)的CaIFNα能有效抑制VSV*GFP在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,其抗病毒活性不低于1.78×106U/mL。

    犬α干擾素;家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng);抗病毒活性檢測

    干擾素(Interferon,IFN)是一類具有抗病毒活|性、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和免疫調(diào)節(jié)作用等多種生理活性的細(xì)胞因子,在自然免疫以及適應(yīng)免疫中都發(fā)揮著重要作用。IFN于1957年由Isasscs等[1]在進(jìn)行流感病毒感染雞胚的實(shí)驗(yàn)中首先發(fā)現(xiàn),隨后逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。IFN因其抗病毒、抗腫瘤和抗寄生蟲等功效[2-4],一直被當(dāng)作一種廣譜性治療藥物使用。而天然干擾素的含量非常稀少,而且提取純化的成本高昂,極大地制約了其廣泛應(yīng)用。因此,應(yīng)用基因工程手段表達(dá)高活性的干擾素產(chǎn)品,一直以來都是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。

    隨著我國犬飼養(yǎng)量逐年升高,隨之而來的疾病問題也日趨嚴(yán)重??袢?、犬細(xì)小、犬瘟熱等病毒性疾病已經(jīng)成為制約犬飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展的主要疾病,并且時(shí)常引起人類感染,嚴(yán)重威脅人類健康和社會安全。CaIFN在多種犬病毒性疾病的防治過程中發(fā)揮了重要作用。CaIFN的研究開始于20世紀(jì)80年代,Himmler等[5]用人IFNα的探針從犬基因組中克隆出了CaIFNα的基因,并利用大腸桿菌對CaIFNα進(jìn)行了原核表達(dá),最后得到了抗病毒活性為3×105U/L的CaIFNα產(chǎn)物。這是對CaIFN研究的首次報(bào)道。1992年Devos等[6]用鼠的IFNγ探針從犬基因組中克隆出了CaIFNγ基因,并成功將CaIFNγ在中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)中進(jìn)行了表達(dá),得到了有抗病毒活性的CaIFNγ產(chǎn)物。之后,人們又利用基因工程手段在多種表達(dá)體系中對犬干擾素進(jìn)行了表達(dá),并且取得了一系列的表達(dá)產(chǎn)品用于犬類疾病的預(yù)防和治療[7,8]。

    CaIFN在多種犬類疾病的預(yù)防和治療過程中都發(fā)揮著重要作用。王紅等[9]給患病毒性腸炎的實(shí)驗(yàn)組病犬注射CaIFNα發(fā)現(xiàn),其發(fā)病癥狀明顯減輕,并且癥狀持續(xù)時(shí)間明顯縮短,說明CaIFNα在犬病毒性腸炎的治愈過程中發(fā)揮了重要作用。王忠海等[10]將CaIFN用作人用狂犬疫苗的佐劑,注射小鼠后發(fā)現(xiàn)CaIFN能誘導(dǎo)中和抗體更早、更多的產(chǎn)生,說明CaIFN在疫苗制備方面有極大的應(yīng)用潛力。與CaIFN的巨大應(yīng)用潛力相比,目前市場中的CaIFN制劑的供應(yīng)量卻略顯不足,一些犬類疾病,如犬過敏性皮膚炎[11]等仍用貓干擾素進(jìn)行治療。因此,簡單、高效、安全的CaIFN表達(dá)方法的研究具有重要價(jià)值。

    CaIFNα是治療犬病毒病的主要藥物,其主要作用原理是通過增加MHCⅠ類分子的表達(dá),從而增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞對其靶細(xì)胞的殺傷作用,同時(shí)增加自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的裂解潛能,使機(jī)體能有效地抵御外源病毒的感染[12]。利用基因工程手段表達(dá)CaIFNα具有可觀的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。本研究將CaIFNα在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),并在犬細(xì)胞系中檢測其抗病毒活性,以期開發(fā)一種高效的CaIFNα表達(dá)手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    大腸桿菌感受態(tài)Trans I由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。載體構(gòu)建過程中用到的限制性內(nèi)切酶購自Promega公司。昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(TC-100)購自AppliChem公司。哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基(高糖DMEM),胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。CaIFNα基因由南京金斯瑞生物科技有限公司優(yōu)化合成。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393、犬腎細(xì)胞(MDCK)、家蠶細(xì)胞(Bm-N)、ORF1629缺損的親本桿狀病毒BmBacmid(專利號:201110142492.4)和表達(dá)綠色熒光蛋白的水皰性口炎病毒(VSV *GFP)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 方法

    1.2.1 CaIFNα基因的優(yōu)化和合成 本研究選取GenBank中的一條CaIFNα基因序列(HQ680864.1),根據(jù)家蠶的密碼子偏好性對基因核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化改造,在不改變蛋白序列的前提下,優(yōu)化處理了可能影響蛋白表達(dá)與折疊的因素,如GC含量、mRNA的二級結(jié)構(gòu)等,以提高CaIFNα基因在家蠶體內(nèi)的表達(dá)效率。在優(yōu)化好的CaIFNα基因序列起始密碼子前添加了Kozak序列,以提高CaIFNα在真核表達(dá)體系中的表達(dá)效率。此外,為了方便后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn),在CaIFNα的5'末端和3'末端分別添加了的BamHⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)。CaIFNα序列由南京金斯瑞公司優(yōu)化合成,并連接到pUC57載體上,形成pUC57-CaIFNα。

    1.2.2 轉(zhuǎn)移載體pVL-CaIFNα的構(gòu)建 將pUC57-CaIFNα進(jìn)行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切處理,回收目的基因CaIFNα片段。將得到的CaIFNα與同樣用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切處理的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393連接,連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans I。挑取單菌落提取質(zhì)粒,并進(jìn)行酶切鑒定,選取含有目的基因的質(zhì)粒送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序,測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致的質(zhì)粒命名為pVL-CaIFNα。

    1.2.3 重組病毒的共轉(zhuǎn)染及篩選 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pVL-CaIFNα與線性化的親本病毒DNA共轉(zhuǎn)染Bm-N細(xì)胞,使其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重組[13]。共轉(zhuǎn)染后將Bm-N細(xì)胞置于27℃環(huán)境中培養(yǎng)6 h,棄上清,補(bǔ)加含10% FBS的TC-100培養(yǎng)基,在27℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)觀察約4-5 d,待細(xì)胞病變浮起后,收集上清液,得到重組病毒。將重組病毒液按105pfu/頭的劑量接種五齡起蠶,待家蠶發(fā)病后,收集蠶血淋巴,得到家蠶表達(dá)產(chǎn)物,-20℃保存。

    1.2.4 CaIFNα抗病毒活性的鑒定 采用細(xì)胞病變抑制法[14],利用MDCK-VSV*GFP系統(tǒng)檢測家蠶表達(dá)的CaIFNα的抗病毒活性。樣品以10倍稀釋度做梯度稀釋,共5個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)重復(fù)。每個(gè)細(xì)胞孔加入處理后的樣品100 μL,攻毒100TCID50。同時(shí)設(shè)置病毒對照組(只加病毒不加干擾素)和空白對照組(不加病毒和干擾素)。攻毒24 h后,觀察細(xì)胞病變情況,根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)量來評估細(xì)胞的病變水平。

    2 結(jié)果

    2.1 合成質(zhì)粒pUC57-CaIFNα的酶切鑒定

    對南京金斯瑞公司優(yōu)化合成的pUC57-CaIFNα質(zhì)粒,進(jìn)行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定。經(jīng)電泳分離后,出現(xiàn)了一條大小約為600 bp的條帶(圖1)。CaIFNα的基因?yàn)?64 bp,預(yù)期結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)測序分析表明CaIFNα序列合成無誤,可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

    圖1 合成質(zhì)粒pUC57-CaIFNα的酶切鑒定

    2.2 重組轉(zhuǎn)移載體pVL-CaIFNα的酶切鑒定

    目的基因CaIFNα片段與經(jīng)雙酶切pVL1393載體連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),挑取單菌落提取質(zhì)粒后,用BamHⅠ和XbaⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,經(jīng)電泳分離后,出現(xiàn)于預(yù)期結(jié)果大小相似的目的條帶(圖2)。將含有目的條帶的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,測序分析表明CaIFNα已正確連接到pVL-1393中。

    圖2 重組轉(zhuǎn)移載體pVL-CaIFNα的酶切鑒定

    2.3 CaIFNα抗病毒活性檢測

    利用細(xì)胞病變抑制法測定表達(dá)的CaIFNα的抗病毒活性,攻毒大約24 h后,觀察到空白對照組細(xì)胞生長狀態(tài)正常,無熒光出現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組加入高濃度干擾素的細(xì)胞孔病毒復(fù)制被完全抑制,無熒光(圖3-A),當(dāng)干擾素稀釋到105倍時(shí),部分細(xì)胞孔出現(xiàn)細(xì)胞病變,但病變程度仍明顯小于病毒對照組,說明該稀釋度下干擾素已無法完全抑制病毒復(fù)制,但仍有明顯的抑制作用(圖3-B),病毒對照組所有細(xì)胞孔都出現(xiàn)熒光(圖3-C)。出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞孔即記為細(xì)胞病變,記錄細(xì)胞病變情況(表1),統(tǒng)計(jì)病變孔與非病變孔的個(gè)數(shù),按照Reed-Muench法計(jì)算干擾素的效價(jià)。選取多次重復(fù)測定結(jié)果中的較有代表性的一次數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析,計(jì)算其效價(jià)至少可達(dá)1.78×106U/mL。

    3 討論

    隨著養(yǎng)犬業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大,犬類疾病對人類健康的影響也越來越嚴(yán)重。CaIFNα作為一種具有廣譜抗病毒、細(xì)菌和寄生蟲活性的生物制劑,在犬類疾病的預(yù)防與治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。CaIFNα的高效表達(dá)一直是生命科學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn),目前,CaIFNα已在多種表達(dá)體系內(nèi)得到表達(dá)。隨著外源蛋白表達(dá)技術(shù)越來越成熟,如何進(jìn)一步簡化生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本,提高外源蛋白的生物活性將是今后蛋白表達(dá)技術(shù)發(fā)展的方向。

    圖3 利用MDCK/VSV*GFP 系統(tǒng)檢測家蠶表達(dá)的CaIFNα的抗病毒活性

    表1 家蠶表達(dá)的CaIFNα抗病毒活性檢測

    大腸桿菌作為一種傳統(tǒng)的外源蛋白表達(dá)工具,因其遺傳背景清楚、培養(yǎng)周期短、目的基因表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)一直被廣泛使用。殷玉和等[15]合成了編碼CaIFNα的基因片段,在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后利用MDCK-VSV系統(tǒng)進(jìn)行了檢測,測定純化后CaIFNα蛋白的比活為3×107U/mg。畢赤酵母作為一種真核表達(dá)工具,具有翻譯后修飾的功能,能使表達(dá)的外源蛋白正常的進(jìn)行糖基化等修飾,有利于提高外源蛋白的活性,因此也常被用于干擾素的表達(dá)。王玉等[16]將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的CaIFNα基因在畢赤酵母內(nèi)表達(dá),得到最高活性為1.58 × 108U/mg的CaIFNα產(chǎn)品。但外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)常形成包涵體,不具備有效的生物活性,要獲得具有活性的蛋白質(zhì)需要經(jīng)過變性復(fù)性等一系列過程,操作復(fù)雜且成本高昂;在畢赤酵母中的表達(dá)也面臨復(fù)雜的純化過程,這不可避免地增加了干擾素的生產(chǎn)工序和生產(chǎn)成本。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種優(yōu)秀的真核表達(dá)系統(tǒng),具有高安全性,高表達(dá)量和良好的外源蛋白翻譯后加工修飾功能等優(yōu)點(diǎn),在高活性真核蛋白表達(dá)過程中被廣泛采用[17]。故本研究選用家蠶-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行CaIFNα的表達(dá)。

    由于不同物種中密碼子的使用存在偏好性,因此采用PCR法直接克隆的功能蛋白的DNA序列,在異源宿主體內(nèi)表達(dá)時(shí)經(jīng)常面臨蛋白表達(dá)量低,活性差等一系列問題。密碼子偏好性優(yōu)化是提高異源蛋白表達(dá)量的有效手段[18]。Zhou等[19]在利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)牛乳頭瘤病毒的衣殼蛋白時(shí),通過密碼子優(yōu)化,使表達(dá)量提高了1 000多倍。因此,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)NCBI中的CaIFN-α基因序列,按家蠶密碼子偏好性對其進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí),在優(yōu)化過程中去除了mRNA二級結(jié)構(gòu),重復(fù)序列等不利于蛋白表達(dá)的因素,然后采取化學(xué)合成法合成用于表達(dá)的完整的CaIFNα序列,以期使CaIFNα在家蠶細(xì)胞內(nèi)得到良好表達(dá)。

    在進(jìn)行CaIFNα抗病毒活性測定時(shí),本研究采用了重組VSV*GFP病毒,該病毒感染細(xì)胞后可以在細(xì)胞中復(fù)制,并產(chǎn)生綠色熒光蛋白,通過觀察熒光的有無即可確定細(xì)胞是否被病毒感染[20]。有效避免了用普通VSV測定干擾素活性時(shí)細(xì)胞病變不明顯,觀察結(jié)果偏差大的問題,大大提高了檢測的靈敏度與結(jié)果的可靠性。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),測得家蠶表達(dá)的CaIFNα抗病毒活性基本穩(wěn)定,抗病毒活性不低于1.78×106U/mL。

    4 結(jié)論

    本研究對犬α干擾素基因進(jìn)行合理的優(yōu)化設(shè)計(jì),并成功表達(dá)出具有良好抗病毒活性的CaIFNα,每毫升蠶血淋巴中CaIFNα的抗病毒活性不低于1.78×106U,為低成本、高活性的CaIFNα生物制劑的高效制備提供了一種有效途徑。

    [1] Isaacs A, Lindenmann J. Virus interference. I. The interferon[J]. Proc R Soc Lond B Biol Sci, 1957, 147(927):258-267.

    [2] 夏倫斌, 王新華, 連宏軍, 等. γ干擾素及其在動物疾病防控中的應(yīng)用[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2007, 28(5):74-78.

    [3] Nishikawa Y, Iwata A, Nagasawa H, et al. Comparison of the growth inhibitory effects of canine IFN-alpha, -beta and -gamma on canine cells infected with Neospora caninum tachyzoites[J]. J Vet Med Sci, 2001, 63(4):445-448.

    [4] Yasukawa K, Saito S, Kubo T, et al. Low-dose recombinant canine interferon-gamma for treatment of canine atopic dermatitis:an open randomized comparative trial of two doses[J]. Vet Dermatol,2010, 21(1):42-49.

    [5] Himmler A, Hauptmann R, Adolf GR, et al. Structure and expression in Escherichia coli of canine interferon-alpha genes[J]. J Interferon Res, 1987, 7(2):173-183.

    [6] Devos K, Duerinck F, Van Audenhove K, et al. Cloning and expression of the canine interferon-gamma gene[J]. J Interferon Res,1992, 12(2):95-102.

    [7] Zhao N, Yao H, Lan L, et al. Efficient production of canine interferonalpha in silkworm Bombyx mori by use of a BmNPV/Bac-to-Bac expression system[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(2):221-226.

    [8] Taira O, Watanugi I, Hagiwara Y, et al. Cloning and expression of canine interferon-alpha genes in Escherichia coli. [J]. J Vet Med Sci, 2005, 67(10):1059-1062.

    [9] 王紅. 犬α-干擾素的表達(dá)及其治療犬病毒性腸炎臨床療效觀察[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2009.

    [10] 王忠海. 干擾素在狂犬病疫苗中的佐劑效果研究[J]. 中國藥業(yè), 2009, 18(24):17-19.

    [11] Litzlbauer P, Weber K, Mueller RS. Oral and subcutaneous therapy of canine atopic dermatitis with recombinant feline interferon omega[J]. Cytokine, 2014, 66(1):54-59.

    [12] 鄭拓, 吳長德. 犬干擾素的研究進(jìn)展[J]. 中國獸醫(yī)雜志,2012, 48(1):77-79.

    [13] Li Z, Yi Y, Yin X, et al. Expression of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in silkworm-baculovirus expression system and its utilization as a subunit vaccine[J]. PLoS One, 2008, 3(5):e2273.

    [14] 李田田, 楊靈, 易詠竹, 等. 雞α干擾素在家蠶中的表達(dá)及抗病毒活性測定[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2014(3):171-176.

    [15] 殷玉和, 李瑩瑩, 劉新濤, 等. 犬α干擾素的原核表達(dá)及活性檢測[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2013, 44(7):69-72.

    [16] 王玉, 朱艷平, 郭霄峰. 犬干擾素α1基因的修飾及在畢赤酵母中的表達(dá)[J]. 中國生物制品學(xué)雜志:, 2011, 24(9):1064-1067.

    [17] Usami A, Suzuki T, Nagaya H, et al. Silkworm as a host of baculovirus expression[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2010, 11(3):246-250.

    [18] Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression[J]. Trends Biotechnol, 2004, 22(7):346-353.

    [19] Zhou J, Liu W, Peng S, et al. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability[J]. J Virol, 1999, 73(6):4972-4982.

    [20] 溫志遠(yuǎn), 葛金英, 胡森, 等. 表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白重組水皰性口炎病毒印第安納株的構(gòu)建[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007, 29(12):905-911.

    (責(zé)任編輯 李楠)

    Expression of Canine Interferon Alpha in Silkworm-baculovirus Expression System and the Antiviral Activity Assay

    Li Haoyang1Hu Xiaoyuan1Yi Yongzhu2Yang Xin1Zhang Zhifang1Li Yinü1
    (1. Biotechnology Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081;2. The Sericultural Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhenjiang 212018)

    Canine interferon alpha(CaIFNα)was widely used in the prophylaxis and cure of canine diseases. The purpose of this study is to develop an efficient method to express CaIFNα. A canine interferon alpha gene in GenBank was optimized according to the codon bias of silkworm and synthesized, and then cloned into the baculovirus transfer vector pVL1393 to construct the recombinant plasmid pVL-CaIFNα. The pVL-CaIFNα was co-transfected with the BmBacmid DNA into silkworm cells and after in vivo recombination. The recombinant virus was gathered and used to infect silkworm larvae. The hemolymph of infected larvae was collected for antiviral activity assay. The antiviral activity of expressed CaIFNα was examined on Madin-Darby canine kidney cells infected with the vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein(VSV*GFP). The result showed that CaIFNα expressed in silkworm can inhibit the multiplication of VSV*GFP and the antiviral activity was about 1.78×106U/mL.

    canine interferon alpha;silkworm-baculovirus expression system;antiviral activity assay

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.022

    2015-03-17

    國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863”計(jì)劃(2011AA100603),國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973”計(jì)劃(2012CB114600)

    李皓洋,男,碩士,研究方向:昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng);E-mail:815579279@qq.com

    李軼女,女,博士,副研究員,研究方向桿:桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng);E-mail:liyinv@caas.cn

    猜你喜歡
    桿狀病毒家蠶干擾素
    桿狀病毒載體滅活方法的研究進(jìn)展
    家蠶原原種“871”“872”種性變化分析
    南美白對蝦白斑綜合癥桿狀病毒病(WSSV)的危害及預(yù)防措施
    抗BmNPV家蠶新品種“川抗1號”的育成
    家蠶猝倒病的發(fā)生與防治
    《豬流行性腹瀉病毒N蛋白桿狀病毒表達(dá)與間接ELISA方法建立》圖版
    凡納濱對蝦對蝦桿狀病毒PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用
    α-干擾素聯(lián)合利巴韋林治療慢性丙型肝炎
    浙江省1973年引進(jìn)家蠶品種名
    霧化吸入γ干擾素對免疫低下肺炎的療效觀察
    在线观看一区二区三区激情| 亚洲人与动物交配视频| 日韩三级伦理在线观看| av在线播放精品| 韩国高清视频一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 青青草视频在线视频观看| 51国产日韩欧美| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产免费现黄频在线看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久韩国三级中文字幕| 2018国产大陆天天弄谢| 春色校园在线视频观看| 国产xxxxx性猛交| 国产精品.久久久| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 五月玫瑰六月丁香| 97人妻天天添夜夜摸| 在线观看一区二区三区激情| 成人毛片60女人毛片免费| 久久久久久伊人网av| 美女福利国产在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久久国产精品麻豆| 欧美日韩精品成人综合77777| 青春草亚洲视频在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品酒店卫生间| 欧美日韩视频精品一区| 日日爽夜夜爽网站| 久久久久久人妻| 国产欧美亚洲国产| 亚洲av成人精品一二三区| av国产精品久久久久影院| 啦啦啦啦在线视频资源| 在线天堂中文资源库| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 少妇精品久久久久久久| 男女免费视频国产| 国产精品人妻久久久影院| 午夜福利影视在线免费观看| 精品一区二区三卡| 视频在线观看一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产成人精品福利久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜福利视频在线观看免费| 国产熟女欧美一区二区| av片东京热男人的天堂| 国产 精品1| 在线观看免费视频网站a站| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美精品国产亚洲| 51国产日韩欧美| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产永久视频网站| 日本wwww免费看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲精品日韩在线中文字幕| av网站免费在线观看视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 全区人妻精品视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 在线天堂最新版资源| 男女下面插进去视频免费观看 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 97在线人人人人妻| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产探花极品一区二区| 国产成人精品在线电影| 午夜日本视频在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 街头女战士在线观看网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 一级黄片播放器| 欧美激情 高清一区二区三区| 2022亚洲国产成人精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲伊人色综图| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲综合色惰| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日韩av不卡免费在线播放| 搡老乐熟女国产| 久久久精品区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成人黄色视频免费在线看| 国产1区2区3区精品| 成年av动漫网址| 免费高清在线观看日韩| 夫妻午夜视频| 香蕉精品网在线| 女性生殖器流出的白浆| 精品国产一区二区久久| www日本在线高清视频| 日韩电影二区| 91国产中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 国产成人精品一,二区| 满18在线观看网站| 国产视频首页在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 免费av中文字幕在线| 韩国av在线不卡| 99re6热这里在线精品视频| 久久精品国产自在天天线| 美女内射精品一级片tv| 久热这里只有精品99| 亚洲av国产av综合av卡| 中文字幕av电影在线播放| 乱人伦中国视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲精品一区蜜桃| 男的添女的下面高潮视频| 精品一区在线观看国产| 亚洲国产最新在线播放| av在线app专区| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 天堂8中文在线网| 欧美成人午夜免费资源| 视频在线观看一区二区三区| 高清不卡的av网站| 久久这里有精品视频免费| 欧美日韩成人在线一区二区| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲性久久影院| 最新中文字幕久久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 熟女人妻精品中文字幕| 成人午夜精彩视频在线观看| av福利片在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日本午夜av视频| 99久久综合免费| 日本欧美视频一区| 一区在线观看完整版| 咕卡用的链子| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久亚洲精品成人影院| 视频中文字幕在线观看| 日本91视频免费播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产乱人偷精品视频| 成人毛片60女人毛片免费| 久久热在线av| 国产色婷婷99| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美人与性动交α欧美软件 | 高清不卡的av网站| 国产色婷婷99| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av不卡在线播放| 亚洲国产精品999| 少妇人妻 视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产在线一区二区三区精| 成人无遮挡网站| 26uuu在线亚洲综合色| 国产成人91sexporn| 91在线精品国自产拍蜜月| 蜜桃国产av成人99| 日日啪夜夜爽| 熟女av电影| 欧美精品一区二区免费开放| 综合色丁香网| 晚上一个人看的免费电影| 99国产精品免费福利视频| 成人毛片60女人毛片免费| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日韩伦理黄色片| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品三级大全| 国产av国产精品国产| 欧美精品亚洲一区二区| 免费黄网站久久成人精品| 精品视频人人做人人爽| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久99精品国语久久久| 各种免费的搞黄视频| 国产免费视频播放在线视频| 国产成人aa在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲成国产人片在线观看| 久久午夜福利片| 99久久综合免费| 日韩在线高清观看一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久这里只有精品19| 精品一区在线观看国产| 亚洲高清免费不卡视频| 丝袜在线中文字幕| 两个人免费观看高清视频| 久久国产精品大桥未久av| 观看av在线不卡| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久久久精品精品| a级毛片黄视频| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99视频精品全部免费 在线| av一本久久久久| 国产乱人偷精品视频| 国产黄色免费在线视频| 嫩草影院入口| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲,欧美精品.| 26uuu在线亚洲综合色| 欧美国产精品va在线观看不卡| 尾随美女入室| 日韩三级伦理在线观看| 久久久久久人人人人人| 日本黄大片高清| 成人影院久久| 一个人免费看片子| 26uuu在线亚洲综合色| www日本在线高清视频| 国产在线视频一区二区| 国产精品一区二区在线不卡| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产av精品麻豆| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 国产又爽黄色视频| 大香蕉久久成人网| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲精品乱久久久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 欧美成人午夜免费资源| 日本色播在线视频| a级毛色黄片| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 22中文网久久字幕| 一本大道久久a久久精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 如何舔出高潮| 国产极品天堂在线| a 毛片基地| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黄色怎么调成土黄色| 日韩电影二区| 777米奇影视久久| 久久久久久人妻| 欧美日韩成人在线一区二区| 97精品久久久久久久久久精品| 国产精品久久久久久久电影| 大片免费播放器 马上看| 伦精品一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 成人手机av| 亚洲精品日本国产第一区| 国产免费现黄频在线看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲在久久综合| 亚洲内射少妇av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品第二区| 国产精品久久久久久久电影| 日韩欧美精品免费久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 成人漫画全彩无遮挡| 国产色婷婷99| 在线观看三级黄色| 国产成人精品一,二区| 日本wwww免费看| 国产一级毛片在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 伊人亚洲综合成人网| 精品久久久精品久久久| 亚洲中文av在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久狼人影院| 国产亚洲欧美精品永久| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 国产国语露脸激情在线看| 另类精品久久| 这个男人来自地球电影免费观看 | 99久久综合免费| 免费看光身美女| 中文字幕最新亚洲高清| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 晚上一个人看的免费电影| 国产熟女欧美一区二区| 精品久久国产蜜桃| 国产精品99久久99久久久不卡 | 丝袜脚勾引网站| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 人妻人人澡人人爽人人| 精品国产一区二区三区四区第35| 超色免费av| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩视频在线欧美| 亚洲av国产av综合av卡| 久久久久久久精品精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产av码专区亚洲av| 大片电影免费在线观看免费| 97精品久久久久久久久久精品| 国产成人精品在线电影| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 大陆偷拍与自拍| 在线观看三级黄色| 九色亚洲精品在线播放| 少妇高潮的动态图| 七月丁香在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 五月开心婷婷网| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 伦理电影大哥的女人| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美3d第一页| 日本免费在线观看一区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 乱人伦中国视频| 男女免费视频国产| 欧美少妇被猛烈插入视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产一区二区激情短视频 | 久久久久久久久久人人人人人人| 日本wwww免费看| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲在久久综合| 日日撸夜夜添| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美最新免费一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 最新的欧美精品一区二区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久热这里只有精品99| 国产熟女午夜一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品亚洲成国产av| 欧美精品一区二区大全| 两个人看的免费小视频| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品第一国产精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产黄色免费在线视频| av在线播放精品| 青春草视频在线免费观看| av福利片在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 91精品三级在线观看| 一级毛片电影观看| 国产毛片在线视频| 国精品久久久久久国模美| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产色婷婷99| 午夜av观看不卡| 咕卡用的链子| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美bdsm另类| 大片免费播放器 马上看| 熟女av电影| 国产xxxxx性猛交| 亚洲国产日韩一区二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲精品日本国产第一区| 不卡视频在线观看欧美| 人人妻人人澡人人看| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品久久久久久精品古装| 精品酒店卫生间| 搡女人真爽免费视频火全软件| 午夜老司机福利剧场| 熟女av电影| 桃花免费在线播放| 国产亚洲一区二区精品| 色94色欧美一区二区| 亚洲内射少妇av| 男女午夜视频在线观看 | 美女xxoo啪啪120秒动态图| 伊人久久国产一区二区| 一区二区三区精品91| 曰老女人黄片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产一区二区三区综合在线观看 | 在现免费观看毛片| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 赤兔流量卡办理| 日韩三级伦理在线观看| 内地一区二区视频在线| 国产一级毛片在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲精品一二三| 亚洲av福利一区| videos熟女内射| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 观看av在线不卡| 国产亚洲一区二区精品| 伊人亚洲综合成人网| av电影中文网址| 男女免费视频国产| 三级国产精品片| 欧美日韩精品成人综合77777| 丝瓜视频免费看黄片| 成人国语在线视频| 国产av一区二区精品久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲中文av在线| 亚洲综合精品二区| 欧美精品一区二区大全| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日本色播在线视频| 精品亚洲成国产av| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产欧美亚洲国产| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久久久久人人人人人| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 1024视频免费在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产又爽黄色视频| 中国三级夫妇交换| 免费黄网站久久成人精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产av码专区亚洲av| 综合色丁香网| 尾随美女入室| 欧美少妇被猛烈插入视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| av免费在线看不卡| 18禁观看日本| 男人操女人黄网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久亚洲精品成人影院| 女性被躁到高潮视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久久久国产网址| 午夜免费鲁丝| 熟女av电影| 欧美精品av麻豆av| 久热这里只有精品99| 成人国产av品久久久| 五月开心婷婷网| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品国产av在线观看| 亚洲av福利一区| 国产免费又黄又爽又色| 桃花免费在线播放| 亚洲图色成人| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 中文欧美无线码| 国产精品一二三区在线看| freevideosex欧美| 一二三四在线观看免费中文在 | 伦理电影免费视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品三级大全| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日韩三级伦理在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 少妇的丰满在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 成人国产av品久久久| 免费av中文字幕在线| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲综合精品二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩av免费高清视频| 欧美人与善性xxx| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久久久久国产电影| 国产激情久久老熟女| 久久久久精品人妻al黑| 99久国产av精品国产电影| 中文欧美无线码| 午夜福利视频在线观看免费| 丰满迷人的少妇在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲欧洲国产日韩| 国产av一区二区精品久久| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美精品一区二区大全| 中文字幕免费在线视频6| xxx大片免费视频| 久久久久久久久久成人| 99久国产av精品国产电影| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 少妇人妻 视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 美女福利国产在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 九九爱精品视频在线观看| √禁漫天堂资源中文www| av有码第一页| 最近2019中文字幕mv第一页| 精品久久久久久电影网| 国产又色又爽无遮挡免| 咕卡用的链子| 91国产中文字幕| tube8黄色片| 视频中文字幕在线观看| 男女免费视频国产| 中文字幕亚洲精品专区| √禁漫天堂资源中文www| 国产免费现黄频在线看| 在线免费观看不下载黄p国产| 人人妻人人澡人人看| 午夜视频国产福利| 午夜91福利影院| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日本av手机在线免费观看| 久久99一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| √禁漫天堂资源中文www| 90打野战视频偷拍视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲精华国产精华液的使用体验| av电影中文网址| 香蕉国产在线看| 成人综合一区亚洲| 久久韩国三级中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 丝袜喷水一区| 看免费av毛片| 一级片免费观看大全| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美性感艳星| 男女免费视频国产| 自线自在国产av| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美xxⅹ黑人| 久久久久久久国产电影| 精品一区在线观看国产| 九九在线视频观看精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 一级a做视频免费观看| 免费高清在线观看日韩| 在线观看www视频免费| 欧美精品国产亚洲| 久久精品人人爽人人爽视色| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 五月玫瑰六月丁香| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产一区亚洲一区在线观看| 大香蕉久久网| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 成人国语在线视频| www.av在线官网国产| 九色亚洲精品在线播放| 十分钟在线观看高清视频www| 不卡视频在线观看欧美| 欧美精品亚洲一区二区| 女人精品久久久久毛片| 日本黄色日本黄色录像| 免费黄色在线免费观看| 各种免费的搞黄视频| 国产在线免费精品| 三级国产精品片| 国产成人精品婷婷| 亚洲av电影在线进入| 国产69精品久久久久777片| 2018国产大陆天天弄谢| 成人亚洲欧美一区二区av| 美女视频免费永久观看网站| 丰满乱子伦码专区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 免费观看在线日韩| 欧美成人午夜免费资源|